AKTIVITAS ANTIKANKER KELENJAR GETAH BENING (LIMFOMA

Download Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas Antikanker. Kelenjar Getah Bening (Limfoma) secara In Vitro dari Spirulina plat...
1 downloads 588 Views 13MB Size
Download PDF
Love PNG Images
1

AKTIVITAS ANTIKANKER KELENJAR GETAH BENING (LIMFOMA) SECARA IN VITRO DARI Spirulina platensis YANG DIKULTIVASI DALAM MEDIA ORGANIK

JUHROTUL AENIAH

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017

2

3

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas Antikanker Kelenjar Getah Bening (Limfoma) secara In Vitro dari Spirulina platensis yang Dikultivasi dalam Media Organik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Februari 2017

Juhrotul Aeniah NIM C34120019

*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait

1

ABSTRAK JUHROTUL AENIAH. Aktivitas Antikanker Kelenjar Getah Bening (limfoma) secara In Vitro dari Spirulina platensis yang Dikultivasi dalam Media Organik. Dibimbing oleh IRIANI SETYANINGSIH dan KUSTIARIYAH TARMAN. Spirulina platensis merupakan mikroalga kelompok cyanobacteria yang mengandung komponen aktif dan berpotensi sebagai antikanker. Tujuan penelitian ini yaitu menentukan aktivitas antikanker kelenjar getah bening dari biomassa, ekstrak kasar dan fikosianin dari S. platensis yang dikultivasi pada media organik. Tahapan penelitian ini meliputi kultivasi, pemanenan, ekstraksi komponen aktif dan fikosianin, serta analisis aktivitas antikanker terhadap sel Raji (limfoma). Kultivasi S. platensis menggunakan media organik dengan fotoperiode 24 jam terang. Biomassa S. platensis diekstraksi menggunakan pelarut etanol, selanjutnya dianalisis fitokimia. Biomassa S. platensis juga diekstraksi menggunakan pelarut akuades untuk mendapatkan fikosianin. Analisis aktivitas antikanker dilakukan secara in vitro pada sampel biomass, ekstrak kasar dan fikosianin. Nilai IC50 yang dihasilkan pada analisis antikanker terhadap sel Raji pada sampel biomassa kultur, biomassa komersial, ekstrak kasar dari biomassa kultur, ekstrak kasar dari biomassa komersial dan fikosianin masing-masing yaitu 166,61 ppm, 252,29 ppm, 424,84 ppm, 273,33 ppm dan 277,79 ppm. Kata kunci: antikanker, organik, sel Raji, Spirulina platensis

ABSTRACT JUHROTUL AENIAH Activity of Anticancer Lhymp Nodes (Lymphoma) by In Vitro from Spirulina platensis Cultivated in Organic Media. Supervised by IRIANI SETYANINGSIH and KUSTIARIYAH TARMAN. Spirulina platensis is a group of cyanobacteria microalgae containing active compounds and potential as anticancer. The purpose of this research is to determine the activity of anticancer of lymph nodes from biomass, crude extract and phycocyanin from S. platensis were cultivated in organic media. The steps of this research were cultivation, harvesting, extraction of bioactive compounds, extraction of phycocyanin and analyzed of anticancer activity to Raji cell (lymphoma). Cultivation of S. platensis used organic media with 24 hours of light photoperiod. The biomass of S. platensis was extracted using ethanol solvent, and then of active compound of extract was analyzed. The biomassa of S. platensis also was extracted using aquadest solvent for obtaining phycocyanin. The anticancer activity in vitro was carried out on the biomass, crude extract and phycocyanin. IC50 values of cultivated biomass, commercially biomass, crude extract from cultivated biomass, crude extract from commercially biomass and phycocyanin were respectively 166,61 ppm, 252,29 ppm, 424,84 ppm, 273,33 ppm dan 277,79 ppm. Keywords: anticancer, organic, Raji cell, Spirulina platensis

2

3

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

4

5

AKTIVITAS ANTIKANKER KELENJAR GETAH BENING (LIMFOMA) SECARA IN VITRO DARI Spirulina platensis YANG DIKULTIVASI DALAM MEDIA ORGANIK

JUHROTUL AENIAH

Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Departemen Teknologi Hasil Perairan

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017

1

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena dengan rahmat dan karunia-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Aktivitas Antikanker Kelenjar Getah Bening (Limfoma) secara In Vitro dari Spirulina platensis yang Dikultivasi pada Media Organik”. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan gelar sarjana di Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penuisan skripsi ini, terutama kepada: 1 Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS selaku pembimbing I dan ketua Komisi Pendidikan Departemen Teknologi Hasil Perairan, atas ilmu, bimbingan dan saran yang diberikan kepada penulis. 2 Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi selaku pembimbing II atas ilmu, arahan dan saran yang telah diberikan kepada penulis. 3 Dr Desniar, SPi MSi selaku dosen penguji dan dosen pembimbing akademik atas bimbingan dan saran yang diberikan kepada penulis. 4 Dr Eng Uju, SPi MSi selaku dosen perwakilan Komisi Pendidikan Departemen Teknologi Hasil Perairan dan Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan yang telah bersedia memberikan masukan dalam penulisan skripsi. 5 Seluruh dosen dan staf Departemen Teknologi Hasil Perairan atas arahan dan bantuannya. 6 Orang tua (H. Abdul Malik dan Hj. Euis Junaeroh) dan keluarga tercinta yang telah memberikan do’a, dukungan dan semangat. 7 Teman-teman Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan 2, khususnya tim mikroalga, atas semangat, bantuan dan kerja samanya. 8 Keluarga besar THP 49, 50 dan 51 yang telah memberikan dukungan, saran dan semangat kepada penulis. Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih banyak kekurangan. Penulis mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun untuk perbaikan skripsi ini. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukannya. Bogor, Februari 2017

