STUDI KERAGAMAN GENETIK KERANG DARAH (ANADARA

Download diserap oleh biota air melalui insang dan saluran pencernaan (Murtini et al. 2003 ). Berdasarkan kondisi dua wilayah perairan di atas, keran...
0 downloads 400 Views 903KB Size
Download PDF
Love PNG Images
STUDI KERAGAMAN GENETIK KERANG DARAH (Anadara granosa) BERDASARKAN MARKA MOLEKULER Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)

GITA KUSUMA RAHAYU

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

ABSTRAK GITA KUSUMA RAHAYU. Studi Keragaman Genetik Kerang Darah (Anadara granosa) Berdasarkan Marka Molekuler Cytochrome Oxidase Subunit I (COI). Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN dan NURLISA A BUTET. Kerang darah (Anadara granosa, Linneaus 1758) merupakan bivalvia kosmopolit yang hidup di dasar perairan dengan memakan partikel-partikel yang ada di sekitarnya (filter feeder) termasuk logam berat. Logam berat yang masuk ke dalam tubuh A. granosa dikhawatirkan dapat menyebabkan perubahan genetik sehingga menghasilkan keragaman genetik. Penelitian ini bertujuan menganalisis keragaman genetik kerang darah (A. granosa) asal Banten berdasarkan marka molekuler gen COI. DNA diekstraksi dari otot kaki A. granosa asal Bojonegara dan Panimbang,Banten. DNA total hasil ekstraksi dilanjutkan dengan amplifikasi dengan PCR dan sekuensing gen COI. Tiga sampel hasil amplifikasi berhasil disekunsing dan menghasilkan panjang 606 nt yang menunjukkan sedikit variasi (conserve). Gen COI A. granosa disejajarkan dengan beberapa gen COI spesies lain yaitu ingroup (Famili Arcidae) dan outgroup yang didapatkan dari GenBank. Tegillarca granosa, Anadara diluvii, Anadara crebricosata, Anadara vellicata, Anadara sativa, Anadara pilula, Diluvarca ferruginea, Scapharca globosa, Cucullaea labiata, Didimacar tenebrica, dan Glycymeris rotunda merupakan spesies yang digunakan dalam pensejajaran. Pensejajaran dilakukan dengan menggunakan sofware Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 4 (MEGA 4.0). Penelitian ini berhasil mengkarakterisasi gen COI A. granosa sepanjang 428 nt. Kontruksi pohon filogeni memperlihatkan pengelompokan yang jelas antara ingroup (A. granosa, A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa) dan outgroup (C. labiata, D. tenebrica, G. rotunda). A. granosa menempati nodus tersendiri dengan 17 situs nukleotida diagnostik sebagai penciri spesies. Kata kunci : A. granosa, kerang darah, COI, keragaman genetik

ABSTRACT GITA KUSUMA RAHAYU. Study of Genetic Diversity on Blood Cockle (Anadara granosa) using Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) as a Molecular Marker. Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and NURLISA A BUTET. Blood Cockle (Anadara granosa, Linneaus 1758) is a cosmopolitan bivalve inhabiting intertidal zone with sandy mud sediment. As a filter feeding organism, the blood cockle uptakes both organic and inorganis materials, including heavy metals. Heavy metal may cause genetic changes; consequently, those give rise to genetic diversity. This research is aimed at analyzing genetic variations based on Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) gene in blood cockle (A. granosa) from Banten coastal waters. DNA extraction procedure used CTAB (Chloroform Isoamil Alkohol) methods, followed by amplification using specific primers and sequencing. Sequencing product of A. granosa samples was 606 bp. A. granosa and other bivalve COI gene sequences were aligned. Bivalves from Family Arcidae such as Tegillarca granosa, Anadara diluvii, Anadara crebricosata, Anadara vellicata, Anadara sativa, Anadara pilula, Diluvarca ferruginea and Scapharca globosa were used as ingroup, while others such as Cucullaea labiata, Didimacar tenebrica, and Glycymeris rotunda were treated as outgroup. Those groups were acquired from GenBank. Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 4 (MEGA 4.0) program was applied for alignment procedure. Phylogenetic tree showed a distict cluster between ingroup (A. granosa, T. granosa, A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa) and outgroup (C. labiata, D. tenebrica, G. rotunda). There were 17 diagnostic nucleotide characterized A. granosa. Key words: A. granosa, blood cockle, COI, genetics diversity

STUDI KERAGAMAN GENETIK KERANG DARAH (Anadara granosa) BERDASARKAN MARKA MOLEKULER Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)

GITA KUSUMA RAHAYU

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Judul Nama NIM

: Studi Keragaman Genetik Kerang Darah (Anadara granosa) Berdasarkan Cytochrome Oxydase Subunit I (COI) : Gita Kusuma Rahayu : G34070103

Menyetujui, Pembimbing II

Pembimbing I

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA. NIP 19561102 198403 1 003

Ir. Nurlisa A. Butet, M.Sc. NIP 19651208 199011 2 001

Mengetahui,

Ketua Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S. NIP 19641002 198903 1 002

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala karunia dan rahmat-Nya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih untuk skripsi ini ialah Studi Keragaman Genetik Kerang Darah (Anadara granosa) berdasarkan Marka Molekuler Cytochrome Oxidase Subunit I (COI). Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2011 hingga Desember 2012 di Laboratorium Biologi Molekuler Hewan PPSHB (Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi) PAU Lt 3 dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor. Keberhasilan penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan saran dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA dan Ibu Ir. Nurlisa A. Butet, M.Sc. atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga tercinta (Papah, Mamah, dan Mas Agung) atas dukungan baik materi maupun dukungan moril. Terima kasih saya ucapkan pada Muhamad Irfan atas kebaikan dan kesetiaannya menemani serta membantu selama penelitian ini berlangsung. Tidak lupa saya ucapkan terima kasih pada para sahabat dan teman seperjuangan (Dini Herlina, Ratna Puspita, Dewi Murni P. S., Fery Santosa, dan Lydia Sari), keluarga besar Biologi angkatan 44 terutama Ririn, Aryo, Fahmi, Ikra N, Faizal, teman-teman asrama dan TPB (Ruri, Yoshita, Astry, Ezy, Ungki, Resty), keluarga besar Wisma Ar-riyadh serta Genggong (Roro, Tria, Boyke, Ganang, Willy, Denny, Lingga, Ade, Amel, Dimas, Thohir) atas segala dukungan semangat, kebersamaan, dan kenangan tak terlupakan. Karya ilmiah ini ditujukan pada semua kalangan, terutama mahasiswa biologi. Penulis menyadari karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu dibutuhkan kritik dan saran yang membangun. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor, Februari 2013

Gita Kusuma Rahayu

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 24 Oktober 1989 dari ayah Ir. Purwanto Budi Santoso dan ibu RD. Noeke Anggrainy. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 48 Jakarta Timur dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis memilih Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) Divisi Infokom 2008-2009, menjadi staff divisi Publikasi, Dokumentasi, dan Dekorasi kepanitiaan acara T n B going to Bandung tahun 2009, koordinator Acara Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB) dalam Kompetisi Sains SMA se- Indonesia (Pesta Sains Nasional tahun 2009), staff divisi Publikasi, Dokumentasi, dan Dekorasi acara Seminar dan Pelatihan PKM “Explore Your Creativity With PKM” tahun 2009, menjadi MC pada penyambutan Mahasiswa jurusan Biologi Universitas Negeri Yogyakarta dalam rangka studi banding tahun 2009, menjadi MC dan salah satu guide acara studi banding Mahasiswa jurusan Biologi Universitas Negeri Haluoleo tahun 2009, dan staff divisi acara di Grand Biodiversity tahun 2010. Penulis melakukan studi lapangan di Kawasan Wana Wisata Cangkuang Sukabumi dengan judul makalah “Keanekaragaman Tipe Pertahanan Serangga di Wana Wisata Cangkuang”. Penulis juga melakukan Praktik Lapangan di Taman Margasatwa Ragunan, Jakarta pada bulan JuliAgustus tahun 2010, dengan judul makalah “Konservasi Ex-Situ Monyet Jepang (Macaca fuscata) di Pusat Primata Schmutzer Ragunan”.

DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang ....................................................................................................................... 1 Tujuan ................................................................................................................................... 1 Waktu dan Tempat ................................................................................................................. 1 BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 2 Bahan .................................................................................................................................... 2 Metode................................................................................................................................... 2 Isolasi DNA ........................................................................................................................... 2 Ekstraksi DNA ....................................................................................................................... 2 Uji Kualitas DNA................................................................................................................... 2 Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Gen COI.............................................................. 2 Perunutan Produk PCR (Sekuensing) DNA A.granosa Gen COI ............................................. 3 Pensejajaran Runutan Nukleotida Gen COI A. granosa ........................................................... 3 Analisis Filogeni .................................................................................................................... 3 HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................................................... 3 Hasil ...................................................................................................................................... 3 DNA Total........................................................................................................................ 3 Amplifikasi dan Visualisasi DNA ..................................................................................... 3 Sekuens dan Alignment DNA A. granosa Gen COI............................................................ 4 Analisis Filogeni A. granosa Gen COI .............................................................................. 4 Pembahasan ........................................................................................................................... 5 Variabilitas gen COI ......................................................................................................... 6 SIMPULAN ................................................................................................................................ 6 SARAN ....................................................................................................................................... 7 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 7

DAFTAR GAMBAR 1

Hasil isolasi DNA total otot A. granosa pada gel agarosa pada gel agarosa 1.2%..........3

2

Hasil amplifikasi daerah COI pada gel agarosa 1.2%..........................................................4

3

Elektroforesis DNA hasil pre-test produk PCR pada gel agarosa 1%.................................4

4

Posi si segm en gen COI A nadara granosa (606 bp) berda sarkan gen COI Crassostrea gigas (GenBank: AF177226.1; 1525 bp).........................................................4

5

Konstruksi pohon filogeni berdasarkan runutan 428 nukleotida COI dengan metode Neighboor-Joining, bootstrapped 1000x, model p-distance...............................................6

DAFTAR LAMPIRAN 1

Lokasi pengambilan sampel A. granosa Bojonegara dan Panimbang.................................9

2

Pensejajaran berganda nukleotida (606 nt) pada gen COI A. granosa sampel B12, B86, dan L64.............................................................................………………………..10

3

Pensejajaran berganda nukleotida (428 nt) pada gen COI A. granosa dengan T. granosa A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa, C. labiata, D. tenebrica, dan G. rotunda (GenBank)............................................................13

4

Situs nukleotida diagnostik gen COI mitokondria A. granosa berdasarkan runutan 428 nt yang dibandingkan (tanpa T. granosa)…………………………………………………17

5

Perbandingan situs nukleotida diagnostik gen COI A3 (Anadara granosa) dengan nodus A1, A2, dan A3 berdasarkan runutan 428 nt yang dibandingkan.........…………........18

6

Matriks perbedaan rata-rata nukleotida berdasarkan metode pairwise distance daerah COI pada A. granosa, A. diluvii, A. crebricostata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa, C. labiata, D. tenebrica, dan G. rotunda......................................19

7

Hasil Blast n gen COI Anadara granosa (606 bp)

......................................20

1

PENDAHULUAN Latar Belakang Kerang darah (Anadara granosa, Linneaus 1758) adalah moluska bivalvia dari famili Arcidae, subfamili Anadarinae. Kerang darah hidup di dasar perairan pesisir seperti estuari, mangrove dan padang lamun dengan substrat pasir berlumpur. Sebagai hewan filter feeder, kerang dapat menyerap dan mengakumulasi sejumlah bahan organik dan bahan anorganik termasuk logam berat di dalam tubuhnya (Hutagaol dan Pringgenies 2007). Penyebaran kerang darah di dunia meliputi Samudera Hindia dan Samudera Pasifik (Indo-Pasific) dari Afrika Timur hingga Polinesia, sebelah utara Jepang, sebelah utara dan timur Australia (FAO Fisheries & Aquaculture 2012). Kerang darah di Indonesia banyak ditemukan di pantai timur Sumatera, Pantai Sulawesi, sepanjang pantai utara Pulau Jawa, sebelah utara Pulau Timor, Pulau Lombok, Teluk Bima, dan Selat Buton. Terlihat dari sebarannya, kerang darah merupakan hewan yang adaptif terhadap lingkungan. Kerang darah merupakan kerang yang berpotensi ekonomis karena merupakan sumber protein dan mineral. Produksi kerang darah di Indonesia dari tahun 2000 hingga 2010 mengalami kenaikan sebesar 5.18% dengan produksi tertinggi pada tahun 2004 yaitu 64.498 ton (DJPT 2011). Salah satu wilayah Indonesia potensial bagi perkembangan hidup kerang darah adalah perairan pesisir Banten seperti Bojonegara dan Panimbang. Bojonegara merupakan daerah perairan yang terletak di Teluk Banten, Serang. Kedalaman mulai 4 hingga 11 meter dengan tipe substrat terdiri dari pasir, debu dan liat. Perairan lautnya mengandung Hg 0,05 mg/L, Cd 0,064 mg/L dan Pb 0,153 mg/L (Jalius et al. 2008). Hal ini berkaitan dengan semakin banyak industri besar yang berdiri di sekitar pesisir pantai Bojonegara. Suhu di permukaan dan dasar perairan berkisar antara 29-32ºC dan 27.5-32ºC. Panimbang terletak di Teluk Lada, Banten dengan tipe substrat pasir dan tanah liat, juga merupakan salah satu daerah penangkapan hasil laut. Perairannya telah mengalami pencemaran yang berasal dari logam berat yaitu Hg 0,09 mg/L, Pb 0,015 mg/L dan Cu 0,0276 mg/L (Muawanah et al. 2005). Pencemaran berasal dari limbah domestik dan industri.

Logam berat merupakan limbah yang paling berbahaya, karena umumnya bersifat toksik (racun). Logam-logam berat ini diserap oleh biota air melalui insang dan saluran pencernaan (Murtini et al. 2003). Berdasarkan kondisi dua wilayah perairan di atas, kerang darah sebagai filter feeder yang hidup di kedua perairan tersebut diduga telah terkontaminasi. Sumber logam berat di Bojonegara dan Panimbang berasal dari limbah domestik dan industri. Limbah industri banyak mengandung senyawa karsinogen yang dapat menginduksi kanker karena bersifat mutagen, yaitu menyebabkan mutasi, yang dapat mengubah susunan DNA. Berdasarkan hal tersebut, dikhawatirkan logam berat dapat menyebabkan perubahan terhadap kerang darah secara genetik dan menghasilkan keragaman genetik. Salah satu cara untuk memastikan suatu spesies tidak mengalami perubahan secara genetik adalah dengan menggunakan COI (Cytochrome Oxydase subunit I). COI termasuk DNA mitokondria hewan yang merupakan daerah pengkode protein. Beberapa den yang terdapat di dalam mitokondria merupakan gen yang berevolusi sangat cepat sehingga dapat digunakan untuk melacak kejadian yang relatif baru. Namun, COI pada mitokondria merupakan gen yang berevolusi sangat lambat (Solihin 1994), sehingga dapat digunakan sebagai DNA barcoding karena sedikit sekali delesi dan insersi dalam sekuennya, serta variasi juga sedikit (Hebert et al. 2003). DNA barcoding memberikan metode yang efisien untuk identifikasi tingkat spesies dan berperan dalam taksonomi penelitian keanekaragaman hayati (Hajibabaei et al. 2007) .

Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman genetik kerang darah (Anadara granosa) yang berasal dari perairan pesisir Banten berdasarkan marka molekuler gen COI.

Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2011 hingga Desember 2012 di Laboratorium Biologi Molekuler Hewan, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Gedung PAU Lantai 3 dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.

