Bioteknologi Tanaman
2.3. Enzim Restriksi
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Copyright Statement:
Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya) bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun. Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.
Bioteknologi Tanaman
2.2. Enzim Restriksi Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan bakteriophage, disebut nuklease , memotong = restriksi, internal = endonuklease Aktifitas: Memutuskan ikatan rantai phospodiester pada ujung 5‘ rantai DNA
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
3 Macam golongan, restriksi endonuklease type I, II dan III Type I dan III melakukan proses metilasi dan restriksi pada DNA yang sama Type II proses metilasi dan restriksi pada DNA yang berbeda Dalam keperluan rekayasa genetika enzym restriksi type II banyak digunakan Memotong DNA menurut urutan sisi pengenalan (recognition site), bedakan
dengan cutting site (titik pemotongan)
Jenisnya bermacam-macam: dari mulai 4-8 (tetra nukleotide-oktanukleotide) Contoh: 4: AfaI ; GT AC ; 37°C ; Rhodopseudomonas sphaeroides; 65°C-15 menit 6: Eco RI; G AATTC; 37°C; Escherichia coli H709C; 60°C-15 menit 8; Not I; GC GGCCGC; 37°C; Nocardia otitidis-caviarum; ekstraksi phenol
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Tabel beberapa contoh enzim, sisi pengenalan, suhu inkubasi dan suhu inaktivasi Enzim
Sisi Pengenalan
Suhu inkubasi
Aat II Afa I Alu I Apa I
GACGT C GT AC AG CT GGGCC C
37°C 37°C 37°C 37°C
BamHI Bgl I Bgl II Eco RI Eco RV Hae III Hind III Hpa I Mbo I Nco I Not I Pst I
G GATCC GCCNNNN NGGC A GATCT G AATTC GAT ATC GG CC A AGCTT GTT AAC GATC C CATGG GC GGCCGC CTGCA G
30°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Sau3A I Taq I Xba I Xho I
GATC T CGA T CTAGA C TCGAG
37°C 65°C 37°C 37°C
Organisme asal
Suhu inaktifasi
Acetobacter aceti IFO3281 Rhodopseudomonas sphaeroides Arthrobacter luteus Acetobacter pasteurianus sub. pasteurianus Bacillus amyloliquifaciens H. Bacillus globigi Bacillus globigi Escherichia coli H709C Escherichia coli Haemophilus aegyptus Haemophilus influenzae Rd Haemophilus parainfluenzae Moraxella bovis Nocardia corallina Nocardia otitidis-caviarum Escherichia coli ED8654 yang membawa gene Pst I Staphylococcus aureus 3A Thermus aquaticus Xanthomonas badrii Xanthomonas holcicola
65°C; 20’ 65°C; 15’ 60°C; 15’ 60°C; 15’ 60°C; 15’ 65°C; 15’ 70°C; 15’ 60°C; 15’ 70°C; 15’ 70°C; 15’ 70°C; 15’ 60°C; 15’ 70°C; 15’ 70°C; 15’ Ekst. phenol 60°C; 15’
70°C; 15’ Tidak ada 60°C; 15’ Presipitasi ethanol
Bioteknologi Tanaman
Contoh titik potong enzim restriksi endonuklease C T G A T G A A T T C C G T G A C T A C T T A A G G C A
EcoRI
A
Ujung kohesif Cohesive end
C T G A T G G A C T A C T T A A
A A T T C C G T G G C A
G A T G A T G A A T T C C G T C T A C T A C T T A A G G C A
B
Ujung tumpul
G A T GA T G A A C T A C T A C T T
MseI
T T C C G T A A G G C A
Blunt end
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Analogi Pemotongan Enzim Restriksi Enzim A 1
2
3
4
5
Enzim B 6
7
8
9
10
11
A
12
13
14
15
16
17
B AB
20,0 11,5 11,0
10,0
7,0
7,0
3,0
4,5 3,0
2,5 1,0
2,5 1,0
18
19
20 21 22 23
24 25 26
27
28
Bioteknologi Tanaman
Contoh dalam praktek hasil restriksi DNA M V
1 2 3
4 5
6 7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
12 kb 6 kb
3 kb
2 kb 1,6 kb
DNA BAC dipotong dengan EcoRI dan HindIII, sumber Jamsari Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Frekuensi pemotongan = 4n 4 = jumlah total macam basa nitrogen (CGAT) N = jumlah sisi pengenal spesifik Contoh :
EcoRI, hexanukleotid , maka enzim tersebut memotong DNA setiap: 46 basa = 4096
Maka apabila panjang DNA = 10 kb = 10.000 bp, akan terpotong menjadi sekitar 2 atau 3 fragmen jika dipotong dengan EcoRI,
Jika dipotong dengan MseI akan menghasilkan 38-40 fragment
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Transfer Asam Nukleat Southern Transfer (DNA) Northern Transfer (RNA) Western Transfer (Protein)
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Transfer Asam Nukleat Southern Transfer (DNA) diperkenalkan oleh Edward Southern (1977)
Pemberat Tumpukan kertas penghisap
Membran selulosa
Bahan penghisap larutan alkali Bak berisi larutan alkali
Gel tempat DNA
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Hibridisasi Asam Nukleat Hibridisasi : Penyatuan molekul DNA asing dengan sekuens DNA (probe) yang sudah diketahui identitasnya Syarat : ada homologi antara molekul DNA asing dengan probe yang kita miliki (70-100%) Sumber Probe: 1. Pustaka DNA genomik anonym yang dipilih. 2. Pustaka cDNA 3. DNA yang dihasilkan dari luar inti sel (sitoplasma)
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Hibridisasi Asam Nukleat Langkah-langkah Proses Hibridisasi
Hibridisasi dengan Probe
Restriksi
Agarose gel
Nylon membran
Röntgen Film
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Hibridisasi Asam Nukleat Gambar hasil autoradiogram jumlah kopi ujung Klon BAC yang dihibridisasi dengan DNA genomik tanaman asparagus,
Sumber, Jamsari
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Selesai