Juhrotul Aeniah

1

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiv PENDAHULUAN .............................................................................................. 1 Latar Belakang ................................................................................................ 1 Perumusan Masalah ........................................................................................ 2 Tujuan Penelitian ............................................................................................ 2 Manfaat Penelitian .......................................................................................... 2 Ruang Lingkup Penelitian .............................................................................. 2 METODE PENELITIAN .................................................................................... 3 Waktu dan Tempat Penelitian ......................................................................... 3 Alat dan Bahan ............................................................................................... 3 Prosedur Penelitian ......................................................................................... 3 Prosedur Analisis ............................................................................................ 6 Analisis Data ................................................................................................... 8 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 8 Biomassa S. platensis ..................................................................................... 8 Ekstrak Kasar S. platensis .............................................................................. 9 Konsentrasi dan Rendemen Fikosianin .......................................................... 13 Aktivitas Antikanker secara In Vitro terhadap Sel Raji ................................. 14 KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 17 Kesimpulan .................................................................................................... 17 Saran ............................................................................................................... 17 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 17 LAMPIRAN ........................................................................................................ 21 RIWAYAT HIDUP ............................................................................................. 27

2

DAFTAR TABEL 1 Rendemen ekstrak kasar S. platensis ....................................................... 10 2 Komponen aktif S. platensis ...................................................................... 11 3 Nilai IC50 S. platensis terhadap sel Raji ..................................................... 15

DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Diagram alir prosedur penelitian ................................................................ Sel Spirulina platensis ................................................................................. Kultivasi S. platensis ................................................................................... Biomassa S. platensis .................................................................................. Ekstrak kasar S. platensis .......................................................................... Hasil uji fitokimia ..................................................................................... Fikosianin S. platensis ............................................................................... Reaksi pembentukan kristal formazan dari MTT ...................................... Morfologi sel Raji .....................................................................................

4 8 9 9 11 12 13 14 16

DAFTAR LAMPIRAN 1 Komposisi media organik (Urea, RI1 dan Plant Catalyst) ......................... 21 2 Perhitungan nilai IC50.................................................................................. 22 3 Dokumentasi penelitian............................................................................... 26

1

PENDAHULUAN Latar Belakang Spirulina platensis adalah mikroalga hijau biru termasuk ke dalam kelompok cyanobacteria, mikroalga berfilamen dan multiseluler. Mikroalga tersebut menghasilkan komposisi kimia yang bernilai tinggi seperti protein, asam lemak esensial (asam linoleat γ), vitamin, mineral serta pigmen baik beta-karoten, klorofil a maupun fikosianin (Chopra dan Bishnoi 2008). Kandungan protein pada S. platensis sebesar 46-63%, karbohidrat 8-14% dan lipid 4-9% (Guedes et al. 2015). Agustini et al. (2015) melaporkan bahwa S. platensis memiliki komponen aktif di antaranya komponen fenolik, triterpenoid dan steroid, flavonoid serta saponin. Pigmen yang terkandung pada S. platensis menurut Marrez et al. (2013) bermacam-macam diantaranya klorofil 147,43 µg/mL, fikosianin 55,4 µg/mL, allofikosianin 51 µg/mL dan fikoeritrin 39,6-44,1 µg/mL. Komposisi kimia yang terkandung pada S. platensis tergantung pada media yang digunakan. Hasil penelitian Nor et al. (2015) menunjukkan bahwa kandungan klorofil lebih tinggi pada S. platensis yang dikultivasi menggunakan amonium nitrat sebagai sumber nitrogen dibandingkan dengan urea. Media kultivasi S. platensis terdiri dari air, nutrisi, CO2, cahaya, nitrogen dan oksigen. Nutrisi utama yang diperlukan meliputi nitrogen, fosfor, potassium dan magnesium (Belay 2002). Salah satu media yang dapat digunakan untuk kultivasi S. platensis menurut Fahleny et al. (2014) yaitu media organik. Pupuk organik yang digunakan terdiri atas pupuk urea, pupuk organik RI 1 dan pupuk Plant Catalyst. Penggunaan media organik sebagai media kultivasi S. platensis menurut hasil penelitian Astriandari (2015) menghasilkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan penggunaan media Walne. Hasil penelitian Agustian et al. (2013) menunjukkan bahwa S.platensis berpotensi sebagai penghambat sel tumor atau kanker dengan nilai LC50 sebesar 91,2 ppm (<1000 ppm) pada ekstrak pigmen kasar fraksi dietil eter S. platensis. Pirenantyo dan Limantara (2008) menyatakan bahwa S. platensis berpotensi meningkatkan sistem imun yang memiliki keuntungan dapat menekan sel kanker. Hasil penelitian Ismail et al. (2009) menunjukkan bahwa S. platensis dapat mereduksi kanker hati 80-20%. Syahril et al. (2011) melaporkan bahwa ekstrak kasar etanol S. platensis dapat menghambat sel kanker payudara (MCF7) pada konsentarsi 85 µg/mL. Penyakit kanker merupakan salah satu penyebab kematian di Indonesia dan merupakan permasalahan penyakit yang sangat besar. Setiap tahun diperkirakan 12 juta orang di dunia menderita kanker dan 7,6 juta diantaranya meninggal dunia. Jenis kanker yang sering ditemukan di Indonesia yaitu kanker payudara, leher, paru-paru, hati, ovarium dan kanker kelenjar getah bening (kanker limfoma). Kanker kelenjar getah bening berada pada urutan ke-10 penyakit kanker terbanyak di Indonesia pada tahun 2010 dan 2011 (Depkes 2015). Kanker kelenjar getah bening adalah penyakit kanker dari sistem limfatik (kelenjar getah bening, kelenjar timus, limpa dan sumsum tulang).