2

BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan berupa otot kaki kerang darah (Anadara granosa). Sampel kerang darah diperoleh dari dua tempat berbeda, yaitu kawasan pantai Panimbang dan Bojonegara, Banten (Lampiran 1). Jumlah sampel dari Bojonegara dan Panimbang masing-masing 71 sampel dan 53 sampel. Metode Metode yang digunakan adalah isolasi DNA, ekstraksi DNA, uji kualitas DNA, amplifikasi DNA dengan metoda PCR dan visualisasi Fragmen DNA gen COI secara kualitatif dengan elektroforesis, sekuensi amplikon yang didapat, pensejajaran runutan nukleotida gen COI, serta analisis filogeni. Isolasi DNA Isolasi DNA menggunakan metode Solihin (1997) dengan beberapa modifikasi. Isolasi dilakukan dengan prosedur cepat yaitu tanpa sodium buffer. Sebelum dilakukan isolasi, hal pertama yang dilakukan adalah inkubasi sampel selama kurang lebih satu bulan. Sampel berupa otot kaki kerang darah dengan berat 25 mg yang telah diambil dari cangkangnya, dibersihkan kotorannya, kemudian dicuci bersih dan di cacah-cacah hingga halus. Hasil cacahan halus tersebut di masukkan ke dalam microtube 1,5 µl dan direndam dalam larutan low Tris-EDTA (TE) kemudian diinkubasikan pada suhu 38⁰C. Langkah selanjutnya, otot digerus dan ditambahkan CTAB buffer sebanyak 500 μl – 800 µl, dan 10 μl Proteinase K kemudian diinkubasi di water bath pada suhu 55⁰C selama 24 jam. Ekstraksi DNA Sampel yang telah diinkubasi semalaman ditambahkan 400 μl larutan Phenol, 400 μl CIAA (Chloroform Isoamil Alkohol), dan 40 μl NaCl kemudian dikocok manual selama 20 menit. Selanjutnya, sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan (terdapat di lapisan atas) dipindahkan ke microtube baru, ditambah 500 μl CIAA (Chloroform Isoamil Alkohol), dikocok kembali selama 20 menit, dan kembali disentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit. Setelah supernatan dipindahkan ke microtube baru, kemudian ditambahkan ethanol absolute 2x volume (± 400 μl)

kemudian disimpan di freezer semalaman (24 jam). Selanjutnya, sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit, dan akan terlihat endapan berwarna putih yang merupakan DNA. Ethanol absolute dibuang, diganti dengan ethanol 70% sebanyak ± 400 μl dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. DNA (endapan putih) dikeringudarakan selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 30 μl larutan TE RNAse (jumlahnya tergantung banyaknya endapan), diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 15 menit kemudian disimpan di freezer. Uji Kualitas DNA Kualitas DNA diuji dengan dimigrasikan pada gel agarosa 1,2% dengan menggunakan buffer 1xTAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA). Gel agarosa diwarnai dengan ethidium bromide (0,5 g/ml), diamati, dan difoto dibawah sinar UV (Geldoc Ultra Violet, 400nm). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Gen COI Amplifikasi dan visualisasi fragmen DNA dilakukan dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan primer forward AGF (5’- AGCCGGCAGGTCTTT ATGTAGAAGTTAG -3’) dan reverse AGR (5’-TAAACCTCCGGGTGTCCAAAAAACCA -3’). Pada PCR terdapat tiga tahapan inkubasi yang diulangi sebanyak 35 kali. Satu ulangan dari ketiga tahap ini disebut silkus. Sebelum proses PCR dimulai, dilakukan predenaturasi, yaitu pemanasan pada suhu 94⁰C selama 3 menit. Proses satu siklus terdiri dari tahap pertama yang disebut denaturasi, yaitu pemisahan untai molekul DNA dengan pemanasan pada suhu 94⁰C selama 45 detik sehingga menghasilkan dua untai DNA rantai tunggal; tahap kedua disebut annealing atau penempelan dimana dua primer akan berhibridisasi menjadi sekuens komplementer pada untai tunggal DNA. Suhu penempelan yaitu pada 59⁰C selama 1 menit 30 detik; tahap ketiga adalah elongasi, primer akan diperpanjang oleh DNA polymerase pada suhu 72⁰C selama 1 menit. Setelah proses siklus PCR, umumnya ditambah post-elongasi selama 7 menit pada temperatur 72⁰C agar semua hasil PCR berbentuk untai ganda. Setelah itu suhu penyimpanan 15⁰C selama 10 menit.

3

Perunutan Produk PCR (Sekuensing) DNA A. granosa Gen COI Hasil PCR berupa DNA dijadikan cetakan (template) untuk ditentukan urutan basanya (A, T, C, G) pada proses sekuensing. Sekuensing dilakukan oleh perusahaan jasa pelayanan sekuensing. Prinsip analisa sekuensing DNA berbasis pada metode Sanger (1977) dan MaxamGilbert (Applied Biosystems 2012). PCR untuk sekuensing menggunakan DNA hasil amplifikasi dan primer yang sama seperti amplifikasi dengan teknik PCR. Pensejajaran Runutan Nukleotida Gen COI A. granosa Hasil sekuensing kemudian disejajarkan satu dengan lainnya. Pensejajaran runutan nukleotida dilakukan dengan menggunakan metoda Clustal W yang terdapat pada software MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007). Runutan nukleotida gen COI A. granosa dengan primer forward dan reverse diedit dan dianalisis untuk mendapatkan sekuens DNA dari gen COI tersebut. Sebagai ingroup, runutan gen COI A. granosa disejajarkan dengan beberapa spesies dari famili Arcidae, yaitu Tegillarca granosa (GenBank: HQ896793.1) Anadara diluvii (GenBank: JF496763.1), Anadara crebricostata (GenBank: HQ258847.1), Anadara vellicata (GenBank: HQ258848.1), Anadara sativa (GenBank: AB034692.1), Anadara pilula (GenBank: HQ258862.1), Diluvarca ferruginea (GenBank: AB050896.1), Scapharca globosa (GenBank: AB254194.1). Sebagai outgroupnya disejajarkan dengan Cucullaea labiata (Famili Cucullaeidae) (GenBank: AB050892.1), Didimacar tenebrica (Famili Noetiidae) (GenBank: HQ258871.1), dan Gl y cy me ri s rot unda (Fa mi l i Gl yc ym er i di da e) (GenBank: AB076934.1). Pensejajaran berganda dilakukan hanya pada nukleotida, sehingga dapat diketahui apakah ada perbedaan nukleotida hasil dari subtitusi maupun insersi dan delesi pada kerang darah yang diuji. Analisis Filogeni Analisis filogeni A. granosa dikonstruksi antara gen COI hasil penelitian ini dengan basis data gen COI, yaitu Tegillarca granosa, Anadara diluvii, Anadara crebricosata, Anadara vellicata, Anadara sativa, Anadara pilula, Diluvarca ferruginea, Scapharca globosa, Cucullaea labiata, Didimacar tenebrica, dan Glycymeris rotunda. Analisis filogeni menggunakan program MEGA 4

(Tamura et al. 2007) berdasarkan metode substitusi nukleotida dengan jarak genetik pdistance dan konstruksi pohon filogeni berdasarkan bootstrapped Neighbour-Joinning (NJ) dengan 1000 kali pengulangan.