2

Pengobatan pada penyakit kanker biasanya dilakukan dengan cara operasi, radiasi dan kemoterapi. Pengobatan dengan cara tersebut menimbulkan efek samping, supresi sumsum tulang, gangguan saraf dan kerusakan fertilisasi. Negara maju atau negara berkembang cenderung kembali menggunakan obat alam untuk penyembuhan berbagai penyakit. Salah satu bahan alami yang mempunyai potensi sebagai antikanker yaitu S. platensis. Media yang biasa digunakan untuk pertumbuhan S. platensis yaitu media Walne dan Zarrouk, namun harganya mahal, sehingga perlu adanya media pengganti yang lebih murah salah satunya media organik. Fahleny (2014) melaporkan bahwa S. platensis dapat ditumbuhkan pada media organik dan menghasilkan komponen aktif flavonoid, steroid, fenol hidrokuinon dan saponin. S. platensis yang ditumbuhkan dalam media organik memiliki aktivitas antioksidan lebih tinggi dibandingkan media Walne dengan nilai IC50 masing-masing 250,196 ppm dan 408,719 ppm (Astriandari 2015). S. platensis yang ditumbuhkan dalam media organik belum diketahui aktivitasnya sebagai antikanker, sehingga perlu kajian terhadap aktivitas antikanker tersebut.

Perumusan Masalah Kultivasi S. platensis dapat menggunakan media Walne tetapi harga dari media tersebut cukup mahal, sehingga perlu adanya media baru yang dapat digunakan sebagai media untuk kultivasi S. platensis. Salah satu media yang dapat digunakan untuk kultivasi S. platensis yaitu media organik. Aktivitas terhadap penghambatan kanker kelenjar getah bening dari S. platensis yang ditumbuhkan dalam media organik belum diketahui. Biomassa, ekstrak kasar maupun fikosianin diduga memiliki aktivitas antikanker kelenjar getah bening yang berbeda sehingga perlu dilakukan penelitian.

Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah menentukan aktivitas antikanker kelenjar getah bening dari biomassa, ekstrak kasar dan fikosianin dari S. platensis yang dikultivasi dalam media organik.

Manfaat Penelitian Hasil penelitian yang diperoleh dapat digunakan untuk penyediaan biomedis antikanker kelenjar getah bening dengan bahan baku lokal. Penggunaan media organik juga dapat dikembangkan untuk substitusi media pertumbuhan S. platensis. Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini mencakup kultivasi S. platensis pada media organik, ekstraksi biomassa S. platensis, ekstraksi fikosianin, uji fitokimia dan uji aktivitas antikanker secara in vitro.

3

METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-Oktober 2016, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan II, Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan Departemen Teknologi Hasil Perairan, Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan, IPB dan Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa Primata, IPB. Metode penelitian terdiri atas kultivasi S. platensis, pemanenan biomassa, ekstraksi biomassa dan ekstraksi pigmen fikosianin, uji fitokimia, dan uji antikanker kelenjar getah bening (limfoma).

Alat dan Bahan Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu perlengkapan kultivasi, lampu TL (Philips 40 watt), oven (EHRET TK/L 4067), nylon mesh ukuran 20 mikron, rotary evaporator, spektrofotometer UV-Vis (Spektronik UV Vis IR-U-2500), sentrifuse (Centurion Scientific Ltd), refrigerator (Sharp), mikropipet (Eppendorf), magnetic stirrer (79-1 Magnetic Stirrer with Heater), incubator (BINDER) dan Microplate reader (i Mark Microplate Reader S/N 11421). Bahan-bahan yang digunakan yaitu bibit S. platensis dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau (BBPBAP Jepara), media Walne, media organik (pupuk Urea, Plant Catalyst dan RI1), air 15 ppt, akuades, etanol p.a (Merck), reagen uji komponen aktif, media Roswell Park Memorial Institute (RPMI), streptomisin, penisilin, Fetal Bovine Serum (FBS), reagen Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) dan sel Raji (sel kanker kelenjar getah bening yang didapatkan dari limfoma Burkitt atau sejenis kanker yang terdapat pada limfosit B) (American Type Culture Collection, ATCC CCL-86).

Prosedur Penelitian Prosedur penelitian meliputi beberapa tahapan. Tahap 1 penyegaran, kultivasi, pemanenan dan pengeringan biomassa S. platensis. Tahap 2 ekstraksi fikosianin dan pengukuran konsentrasi serta rendemen. Tahap 3 ekstraksi biomassa S. platensis dan uji fitokimia. Analisis yang dilakukan yaitu pengujian aktivitas antikanker kelenjar getah bening pada sampel biomassa kering, ekstrak kasar dan fikosianin. Diagram alir penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 1.

4

Bibit S. platensis

Penyegaran bibit

Kultivasi Pemanenan

Biomassa basah

Pengeringan pada suhu 40 oC selama 24 jam

Biomassa kering

Biomassa komersial

Uji aktivitas antikanker

Ekstraksi biomassa

Ekstraksi fikosianin

Ekstrak kasar

Fikosianin

- Analisis komponen aktif: alkaloid, flavonoid, steroid, fenol hidrokuinon dan saponin - Uji aktivitas antikanker

- Pengukuran konsentrasi dan rendemen fikosianin - Uji aktivitas antikanker

Gambar 1 Diagram alir penelitian

Penyegaran, Kultivasi, Pemanenan dan Pengeringan Biomassa S. platensis Penyegaran S. platensis Penyegaran S. platensis dilakukan menggunakan wadah bervolume 2,5 L. Peralatan untuk penyegaran S. platensis dan air laut bersalinitas 15 ppt dilakukan sterilisasi menggunakan metode penyinaran dengan sinar ultraviolet selama 30

5

menit. Jumlah air yang digunakan sebanyak 1600 mL karena total volume kultur yaitu 2 L. Air yang telah disterilkan ditambahkan media Walne sebanyak 2 mL dan bibit sebanyak 20% dari total volume kultur yaitu 400 mL, setelah semua bahan ditambahkan selanjutnya dilakukan pengadukan agar media, air dan bibit tercampur secara merata. Penyegaran dilakukan dengan pencahayaan (fotoperiode) 24 jam terang dan aerasi secara terus-menerus selama tujuh hari. Kultivasi S. platensis Kultivasi S. platensis mengacu pada penelitian Astriandari (2015) yaitu dilakukan pada wadah berukuran 15 L menggunakan media organik dan air dengan salinitas 15 ppt. Komposisi media organik dapat dilihat pada Lampiran 1. Metode pengerjaan kultivasi hampir sama dengan penyegaran S. platensis, namun media yang digunakan berbeda. Media yang digunakan pada kultivasi yaitu media organik terdiri dari urea, pupuk RI1 dan Plant Catalyst. Kultivasi menggunakan media sebanyak 1 mL/L dan konsentrasi bibit yang digunakan yaitu 20% dari total volume kultur. Aerasi dilakukan secara terus-menerus dan intensitas cahaya yang diberikan sebesar 3000 lux. Pemanenan biomassa dilakukan pada hari ke-12 dengan nilai Optical Density (OD) 0,5. Pemanenan Biomassa Pemanenan biomassa S. platensis dengan media organik mengacu pada penelitian Astriandari (2015) yang dilakukan pada hari ke-12. Pemanenan S. platensis dilakukan dengan cara penyaringan menggunakan nylon mesh ukuran 20 mikron. Biomassa yang dihasilkan selanjutnya dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 40 oC selama 24 jam. Biomassa S. platensis yang diperoleh dilakukan ekstraksi biomassa dan ekstraksi pigmen (fikosianin) serta analisis aktivitas antikanker kelenjar getah bening. Ekstraksi Pigmen Fikosianin Ekstraksi pigmen fikosianin menggunakan air yang mengacu pada penelitian Silveira et al. (2007). Ekstraksi fikosainin dilakukan dengan dua kali ulangan. Biomassa S. platensis dilarutkan ke dalam akuades dengan perbandingan sampel:akuades yaitu 1:25 b/v. Sampel yang digunakan sebanyak 0,4 g dilarutkan ke dalam 10 mL akuades dan dihomogenkan. Sampel disimpan pada suhu 4 oC selama 3 hari selanjutnya disentrifugasi satu kali dengan kecepatan 3500 rpm pada suhu 4 oC selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan dilakukan penghitungan konsentrasi dan rendemen fikosianin serta analisis aktivitas antikanker kelenjar getah bening. Ekstraksi Biomassa Kering S. platensis Ekstraksi S. platensis dilakukan pada biomassa hasil kultur dan komersial dengan dua kali ulangan. Metode ekstraksi yang dilakukan mengacu pada Syahril et al. (2011) biomassa S. platensis hasil kultur dan komersial ditimbang sebanyak 3 g dan dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer yang berisi pelarut sebanyak 60 mL (sampel: pelarut 1:20 b/v). Sampel dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan magnetic stirrer selama 3x24 jam dan setiap 24 jam dilakukan penyaringan. Filtrat hasil penyaringan disimpan dalam lemari es pada suhu 4 oC, residu yang dihasilkan ditambahkan pelarut etanol kembali untuk dilakukan ekstraksi kembali. Filtrat yang dihasilkan diuapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40-48 oC selama 2 jam, disimpan pada botol vial

6

pada suhu dingin untuk analisis fitokimia serta analisis aktivitas antikanker kelenjar getah bening.