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil DNA Total DNA total dari 71 sampel Bojonegara dan 53 sampel Panimbang hasil ekstraksi, hanya terdapat 5 sampel yang menunjukkan kualitas DNA yang baik, terdiri atas 3 sampel asal Bojonegara dan 2 sampel asal Panimbang (Gambar1). DNA tersebut kemudian dijadikan cetakan DNA untuk mengamplifikasi gen COI dengan menggunakan teknik PCR. Amplifikasi dan Visualisasi DNA Gen COI target amplifikasi berukuran sekitar 600 bp (Gambar 2). Suhu optimum penempelan primer adalah pada 59ºC. Pita DNA target hasil amplifikasi didapatkan sebanyak 5 sampel yaitu B12, B36, B86, L61, dan L64. Namun, dari 5 sampel, hanya 3 sampel yang dilanjutkan ke proses sekuensing karena 3 sampel lainnya memiliki kualitas DNA yang kurang baik. Selanjutnya DNA dimurnikan dan disekuensing sehingga diperoleh 3 sampel (B12, B86, dan L64) dengan kualitas urutan yang baik. 1

Gambar 1

2

3

4

5

Hasil isolasi DNA total otot A. granosa pada gel agarosa 1.2%. Keterangan: dari kolom 1 sampai kolom 5= B12, B36, B86, L61, L64; B= Bojonegara, L= Panimbang

4

Sekuens dan Alignment DNA A. granosa Gen COI Sampel A. granosa hasil amplifikasi dengan teknik PCR dilanjutkan dengan perunutan DNA oleh jasa pelayanan sekuensing. Sekuensing dilakukan dua arah yaitu forward dan reverse. Berdasarkan hasil 1

2

3

4

5

6

Ketiga sekuen A.granosa disejajarkan dengan ingroup (sesama Famili Arcidae) dan dengan outgroup (non Famili Arcidae). Berdasarkan pensejajaran dengan ingroup dan outgroup, panjang nukleotida A. granosa menjadi 428 bp, dan diperoleh nilai conserved dan variabel masing-masing 48.6% (208/428) dan 51.4% (220/428). Situs nukleotida COI A. granosa yang berbeda dengan spesies lain terdapat 17 situs nukleotida. Situs nukleotida tersebut bersifat diagnostik sehingga dapat digunakan sebagai penciri spesies tersebut (Lampiran 4). 1

2

3

4

700 bp 600 bp

Gambar 2 Hasil amplifikasi daerah COI pada gel agarosa 1.2%. Keterangan: dari kolom 1 sampai kolom 6= marker 100 bp, B12, B36, B86, L61, L64; B= Bojonegara, L= Labuhan/Panimbang sekuensing dan hasil pensejajaran dengan primer forward dan reverse complement, panjang nukleotida yang dihasilkan B12, B86, dan L64 adalah sepanjang 606 bp. Posisi segmen gen COI Anadara granosa berdasarkan gen COI Crassostera gigas dapat dilihat pada Gambar 4. Hasil pensejajaran sampel kemudian ditelusuri presentase kedekatannya dengan spesies lain. Pencarian dilakukan dengan menggunakan BLAST n (Basic Local Alignment Search Tool – nucleotide) pada situs NCBI (National Center for Biotechnology Information). Hasil pencarian menunjukkan bahwa sampel A. granosa memiliki kedekatan dengan Tegillarca granosa (GenBank: HQ896793.1) sebesar 99% (Lampiran 7). Sekuens intra spesies A. granosa pada gen COI sepanjang 606 bp menunjukkan komposisi nukleotida yang terdiri dari 40.3% basa timin (T), 21.1% adenin (A), 15.3% basa sitosin (C) dan 23.3 basa guanin (G). Basa yang mendominasi yaitu T dan G.

Gambar 3

Gambar 4

Elektroforesis DNA hasil pre-test produk PCR pada gel agarosa 1%. Keterangan: dari kolom 1 sampai 4= marker 1kb, B12, B86, L64

Posisi segmen gen COI Anadara granosa (606 bp) berdasarkan gen COI Crassostrea gigas (GenBank: AF177226.1; 1525 bp).

Analisis Filogeni A. granosa Gen COI Hubungan kekerabatan antar famili Arcidae (A. granosa, T. granosa, A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa) maupun famili lain, C. labiata (Famili Cucullaeidae), D. tenebrica (Famili Noetiidae), dan G. rotunda (Famili Glycymerididae) dapat

5

dibandingkan berdasarkan jarak genetik pdistance dari basa-basa nukleotidanya. Nilai jarak genetik A. granosa, T. granosa, A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa, C. labiata, D. tenebrica, dan G. rotunda berkisar antara 0-0.346 (Lampiran 6). Angka yang ditunjukkan matriks pada Lampiran 6 adalah hasil pensejajaran nukleotida antara A. granosa dengan ingroup dan outgroup. Spesies A. granosa dengan T. granosa, A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa, masing-masing memiliki jarak genetik 0.002-0.005 (0.2%-0.5%), 0.199-0.201 (19.9%-20.1%), 0.199-0.201 (19.9%20.1%), 0.206-0.208 (20.6%-20.8%), 0.2150.217 (21.5%-21.7%), 0.224-0.227 (22.4%22.7%), 0.210-0.213 (21%-21.3%), dan 0.180-0.182 (18%-18.2%). Jarak A. granosa dengan C. labiata, D. tenebrica, dan G. rotunda masing-masing adalah 0.287-0.290 (28.7%-29%), 0.315-0.318 (31.5%-31.8%), 0.257-0.259 (25.7%-25.9%). Berdasarkan data tersebut, jarak genetik terkecil adalah antara A. granosa dengan T. granosa dan jarak terbesar adalah dengan D. tenebrica. Analisis filogeni menunjukkan kekerabatan yang dekat antara gen COI A. granosa asal Bojonegara dan Panimbang karena perbedaan jarak genetiknya yang hanya 00.002 (0%-0.2%). Konstruksi pohon filogeni A. granosa, A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa, C. labiata, D. tenebrica, dan G. rotunda berdasarkan jarak genetik pdistance dari basa-basa nukleotida COI (Gambar 5) menunjukkan bahwa tiga sampel A. granosa berada pada nodus yang sama dengan bersama dengan T. granosa. Pohon fiogeni (Gambar 5) terbagi menjadi tiga nodus, yaitu nodus A, nodus B, dan nodus C. Nodus A terdiri dari semua ingroup (A1, A2, A3, A4). Nodus B ditempati oleh satu outgroup, yaitu D. tenebrica. Nodus C terdiri dari dua outgroup, yaitu C. labiata dan G. rotunda. A. granosa berada pada nodus A3 bersama dengan T. granosa dengan perbedaan nukleotida sebanyak 25 nt jika dibandingkan dengan nodus A1, A2, dan A4 (Lampiran 5). Hal ini menunjukkan bahwa Anadara granosa memiliki ciri genetik yang membedakannya dengan sesama anggota Famili Arcidae. Kedekatan antara A. granosa dengan T. granosa menunjukkan bahwa dua spesies tersebut merupakan spesies yang sama. Meskipun hasil BLAST

n menunjukkan kedekatan A. granosa dengan T. granosa adalah 99% (Lampiran 7). Pembahasan Ketiga sampel A. granosa menghasilkan pita DNA yang baik sepanjang 606 bp. Hal ini mengindikasikan konsentrasi DNA cukup tinggi. Faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi gen COI adalah kemurnian DNA hasil purifikasi (Sentausa 2003), komposisi bahan pereaksi, serta kondisi PCR yang tepat, terutama pada proses penempelan primer pada tahap annealing. Tahap annealing memungkinkan primer forward dan reverse akan menempel secara spesifik pada kedua ujung DNA cetakan sehingga dibutuhkan optimasi suhu pada tahap ini. Suhu optimum penempelan primer pada saat amplifikasi sampel yaitu 59ºC. Jika suhu penempelan primer terlalu tinggi dari suhu optimum, menyebabkan primer tidak menempel dengan DNA cetakan. Jika suhu penempelan primer terlalu rendah dari suhu penempelan optimum menyebabkan mispriming, yaitu penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga dihasilkan produk non spesifik. Oleh karena itu, dilakukan optimasi terhadap suhu penempelan primer (Newton dan Graham 1997). Hambatan yang sering terjadi dalam penelitian ini, yaitu kesulitan dalam penentuan suhu optimum annealing agar primer dapat menempel dengan sempurna sehingga DNA dapat teramplifikasi. Untuk mengatasinya, dilakukan optimasi suhu dengan mencoba beberapa range suhu dari 51ºC hingga 60ºC, hingga didapatkan suhu optimum annealing yaitu 59ºC. Selain itu, hambatan yang sering ditemui pada penelitian ini adalah komposisi pereaksi PCR yang terbaik agar pita hasil amplifikasi DNA tebal. Modifikasi yang dilakukan antara lain menambahkan volume MgCl2 dan volume DNA cetakan. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. MgCl2 akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Konsentrasi MgCl2 dalam proses PCR berpengaruh pada spesifitas dan perolehan proses (Handoyo dan Rudiretna 2001). DNA cetakan ditambahkan untuk menambah konsentrasi DNA di dalam komposisi pereaksi PCR.