Prosedur Analisis Pengukuran Konsentrasi dan Rendemen Fikosianin Pengukuran konsentrasi dan rendemen fikosianin dilakukan dengan cara mengencerkan fikosianin dengan pelarutnya (akuades). Sampel kemudian diukur konsentrasinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 615 nm dan 652 nm. Konsentrasi fikosianin (CPC) dihitung menggunakan persamaan Bennet dan Bogoard (1973), sedangkan rendemen fikosianin mengacu pada Silveira et al. (2007) yaitu: (OD 615) – 0,474 (OD 652) CPC = 5,34 CPC. V Rendemen fikosianin = DB Keterangan: CPC OD615 OD 652 V DB

: konsentrasi fikosianin (mg/mL) : Optical Density pada panjang gelombang 615 nm : Optical Density pada panjang gelombang 652 nm : volume larutan fikosianin (mL) : berat biomassa kering (g)

Analisis Komponen Aktif Spirulina platensis hasil kultivasi dan komersial yang telah diekstraksi kemudian dilakukan uji fitokimia untuk mengetahui keberadaan senyawa aktif yang terdapat pada sampel. Pengujian fitokimia mengacu pada Harborne (1987). Analisis komponen aktif yang dilakukan pada penelitian ini meliputi deteksi senyawa alkaloid, fenol hidrokuinon, steroid, flavonoid dan saponin. 1 Alkaloid Sebanyak 5 mg ekstrak S. platensis, masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan beberapa tetes H2SO4 2 N dan dikocok hingga memberi lapisan atas dan bawah. Larutan dibagi menjadi 3 bagian, pada tabung pertama ditambahkan 1 tetes Mayer, adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan. Tabung kedua ditambah 1 tetes pereaksi Dragendorff dan terbentuknya endapan menandakan adanya alkaloid. Tabung ketiga kemudian ditambah 1 tetes pereaksi Wagner dan terbentuknya endapan coklat menandakan adanya alkaloid. 2 Fenol hidrokuinon Sebanyak 1 g ekstrak S. platensis masing-masing ditambahkan 20 mL etanol 70%. Larutan tersebut diambil sebanyak 1 mL ditambahkan dua tetes FeCl3 5%, lalu diaduk sampai homogen. Adanya senyawa fenol hidrokuinon ditandai dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru. 3 Steroid Sebanyak 5 mg ekstrak S. platensis masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 2 mL kloroform dan 10 tetes anhidra asetat serta

7

3 tetes asam sulfat pekat. Jika terbentuk warna biru atau hijau menandakan adanya steroid. 4 Uji flavonoid Sebanyak 5 mg ekstrak S. platensis, masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi. Serbuk Mg sebanyak 0,10 mg ditambahkan pada ekstrak tersebut dan 0,40 mL amil alkohol (HCl 37% + etanol 95% dengan volume sama) lalu ditambahkan 4 mL alkohol dan dikocok sampai homogen. Uji positif pada flavonoid yaitu terbentuknya warna kuning dan jingga pada lapisan amil alkohol. 5 Uji saponin Sebanyak 5 mg ekstrak S. platensis, masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan air panas lalu dikocok dan didiamkan selama 30 menit. Sebanyak 1 tetes HCl 2 N ditambahkan pada larutan tersebut. Uji positif yaitu busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang setelah ditambahkan HCl 2 N. Analisis Aktivitas Antikanker Kelenjar Getah Bening Uji aktivitas antikanker dilakukan secara in vitro mengacu pada Prasad et al. (2009) menggunakan metode MTT assay dengan reagen garam Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide. Sel yang digunakan pada penelitian ini yaitu sel Raji. Media yang digunakan untuk menumbuhkan sel tersebut yaitu campuran RPMI 1640, FBS 10%, penisilin 1% dan streptomisin 1%. Sel yang telah ditambahkan media diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Sel Raji yang telah diinkubasi, dipipet sebanyak 5000 sel/sumur pada mikroplate yang berisi 96 sumur dan ditambahkan sampel sebanyak 50 µL (konsentrasi biomassa kultur, biomassa komersial dan fikosianin 250, 125 dan 50 ppm, sedangkan ekstrak kultur dan ekstrak komersial 500, 125 dan 25 ppm), kemudian diinkubasi selama 48 jam. Uji MTT dilakukan setelah 48 jam inkubasi dengan menambahkan MTT sebanyak 10 μL/sumur dan diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37 °C dan akan membentuk kristal formazan. Kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dalam etanol sebanyak 100 µL/sumur. Intensitas warna yang dihasilkan diukur menggunakan Microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Nilai absorbansi yang dihasilkan selanjutnya dihitung persen penghambatannya menggunakan rumus di bawah ini. Penghambatan (%) =

bsorbansi kontrol- bsorbansi sampel bsorbansi kontrol

100

Keterangan: Absorbansi kontrol = Sel Raji + Media RPMI Absorbansi sampel = Sel Raji + Media RPMI+sampel

Nilai penghambatan yang dihasilkan kemudian dikonversi menjadi nilai IC50. Nilai IC50 adalah konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel sebesar 50%. Perhitungan nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linear y = ax +b, hubungan antara konsentrasi (ppm) sebagai sumbu X dan penghambatan (%) sebagai sumbu Y. Nilai IC50 diperoleh dengan memasukkan nilai y = 50 ke persamaan teresebut, sehingga dihasilkan nilai x sebagai nilai IC50. Perhitungan nilai IC50 dapat dilihat pada Lampiran 2.

8

Analisis Data Analisis data dalam penelitian ini dilakukan secara deskriptif. Data hasil penelitian diolah menggunakan Microsoft Excel 2010 untuk mendapatkan nilai rata-rata dan standar deviasi dari dua kali ulangan. Hasil ditunjukkan dalam bentuk tabel.

HASIL DAN PEMBAHASAN Biomassa S. platensis Spirulina platensis merupakan kelompok mikroalga yang termasuk ke dalam cyanobacteria serta diklasifikasikan ke dalam organisme prokariot. Mikroalga ini tersusun dari trikoma spiral, berfilamen dan multiseluler. Reproduksi S. platensis secara vegetatif dengan cara pembelahan biner (Tomaselli 2002). Ukuran diameter sel S. platensis menurut Ali dan Saleh (2012) yaitu 3-12 mikrometer. Morfologi sel S. platensis yang diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 kali dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Sel Spirulina platensis Istilah pertumbuhan dalam mikroorganisme biasanya mengacu pada perubahan hasil panen sel (pertambahan total massa sel) dan bukan perubahan individu organisme (Pelczar dan Chan 1986). Gambar 3 menunjukkan bahwa S. platensis mengalami pertumbuhan yang ditandai dengan perubahan warna dari agak hijau, hijau dan menjadi hijau tua. Warna hijau yang terbentuk menunjukkan adanya pertambahan jumlah biomassa S. platensis dan menandakan bahwa S. platensis mengalami pertumbuhan. Pengukuran pertumbuhan pada S. platensis salah satunya dapat dilakukan dengan pengukuran absorbansi atau Optical Density (OD) menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 670 nm. Nilai OD kultur S. platensis pada hari ke-0 dalam penelitian ini sebesar 0,2 dan pada hari ke-12 (waktu pemanenan) meningkat menjadi 0,5. Nilai peningkatan OD menunjukkan bahwa S. platensis mengalami pertumbuhan. Gambar kultivasi S. platensis menggunakan media organik dapat dilihat pada Gambar 3.

9

(a) (b) (c) Gambar 3 Kultivasi S. platensis (a) hari ke-0, (b) hari ke-3, (c) hari ke-12 Pemanenan dilakukan pada hari ke-12 karena pada hari tersebut sudah mencapai fase akhir dari fase pertumbuhan eksponensial atau logaritmik dan nilai OD ≥ 0,5 ( striandari 2015). Biomassa basah yang dihasilkan dilakukan pengeringan menggunakan oven dengan suhu 40 oC selama 24 jam. Rendemen biomassa kering yang dihasilkan pada umur panen 12 hari 0,17±0,00 g/L. Kenampakan biomassa basah dan biomassa kering yang dihasilkan dapat dilihat pada Gambar 4.

(a) (b) Gambar 4 Biomassa S. platensis (a) biomassa basah, (b) biomassa kering Astriandari (2015) melaporkan bahwa rendemen biomassa S. platensis media Walne lebih besar dibandingkan media organik. Hasil penelitian Wulandari et al. (2016) menunjukkan bahwa rendemen biomassa S. platensis yang dikultivasi pada media Walne sebesar 0,44 g/L. Perbedaan besarnya rendemen pada biomassa S. platensis dipengaruhi oleh komponen nutrisi dalam media. Komponen nutrisi pada media Walne lebih lengkap dibandingkan dengan media organik. Menurut Resmawati et al. (2012) jumlah nutrisi yang tersedia dengan jumlah yang optimal pada media kultur, akan menghasilkan pertumbuhan S. platensis yang maksimal.

Ekstrak Kasar S. platensis Rendemen Ekstrak Kasar Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Metode yang digunakan yaitu maserasi dengan

10

pelarut etanol. Rendemen ekstrak kasar S. platensis yang dihasilkan dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Rendemen ekstrak kasar S. platensis Sampel Berat ekstrak Rendemen (%) Bentuk (g) Biomassa kering 0,29±0,01 9,65±0,49 Pasta kultur Biomassa kering 0,32±0,32 2,93±0,31 Pasta komersial

Warna Hijau tua Hijau tua

Rendemen ekstrak biomassa kultur lebih besar dibandingkan ekstrak biomassa komersial. Bentuk ekstrak pada kedua sampel yaitu pasta, artinya ekstrak berbentuk pasta dan lengket (berminyak). Warna yang dihasilkan dari kedua sampel yaitu hijau tua karena biomassa S. platensis berwarna hijau dan setelah dievaporasi menjadi ekstrak warnanya menjadi hijau pekat (hijau tua). Rendemen yang dihasilkan dari proses ekstraksi menurut Chew et al. (2011) tergantung pada metode yang digunakan, ukuran partikel bahan, kondisi waktu penyimpanan, lama waktu ekstraksi dan perbandingan jumlah pelarut terhadap sampel. Kedua sampel yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan metode, lama waktu ekstraksi dan perbandingan jumlah pelarut terhadap sampel dengan perlakuan yang sama. Perbedaan jumlah rendemen pada kedua sampel diduga karena kadar air pada kedua sampel berbeda. Kadar air pada biomassa kultur lebih besar dibandingkan pada biomassa komersial dengan nilai masing-masing 13,74±0,02% dan 8,46±0,01%. Besarnya kandungan kadar air pada biomassa kultur menghasilkan rendemen ekstrak kasar lebih besar dibandingkan sampel biomassa komersial. Hal ini diduga kadar air dari biomassa kultur sulit diuapkan ketika proses penguapan menggunakan rotary evaporator, sehingga masih terdapat pada ekstrak kasar. Etanol merupakan senyawa polar yang biasa digunakan untuk ekstraksi suatu sampel. Penggunaan pelarut etanol pada penelitian ini diharapkan komponen yang bersifat polar dapat terekstrak dengan baik. Etanol merupakan pelarut polar yang memiliki kemampuan melarutkan molekul aktif dan direkomendasikan oleh konsorsium obat herbal di dunia untuk mengekstrak obat herbal sebelum diproduksi dalam bentuk obat modern. Pelarut etanol digunakan untuk mengekstraksi metabolit sekunder yang belum diketahui strukturnya dan untuk tujuan skrining. Daya ekstraksi pelarut ini sangat luas sehingga semua metabolit sekunder terekstrak dalam tiga kali maserasi (Azis 2014). Perbandingan jumlah sampel dengan pelarut sebanyak 1:20. Semakin besar perbandingan sampel dengan pelarut, maka akan semakin banyak hasil yang akan diperoleh. Metode maserasi digunakan pada penelitian ini karena metodenya sederhana. Maserasi dapat dilakukan pada sampel yang kurang tahan terhadap panas sehingga sangat tepat untuk ekstraksi biomassa S. platensis yang kurang tahan terhadap panas. Kenampakan ekstrak kasar yang dihasilkan dapat dilihat pada Gambar 5.