6

Ingroup

Outgroup

Gambar 5 Konstruksi pohon filogeni berdasarkan runutan 428 nukleotida COI dengan metode Neighboor-Joining, bootstrapped 1000x, model p-distance.

Variabilitas Gen COI Kekerabatan dapat ditunjukkan dengan menggunakan pendekatan filogenetik yaitu jarak genetik antar sekuen. Persentase jarak genetik spesies A. granosa dengan ingroup (T. granosa, A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa) adalah 0.2%-22.7%. Sedangkan persentase jarak genetik A. granosa dengan outgroup (Cucullaea labiata, Didimacar tenebrica, dan Glycymeris rotunda adalah 25.7%-31.8%. Hal tersebut menunjukkan bahwa semakin besar nilai jarak genetik, maka semakin besar perbedaan jumlah basa nukleotidanya, sehingga semakin jauh hubungan kekerabatannya. Sebaliknya, semakin kecil nilai jarak genetik, maka semakin dekat hubungan kekerabatan antar spesies. Sampel B12, B86, dan L64 terletak pada nodus yang sama dengan A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, A. ovalis, D. ferruginea, dan S. globosa. Filogeni berdasarkan runutan nukleotida menunjukkan bahwa A. granosa menempati nodus sendiri (Gambar 5) bersama dengan T. granosa. Artinya, meskipun termasuk dalam satu famili, A. granosa memiliki ciri khusus yang dapat dibedakan dengan sesama familinya. Konstruksi filogenetik menunjukkan A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, A. ovalis, D. ferruginea, dan S. globosa sebagai kerabat pada level

famili (Arcidae) dan kerabat jauhnya (outgroup) yaitu Cucullaea labiata, Didimacar tenebrica, dan Glycymeris rotunda. Penggunaan outgroup berfungsi sebagai faktor koreksi dalam penentuan karakter diantara ingroup yang ada (Maddison 1984), sehingga dapat membuktikan bahwa spesies ingroup yang dibandingkan dengan A. granosa pada pensejajaran adalah benar sesama famili Arcidae. Runutan nukleotida pada gen COI A. granosa menunjukkan sedikit variasi dan dapat dikatakan bahwa nukleotida tersebut bersifat consereve pada level spesies. Keberadaan 17 situs nukleotida diagnostik yang merupakan penciri bagi spesies A. granosa menunjukkan evolusi spesifik pada A. granosa.

SIMPULAN Panjang nukleotida gen COI A. granosa berhasil dirunut sepanjang 606 nt dan menunjukkan sedikit variasi (conserve). Selain itu, penelitian ini berhasil mengkarakterisasi gen COI A. granosa sepanjang 428 nt yang dapat dijadikan barcoding untuk spesies tersebut. Ada 17 situs nukleotida diagnostik untuk A. granosa sebagai penciri spesies.

7

SARAN Untuk memperoleh informasi molekuler Anadara granosa, perlu dilakukan penelitian lanjutan menggunakan penanda genetik Cytochrome b (Cyt. b) dan gen lainnya dengan menggunakan sampel dari lokasi lain di Indonesia.

DAFTAR PUSTAKA Applied Biosystems. 2012. DNA sequencing and fragment analysis by capillary electrophoresis. [terhubung berkala]. http://www.appliedbiosystems.com. [20 Desember 2012]. [DJPT] Direktorat Jenderal Perikanan Tangkap. 2011. Statistik Perikanan Tangkap Indonesia. Jakarta: Direktorat Jenderal Perikanan Tangkap. [FAO] Fisheries and Aquaculture Organization. 2009. Anadara granosa (Linnaeus 1758). [terhubung berkala]. http://www.fao.org/fisheryspesies/35 03/en [04 Juni 2012]. Hajibabaei M, Singer GAC, Hebert PDN, Hickey DA. 2007. DNA barcoding: how it complements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics. TRENDS in Genetics 23 (4): 167-172. Handoyo D, Rudiretna A. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas 9 (1): 17-29. Hebert PDN, Ratnasingham S, De Waard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc 270: 96–99. Hutagaol CA, Pringgenies D. 2007. Kajian kandungan besi (Fe) dan seng (Zn) pada bivalvia Periglypta sp. di perairan Jepara. Prosiding Seminar Nasional Moluska Dalam Penelitian, Konservasi Dan Ekonomi: 385-394. Jalius et al. 2008. Akumulasi logam berat dan pengaruhnya terhadap spermatogenesis kerang hijau (Perna viridis). Jurnal Ilmu-ilmu Perairan dan Perikanan Indonesia 15 (1): 7783. Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup analysis and parsimony. Syst Zool 33: 83-103.

Muawanah N, Hendrianto S, A Triana. 2005. Pemantauan lingkungan perairan pada kegiatan pengembangan budidaya dan sanitasi kerang hijau (Perna viridis) di Kabupaten Pandeglang, Provinsi Banten. Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur 4: 13-16. Murtini JT, Yennie Y, Peranginangin R. 2003. Kandungan logam berat pada kerang darah (Anadara granosa), air laut dan sedimen di perairan Tanjung Balai dan Bagan Siapi-api. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia. 9 (5): 77-80. Newton CR, Graham A. 1997. PCR Introduction to Biotechnique. Second Edition. Oxford (GB): Bios Scientific Publisher Ltd. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467. Sentausa E. 2003. Studi DNA Prasejarah dari Tulang Manusia Situs Arkeologi Tadulako, Sulawesi Tengah [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Solihin DD. 1994. Peran DNA mitokondria (mtDNA) dalam studi keragaman genetik dan biologi populasi pada hewan. Hayati 1 (1): 1-4. Solihin DD. 1997. Isolasi dan purifikasi mitochondrian DNA (mtDNA). Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA 4: Molecular evolutionary genetics analysis software version 4. J Mol Biol Evol 24: 1596-1599.

8

LAMPIRAN

2

Lampiran 1

Peta lokasi pengambilan sampel A. granosa Bojonegara dan Panimbang

Sumber: Googlemaps 2013 Keterangan:

= Bojonegara = Panimbang

3

Lampiran 2

Pensejajaran berganda nukleotida (606 nt) pada gen COI A. granosa sampel B12, B86, dan L64

#MEGA !Title B12 vs B86 vs L64; !Format DataType=Nucleotide NSeqs=3 NSites=606 Identical=. Missing=? Indel=-;

!Domain=Data; [ 1 [ 1234567890 #B12 GCCGGCAGGT #B86 .......... #L64 ..........

1111111112 1234567890 CTTTATGTAG .......... ..........

2222222223 1234567890 AAGTTAGTCA .......... ..........

3333333334 1234567890 GTTGTATAAT .......... ..........

4444444445 1234567890 GTGATTATTA .......... .........T

5555555556 1234567890 CGAGGCATGC .......... ..........

6666666667 ] 1234567890 ] ATTTATTATG .......... ..........

[ [ [ #B12 #B86 #L64

7777777778 1234567890 ATTTTTTTTT .......... ..........

8888888889 1234567890 TCGTTATACC .......... ..........

1 9999999990 1234567890 AGTAATAATG .......... ..........

1111111111 0000000001 1234567890 GGGGGGTTTG .......... ..........

1111111111 1111111112 1234567890 GTAATTGACT .......... ..........

1111111111 2222222223 1234567890 GATTCCAATT .......... ..........

1111111111 ] 3333333334 ] 1234567890 ] ATAGTTGGGT .......... ..........

[ [ [ #B12 #B86 #L64

1111111111 4444444445 1234567890 GTGGGGATAT .......... ..........

1111111111 5555555556 1234567890 AAGACACCCA .......... ..........

1111111111 6666666667 1234567890 CGTTTAAATA .......... ..........