11

Gambar 5 Ekstrak kasar S. platensis Komponen Aktif Ekstrak Etanol S. platensis Komponen aktif adalah komponen kimia yang menghasilkan aktivitas biologis di dalam tubuh. Identifikasi komponen aktif pada ekstrak kasar S. platensis dilakukan menggunakan uji fitokimia. Agustini et al. (2015) melaporkan bahwa ekstrak etanol S. platensis memiliki komponen aktif triterpenoid/steroid, flavonoid, saponin dan fenolik. Hasil analisis komponen aktif ekstrak kasar S. platensis pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Komponen aktif S. platensis Komponen aktif Alkaloid Dragendorff Wagner Meyer Flavonoid Steroid Fenol hidrokuinon Saponin

Ekstrak hasil kultur

+ + + +

Ekstrak komersial

+ + + -

Hasil uji komponen aktif pada ekstrak kasar S. platensis pada penelitian ini sesuai dengan hasil penelitian Agustini et al. (2015) yaitu adanya senyawa flavonoid, steroid, fenol hidrokuinon dan saponin pada ekstrak kasar S. platensis hasil kultur. Hal yang berbeda ditunjukkan pada ekstrak kasar S. platensis komersial, hanya terdapat flavonoid, steroid dan fenol hidrokuinon. Kandungan senyawa pada suatu bahan dalam hal ini dikarenakan perbedaan media yang digunakan ketika kultivasi. Adanya kandungan saponin pada ekstrak kultur diduga karena adanya hormon giberelin pada media yang digunakan. Menurut Khristyana et al. (2005) melaporkan bahwa hormon giberelin dapat menyebabkan peningkatan laju pertumbuhan tanaman, diikuti dengan peningkatan kadar saponin. Kenampakan hasil uji fitokimia dapat dilihat pada Gambar 6. Flavonoid merupakan subkelompok dari kelas polifenol dan turunan dari 2-phenyl-1-benzopyran-4-one (Kar et al. 2006). Kedua ekstrak kasar etanol S. platensis pada penelitian ini menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan terbentuknya warna kuning. Menurut Kannan et al. (2014) ekstrak kasar metanol S. platensis positif mengandung senyawa flavonoid. Total flavonoid pada serbuk S. platensis menurut hasil penelitian Agustini et al. (2015) sebesar 7,5 mg/g yang

12

diekstraksi menggunakan pelarut etanol. Flavonoid termasuk ke dalam senyawa polifenol, metabolit sekunder dari tanaman dan memiliki aktivitas sebagai antikanker. Adanya aktivitas antikanker dari senyawa flavonoid ini karena secara umum flavonoid memiliki struktur kimia yang terdiri dari flavon, flavonol, flavonois, flavonon, flavononol dan isoflavon (Ravishankar et al. 2013).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Gambar 6 Hasil uji fitokimia (a) uji alkaloid, (b) flavonoid, (c) fenol hidrokuinon, (d) steroid, (e) saponin Flavonoid mengandung kuersetin yang berasal dari subkelas flavonol. Kuersetin, genistein atau flavopiridol dapat dijadikan sebagai bahan untuk obat kanker. Menurut Ren et al. (2003) flavonoid sebagai antikanker pada payudara, prostat, leukemia dan melanoma. Mekanisme flavonoid sebagai antikanker menurut Ren et al. (2003) yaitu penghambatan aktivitas DNA topoisomerase I/II, penurunan ekspresi gen Bcl-2 dan Bcl-xl serta aktivasi endonuklease. Saponin adalah senyawa polar, sehingga mudah untuk diekstraksi menggunakan pelarut polar. Ekstrak kasar etanol S. platensis hasil kultur pada penelitian ini menunjukkan hasil positif, sedangkan pada ekstrak komersial menunjukkan hasil negatif. Perbedaan ini diduga karena media yang digunakan berbeda. Media yang digunakan pada kultur organik dalam penelitian ini mengandung pupuk urea, pupuk RI1 dan Plant Catalyst. Salah satu komposisi di dalam pupuk RI1 yaitu adanya hormon giberelin. Khristyana et al. (2005) melaporkan bahwa hormon giberelin dapat menyebabkan peningkatan pembelahan sel yang diikuti perbanyakan diri, sehingga terjadi peningkatan laju pertumbuhan tanaman, diikuti dengan peningkatan kadar saponin tanaman. Produksi saponin pada suatu bahan menurut Fitrianah et al. (2012) dipengaruhi oleh komposisi media tanam. Semakin banyak pemberian komposisi media tanam (sumber nitrogen, fosfor dan kalium) maka semakin banyak pula kandungan saponin. Menurut Kannan et al. (2014) ekstrak kasar metanol S. platensis positif terhadap kandungan saponin. Senyawa ini menurut Yildirim dan Kutlu (2015) secara stuktural memiliki satu atau lebih gugus glikosida hidrofilik dan dapat terlibat dalam replikasi DNA serta mencegah proliferasi sel kanker. Menurut Man et al. (2010) saponin dibedakan menjadi 11 kelas, salah satu kelasnya yaitu furostanes yang mengandung metil protogracilin yang memiliki aktivitas sebagai antikanker kolon dan leukemia. Ekstrak kasar etanol S.platensis dalam penelitian ini positif terhadap senyawa steroid. Uji positif pada steroid ditandai dengan terbentuknya warna hijau pada