1111111111 7777777778 1234567890 ATTTTAGCTA .......... ..........

1111111111 8888888889 1234567890 CTGAGCCATT .......... ..........

1111111112 9999999990 1234567890 CCTGGTGCTT .......... ..........

2222222222 ] 0000000001 ] 1234567890 ] TATTCATAGT .......... ..........

4

Lampiran 2

Lanjutan

[ [ [ #B12 #B86 #L64 [ [ [ #B12 #B86 #L64

2222222222 1111111112 1234567890 TTTCATGTCA .......... .......... 2222222222 8888888889 1234567890 ATCTATCATA .......... ..........

2222222222 2222222223 1234567890 GCGTTGATTG .......... .......... 2222222223 9999999990 1234567890 GAAGTCCGGC .......... ..........

2222222222 3333333334 1234567890 AGGGGGGGGC .......... .......... 3333333333 0000000001 1234567890 GCTGGATATG .......... ..........

2222222222 4444444445 1234567890 CGGTACTGGA .......... .......... 3333333333 1111111112 1234567890 GTTATTCTTT .......... ..........

2222222222 5555555556 1234567890 TGAACTCTTT .......... .......... 3333333333 2222222223 1234567890 CGTTGCATAT .......... ..........

2222222222 6666666667 1234567890 ACCCTCCCCT .......... .......... 3333333333 3333333334 1234567890 TGCTGGGTTT .......... ..........

2222222222 7777777778 1234567890 TTCTGGTTGG .......... .......... 3333333333 4444444445 1234567890 GGTTCAATGA .......... ..........

] ] ]

[ [ [ #B12 #B86 #L64

3333333333 5555555556 1234567890 TAAGGTCTTT .......... ..........

3333333333 6666666667 1234567890 AAATTTTATG .......... ..........

3333333333 7777777778 1234567890 TGTACTATAA .......... ..........

3333333333 8888888889 1234567890 TTACAAGTCG .......... ..........

3333333334 9999999990 1234567890 TTTTTATGCT .......... ..........

4444444444 0000000001 1234567890 ATAATTCCAG .......... ..........

4444444444 ] 1111111112 ] 1234567890 ] AGCGGATACC .......... ..........

[ [ [ #B12 #B86 #L64

4444444444 2222222223 1234567890 TGTGTTTTGT .......... ..........

4444444444 3333333334 1234567890 TGGTCGATGT .......... ..........

4444444444 4444444445 1234567890 TTGTTACATC .......... ..........

4444444444 5555555556 1234567890 TTGGTTATTA .......... ..........

4444444444 6666666667 1234567890 TTATTTTCTT .......... ..........

4444444444 7777777778 1234567890 TACCTGTCTT .......... ..........

4444444444 ] 8888888889 ] 1234567890 ] GGCTGGCGGT .......... ..........

[ [ [ #B12 #B86 #L64

4444444445 9999999990 1234567890 TTAACTATAC .......... ..........

5555555555 0000000001 1234567890 TTCTTACTGA .......... ..........

5555555555 1111111112 1234567890 TCGCCATATT .......... ..........

5555555555 2222222223 1234567890 AATAGTTCTT .......... ..........

5555555555 3333333334 1234567890 TTTTTCGACC .......... ..........

5555555555 4444444445 1234567890 GCAAGGGGGA .......... ..........

5555555555 ] 5555555556 ] 1234567890 ] GGGGATCCTT .......... ..........

] ] ]

5

Lampiran 2 [ [ [ #B12 #B86 #L64

Lanjutan

5555555555 6666666667 1234567890 TATTGTTTCA .......... ...G......

5555555555 7777777778 1234567890 ACATTTGTTT .......... ..........

5555555555 8888888889 1234567890 TGGTTTTTTG .......... ..........

5555555556 9999999990 1234567890 GACACCCGGA .......... ..........

666666] 000000] 123456] GGTTTA ...... ......

Keterangan: Urutan nukleotida dibaca secara vertikal/ kolom. Angka-angka menunjukkan situs nukleotida. (.) adalah nukleotida identik

6

Lampiran 3

Pensejajaran berganda nukleotida (428 nt) pada gen COI A. granosa dengan T. granosa, A. diluvii, A. crebricosata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa, C. labiata, D. tenebrica, dan G. rotunda (GenBank).

#MEGA !Title B12, B86, L64 vs ingroup vs outgroup; !Format DataType=Nucleotide NSeqs=14 NSites=428 Identical=. Missing=? Indel=-;

!Domain=Data; [ [ #B12 #B86 #L64 #Tegillarca_granosa #Anadara_diluvii_(Italy) #Anadara_crebricostata_(China) #Anadara_vellicata_(China) #Anadara_sativa_(Japan) #Anadara_pilula_(China) #Diluvarca_ferruginea_(Japan) #Scapharca_globosa_(Japan) #Cucullaea_labiata_(Japan) #Didimacar_tenebrica_(China) #Glycymeris_rotunda_(Japan)

1 1234567890 CACGTTTAAA .......... .......... .......... .T.....T.. .T..G..... .T..G..... .T.....G.. .G..A..... .T..G..... .T..A..... .T..G..G.. .T...G.T.. ....AGCT..

1111111112 1234567890 TAATTTTAGC .......... .......... .......... .........A .........G .........A .........G ......A..T ...C.....T .........A ....A.G..G ....A.A..A ....A.G..G

2222222223 1234567890 TACTGAGCCA .......... .......... .......... ..T..G.TAT ..T....TAC ..T....TGT ..T...ATTT ..T..G.TTC ..T..G.TTC ..T..G.TTT .TT..GTTGT ..T..GTTTT ..T...TTGG

3333333334 1234567890 TTCCTGGTGC .......... .......... .......... .G..C..G.. .A........ .A..G..... .G..A..A.. ....GAC... ....A..... .A..A..... .G.....GC. .G.....GC. .......GC.

4444444445 1234567890 TTTATTCATA .......... .......... .......... .C.T..T... ......T... GC.T..T... ......T... .C.T..T..G ...G..T..G ......T... GC.G..T..G A..GC.G... ...GA.T...

5555555556 1234567890 GTTTTCATGT .......... .......... .......... ....GT.... ..CA.TG... ...G.T.... ..AA.T..A. .....GT.T. ...G.T..A. ..AA.T.... T.A..GG.T. ..A..GTG.. T.GA.T..T.

6666666667 ] 1234567890 ] CAGCGTTGAT .......... .......... .......... .T..T...C. .T..TC.T.. .T........ .T..T..A.. .TT.C..AG. .T..T..A.. .T..TC.T.. .T.G...A.. .T.G....G. .T.GTAC.G.

[ [ [ #B12 #B86 #L64

7777777778 1234567890 TGAGGGGGGG .......... ..........

8888888889 1234567890 GCCGGTACTG .......... ..........

1 9999999990 1234567890 GATGAACTCT .......... ..........

1111111111 0000000001 1234567890 TTACCCTCCC .......... ..........

1111111111 1111111112 1234567890 CTTTCTGGTT .......... ..........

1111111111 2222222223 1234567890 GGATCTATCA .......... ..........

1111111111 ] 3333333334 ] 1234567890 ] TAGAAGTCCG .......... ..........

7

#Tegillarca_granosa #Anadara_diluvii_(Italy) #Anadara_crebricostata_(China) #Anadara_vellicata_(China) #Anadara_sativa_(Japan) #Anadara_pilula_(China) #Diluvarca_ferruginea_(Japan) #Scapharca_globosa_(Japan) #Cucullaea_labiata_(Japan) #Didimacar_tenebrica_(China) #Glycymeris_rotunda_(Japan)

.......... ......T... ...A..T..T ......T... ......A... .......... ...A..C..T ......T... ......A..T A..A.....C ...A..T...

.......... .....A..A. .TG..A.... ..G..G.... .TT..A.... .TG..A.... .TA..G.... .TA.....A. ..T..CT.G. ..A..G..A. ..A..G..G.

.......... .T.....AG. .T..G..... .T..G..A.. .T.....AT. .C......T. .T..G...T. .T..G..... .G..G..G.. .T..G...T. .T..G...T.

.......... C........G C..T.....G ...T..A..T G..T..A... A..T..G..T A.....C..T ...T.....T A..T.....A G..T..G... A..T.....T

.......... T.A..C.C.. T.G..AA.A. ......A.G. ..A..AA.C. T.G...A.G. T.G...A.C. ......A.A. .....AA.G. T.G..GTC.G T.A..CTC.A

.......... ....T.T... ....T.TC.. .A..T.T... .A..T.T... ....T.TC.. .A..T.T... .A..T.T... AT.GG.T... T.GAG.T... ....G.....

..A....... .........T C..T.....T ...G..G... .........T ...G.C.... ......C..T ...G.....T CTC..CA..T .TCT.CC..T .CC..C...T

[ [ [ #B12 #B86 #L64 #Tegillarca_granosa #Anadara_diluvii_(Italy) #Anadara_crebricostata_(China) #Anadara_vellicata_(China) #Anadara_sativa_(Japan) #Anadara_pilula_(China) #Diluvarca_ferruginea_(Japan) #Scapharca_globosa_(Japan) #Cucullaea_labiata_(Japan) #Didimacar_tenebrica_(China) #Glycymeris_rotunda_(Japan)

1111111111 4444444445 1234567890 GCGCTGGATA .......... .......... .......... ..TA.....G ..TT...... ..TT.A.... ..TT.A.... ..TT.A.... ..TT...... ..TT.A.... ..TA.....T ...G.....C ..TA.A...T

1111111111 5555555556 1234567890 TGGTTATTCT .......... .......... .......... .T......T. ........T. ........T. ....GG.... ....GG.AT. .....G.GT. ....A...T. .A......T. .A..G..... .A..A...T.

1111111111 6666666667 1234567890 TTCGTTGCAT .......... .......... .......... ...TC.T... C..TC.T... ...TC.T... ...CC.T... ...TC.T... ...TC.T... ...TC.T... ...T..A... ...A..A... ...T......

1111111111 7777777778 1234567890 ATTGCTGGGT .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..C..A..A. .....A.... .......... ..C....... G.G.....T. ..A..C.... G.......T.

1111111111 8888888889 1234567890 TTGGTTCAAT .......... .......... .......... .......C.. ....G..T.. ....A..... ....G..... .......T.. ....G..T.. ....G..T.. .......T.. .C..GAG... .......T..

1111111112 9999999990 1234567890 GATAAGGTCT .......... .......... .......... .......... ...G..A... A.....T... A.....T... A..G...... ......T... A.....A... T.....T... T.....A..A T........A

2222222222 ] 0000000001 ] 1234567890 ] TAAATTTTAT .......... .......... .......... .G..C..... .......... .G........ .......... .......... .G........ .......... .G..C..... .......... .T........

[ [ [ #B12 #B86

2222222222 1111111112 1234567890 GTGTACTATA ..........

2222222222 2222222223 1234567890 ATTACAAGTC ..........

2222222222 3333333334 1234567890 GTTTTTATGC ..........

2222222222 4444444445 1234567890 TATAATTCCA ..........

2222222222 5555555556 1234567890 GAGCGGATAC ..........

2222222222 6666666667 1234567890 CTGTGTTTTG ..........

2222222222 ] 7777777778 ] 1234567890 ] TTGGTCGATG ..........

8

#L64 #Tegillarca_granosa #Anadara_diluvii_(Italy) #Anadara_crebricostata_(China) #Anadara_vellicata_(China) #Anadara_sativa_(Japan) #Anadara_pilula_(China) #Diluvarca_ferruginea_(Japan) #Scapharca_globosa_(Japan) #Cucullaea_labiata_(Japan) #Didimacar_tenebrica_(China) #Glycymeris_rotunda_(Japan)

.......... .......... A........G .........G ......A..G .A.C..G... A......... A.C...A... A.....A... .ACG.....T A.C......G ..C......T

.......... .......... ......T... G.G..CG.C. .....CG.G. ..C...GC.. ........G. G.G..GG.C. ......G... T...GTT... GC..TGT... G..GTTT...

.......... .......... .G........ ......T... .A........ .G....T..T .A........ .......... .......... .C..C....G .....G.G.. .....GC..T

.......... .......... CC.......T GT....C... GT.G.....T .T.......T G......... GT.G.....G AC....C..T GT.G.....T .......ATT GC.T......

.......... .......... ........G. ........G. .....T..G. .....A.... .....A..G. .....A..G. .....A..G. .....A..G. ..A.....GA ..........

.......... .......... ..A.T...A. ....T..... ....T..... ....T..... ....T..... .A........ ....T..... .G......AT .........T ..A.T...AT

.......... .......... ......A..A ......T..A ...A..A... ...A...... ...A..A..A ......T... ......T... ...AG.T..A G..AG.A..A ....G.T...

[ [ [ #B12 #B86 #L64 #Tegillarca_granosa #Anadara_diluvii_(Italy) #Anadara_crebricostata_(China) #Anadara_vellicata_(China) #Anadara_sativa_(Japan) #Anadara_pilula_(China) #Diluvarca_ferruginea_(Japan) #Scapharca_globosa_(Japan) #Cucullaea_labiata_(Japan) #Didimacar_tenebrica_(China) #Glycymeris_rotunda_(Japan)

2222222222 8888888889 1234567890 TTTGTTACAT .......... .......... .......... ........G. .....A..G. .....G..G. .....A..G. ........G. .....A.... .....G.... ........T. A.G.....T. ........T.

2222222223 9999999990 1234567890 CTTGGTTATT .......... .......... .......... ....A..... .......G.. .A..AC.... .......G.. .......G.. .A........ .G........ .A........ ....AC.... .......G..

3333333333 0000000001 1234567890 ATTATTTTCT .......... .......... .......... G..G...... G......... G........G G..GC..... G..G..C... G..G...... .......... ...G...... .C.TC..... G..G......

3333333333 1111111112 1234567890 TTACCTGTCT .......... .......... .......... ..G..G..G. ..G.....G. C.T.....G. ..G.....G. C.T.....G. ..G.....G. ..G.....A. ..G.....G. ..G..A..T. ..G.....G.

3333333333 2222222223 1234567890 TGGCTGGCGG .......... .......... .......... .A.....G.. .......G.. .......... ....C..A.. .A.....G.. .......T.. .A.....A.. ....G..G.. .A..C..A.. ....A..G..

3333333333 3333333334 1234567890 TTTAACTATA .......... .......... .......... G..G.....G G........G G..G..G..G G......... A..G...... A........G G......... C.....C..G AC....A..G ...G......

3333333333 ] 4444444445 ] 1234567890 ] CTTCTTACTG .......... .......... .......... ...T.A.... ...T.G.... ...T.A.... ..GT.G..G. T.GT.A..G. ...T.A.... ...T.A.... T.AA....G. A.AA....G. ..AA....A.

[ [ [ #B12

3333333333 5555555556 1234567890 ATCGCCATAT

3333333333 6666666667 1234567890 TAATAGTTCT

3333333333 7777777778 1234567890 TTTTTTCGAC

3333333333 8888888889 1234567890 CGCAAGGGGG

3333333334 9999999990 1234567890 AGGGGATCCT

4444444444 0000000001 1234567890 TTATTGTTTC

4444444444 ] 1111111112 ] 1234567890 ] AACATTTGTT

9

#B86 #L64 #Tegillarca_granosa #Anadara_diluvii_(Italy) #Anadara_crebricostata_(China) #Anadara_vellicata_(China) #Anadara_sativa_(Japan) #Anadara_pilula_(China) #Diluvarca_ferruginea_(Japan) #Scapharca_globosa_(Japan) #Cucullaea_labiata_(Japan) #Didimacar_tenebrica_(China) #Glycymeris_rotunda_(Japan)

.......... .......... .......... ....A...GC ....A...G. ....T...G. ....T...G. ........C. ....G..CG. ....A..CG. .C.....CT. ....T...T. ....T...G.

[ [ [ #B12 #B86 #L64 #Tegillarca_granosa #Anadara_diluvii_(Italy) #Anadara_crebricostata_(China) #Anadara_vellicata_(China) #Anadara_sativa_(Japan) #Anadara_pilula_(China) #Diluvarca_ferruginea_(Japan) #Scapharca_globosa_(Japan) #Cucullaea_labiata_(Japan) #Didimacar_tenebrica_(China) #Glycymeris_rotunda_(Japan)

44444444] 22222222] 12345678] TTGGTTTT ........ ........ ........ ........ ........ ...A.... ........ ...A.... ........ ...A.... ........ ........ ...A....

.......... .......... .......... A..C.C.... A......... A......... A......... .....CG... A....C.... A..C...... G..C.C.... G....CGGT. A..C.C....

.......... .......... .......... ......AAT. ........T. ..C.....T. .....C..T. .....C..T. ........G. ........T. ........T. ......ACC. ........G.

.......... .......... .......... .......A.. ....G..T.. .A.....T.. .T.....T.. .T..G..T.. .T.....A.. .T........ .CGCG..... .TAG...... ..GC......

Keterangan: Urutan nukleotida dibaca secara vertikal/ kolom. Angka-angka menunjukkan situs nukleotida. (.) adalah nukleotida identik

.......... .......... .......... T..T...... G..T...... T........A C..A..C... G......... T......... T..A...... .......... G..T..C..A T..A.....A

.......... ....G..... .......... .......... .....A.... ...C.A.... .....A.... C.T....... ........C. .....A.... A.TC...... G.T....... A.T.......

.......... .......... .......... .G........ .G........ ....C..A.. .....C.... .......A.. .......A.. .......... .G........ .G.....A.. .G........

10

Lampiran 4

Situs nukleotida diagnostik gen COI mitokondria A. granosa berdasarkan runutan 428 nt yang dibandingkan (tanpa T. granosa)

Situs nukleotida keSpesies

B12 Anadara granosa B86 Anadara granosa L64 Anadara granosa Anadara diluvii (Italy) Anadara crebricostata (China) Anadara vellicata (China) Anadara sativa (Japan) Anadara pilula (China) Diluvarca ferruginea (Japan) Scapharca globosa (Japan) Cucullaea labiata (Japan) Didimacar tenebrica (China) Glycymeris rotunda (Japan)

2 0 C C C A G A G T T A G A G

2 3 C C C T T T T T T T T T T

2 8 C C C T T T T T T T T T T

2 9 C C C A A G T T T T G T G

3 0 A A A T C T T C C T T T G

4 7 C C C T T T T T T T T G T

5 6 C C C T T T T G T T G G T

6 2 A A A T T T T T T T T T T

9 2 A A A T T T T C T T G T T

1 2 5 C C C T T T T T T T G G G

1 4 4 C C C T T T T T T T A G A

1 6 4 G G G T T T C T T T T A T

3 1 4 A A A G G T G T G G G G G

3 2 0 C C C G G G G G G A G T G

3 4 5 C C C T T T T T T T A A A

3 6 0 A A A G G G G C G G T T G

3 8 0 A A A T T T T T G T T C G

11

Lampiran 5 Perbandingan situs nukleotida diagnostik gen COI A3*) (Anadara granosa) dengan nodus A1, A2, dan A3 berdasarkan runutan 428 nt yang dibandingkan.

Nodus

A3

A1

A2 A4

2 A . . T T T T T G T

2 0 C . . G A G T A T A

Keterangan: *) = tanpa T. granosa

2 3 C . . T T T T T T T

2 8 C . . T T T T T T T

2 9 C . . A G T T T T A

3 0 A . . C T T C T C T

4 7 C . . T T T T T T T

5 6 C . . T T T T T G T

6 2 A . . T T T T T T T

9 2 A . . T T T T T C T

1 2 5 C . . T T T T T T T

Situs nukleotida ke1 1 1 1 2 4 4 6 7 3 4 4 A G C G . . . . . . . . T T T T T T T T T T T C T T T T T T T T T T T T T T A T

1 6 5 T . . C C C C C C C

1 6 7 G . . T T T T T T T

3 1 4 A . . G T G G G T G

3 2 0 C . . G G G G A G G

3 3 2 T . . G G G A G A G

3 4 5 C . . T T T T T T T

3 4 7 T . . G A G A A A A

3 6 0 A . . G G G G G C G

3 8 0 A . . T T T G T T T

3 9 2 A . . G T C T T G T

12

Lampiran 6

[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14]

Matriks perbedaan rata-rata nukleotida berdasarkan metode pairwise distance daerah COI pada A. granosa, A. diluvii, A. crebricostata, A. vellicata, A. sativa, A. pilula, D. ferruginea, S. globosa, C. labiata, D. tenebrica, dan G. rotunda.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0.000 0.002 0.002 0.199 0.199 0.206 0.215 0.224 0.210 0.180 0.287 0.315 0.257

0.002 0.002 0.199 0.199 0.206 0.215 0.224 0.210 0.180 0.287 0.315 0.257

0.005 0.201 0.201 0.208 0.217 0.227 0.213 0.182 0.290 0.318 0.259

0.201 0.201 0.208 0.217 0.227 0.213 0.182 0.287 0.315 0.257

0.178 0.192 0.220 0.222 0.203 0.178 0.271 0.301 0.234

0.178 0.182 0.206 0.159 0.140 0.276 0.332 0.252

0.199 0.201 0.175 0.150 0.278 0.346 0.287

0.217 0.196 0.161 0.290 0.334 0.280

0.199 0.206 0.292 0.329 0.285

Keterangan: [1] B12 Anadara granosa [2] B86 Anadara granosa [3] L64 Anadara granosa [4] Tegillarca granosa (China) [5] Anadara diluvii (Italy) [6] Anadara crebricostata (China) [7] Anadara vellicata (China)

10

11

12

13

0.152 0.264 0.280 0.327 0.325 0.264 0.252

0.299 0.227

0.283

[8] Anadara sativa (Japan) [9] Anadara pilula (China) [10] Diluvarca ferruginea (Japan) [11] Scapharca globosa (Japan) [12] Cucullaea labiata (Japan) [13] Didimacar tenebrica (China) [14] Glycymeris rotunda (Japan)

14

13

Lampiran 7

Hasil Blast n gen COI Anadara granosa (606 bp)

BLAST ® Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide Sequence (606 letters) Query ID lcl|37079 Description None Molecule type nucleic acid Program BLASTN 2.2.27+

Query Length 606 Database Name nr Description Nucleotide collection (nt)

Graphic Summary Distribution of 100 Blast Hits on the Query Sequence

14

Description

Takson Tegillarca granosa haplotype 25 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial Aphonopelma mojave isolate APH_0516 cytochrome c oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; mitochondrial Sclerobunus robustus robustus voucher OP1040 cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial Euscorpius flavicaudis NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) gene, complete cds; tRNA-Trp, tRNA-Cys, and tRNA-Tyr genes, complete sequence; cytochrome c oxidase subunit I (COX1) gene, partial cds; cytochrome c oxidase subunit II (COX2) gene, complete cds; tRNA-Lys and tRNA-Asp genes, complete sequence; ATP synthase F0 subunit 8 (ATP8) and ATP synthase F0 subunit 6 (ATP6) genes, complete cds; and cytochrome c oxidase subunit III (COX3) gene, partial cds; mitochondrial Tetragnatha eurychasma cytochrome oxidase subunit I-like gene, partial sequence; mitochondrial Dysdera brevispina cytochrome c oxidase I (COI) gene, partial cds; mitochondrial gene for itochondrial product

Nilai Maks

Nilai Total

Query cover

E value

Max ident

No. Akses

1068

1068

96%

0.0

99%

HQ896793.1

126

126

24%

2e-25

82%

JX946035.1

126

126

32%

2e-25

78%

JN547502.1

126

126

24%

2e-25

82%

AY731175.1

126

126

24%

2e-25

82%

AY803903.1

121

121

22%

8e-24

83%

AF244316.1