13

sampel. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Agustini et al. (2015) yang menyatakan bahwa ekstrak kasar etanol S. platensis positif terhadap senyawa steroid/triterpenoid. Steroid terekstraksi pada pelarut polar karena momen dipol senyawa polar dan semi polar dapat menginduksi molekul non polar yang tidak memiliki dipol, sehingga senyawa non polar dapat larut pada pelarut polar dan semi polar. Salvador et al. (2012) melaporkan bahwa steroid dapat digunakan sebagai agen antikanker, karena memiliki enzim penghambat di antaranya aromatase dan sulfatase inhibitor untuk kanker payudara. Mekanisme steroid sebagai antikanker menurut Yan et al. (2009) yaitu menginduksi apoptosis (kematian sel terprogram) sel tumor. Fenol hidrokuinon pada penelitian ini positif yang ditandai dengan terbentuknya warna hijau. Warna yang terbentuk berasal dari fenolat besi, dan reaksi ini hanya dapat berlangsung dalam suasana asam lemah atau netral (Harborne 1987). Kannan et al. (2014) melaporkan bahwa ekstrak kasar metanol S. platensis positif mengandung senyawa fenol. Total fenol ekstrak kasar etanol S. platensis menurut Agustini et al. (2015) sebesar 119,43 kuersetin/g ekstrak. Menurut Fahleny et al. (2014) serbuk S. platensis mengandung senyawa fenol hidrokuinon. Total fenol menurut Huang et al. (2005) berkorelasi dengan aktivitas antioksidan.

Konsentrasi dan Rendemen Fikosianin Spirulina memiliki pigmen protein salah satunya yaitu fikosianin. Fikosianin merupakan pigmen biru yang dapat larut dalam air serta kandungannya mencapai 20% dari protein. Serapan maksimum fikosianin pada panjang gelombang 615-620 nm (Cohen 2002). Aplikasi fikosianin dapat digunakan sebagai pewarna alami pada makanan dan kosmetik. Fikosianin dapat digunakan untuk pewarna alami berbagai makanan misalnya permen karet, jelly, es krim, dan minuman (Christaki et al. 2015). Aplikasi fikosianin dalam bidang kosmetik salah satunya untuk pembuatan eye shadow (Ryu et al. 2015). Kenampakan fikosianin dari S. platensis hasil kultur dapat dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7 Fikosianin S. platensis Ekstraksi fikosianin pada penelitian ini dilakukan pada sampel S. platensis hasi kultur menggunakan pelarut akuades. Ekstraksi fikosianin pada biomassa komersial tidak dilakukan karena hasil ekstraksi yang didapatkan tidak menunjukkan perubahan warna menjadi biru. Hal ini diduga fikosianin tidak

14

terekstrak pada biomassa komersial. Analisis yang dilakukan pada fikosianin yaitu perhitungan konsentrasi dan rendemen fikosanin. Konsentrasi fikosianin yang dihasilkan 0,82±0,08 mg/mL dan rendemen sebesar 20,62±2,10 mg/g. Nilai konsentrasi fikosianin kasar dalam penelitian ini menunjukkan hasil yang lebih besar dibandingkan dengan hasil penelitian Walter et al. (2011) yaitu 0,237 mg/mL dan mendekati nilai konsentrasi fikosianin yang telah dimurnikan dengan cara presepitasi menggunakan ammonium sulfat sebesar 0,8-1,1 mg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi fikosianin kasar dalam penelitian ini menghasilkan konsentrasi yang tinggi dan hampir mendekati nilai konsentrasi pada fikosianin yang dimurnikan. Jumlah konsentrasi dan rendemen pada fikosianin dipengaruhi oleh media yang digunakan ketika kultivasi, pelarut, dan metode ekstraksi. Keberadaan nitrogen dalam media sebagai unsur makro akan memengaruhi jumlah fikosianin yang dihasilkan. Menurut Chrismadha et al. (2006) kadar fikosianin pada media dengan jumlah nitrogen sebesar 22,5 mM menghasilkan rendemen fikosianin yang optimum dan lebih tinggi yaitu 1,32% dari biomassa, dibandingkan dengan konsentrasi 15 mM hanya 0,8% dari biomassa. Metode ekstraksi yang digunakan juga memengaruhi kadar fikosianin dalam bahan. Kamble et al. (2013) melaporkan bahwa dengan metode maserasi menghasilkan konsentrasi fikosianin sebesar 0,57 mg/mL. Pigmen biru pada fikosianin tidak tahan terhadap suhu dan cahaya yang tinggi sehingga aplikasinya hanya pada suhu rendah. Fikosianin juga berpotensi untuk diaplikasikan pada bidang farmasi. Hal ini didukung oleh penelitian Yong et al. (2001) yang menyatakan bahwa fikosianin dapat menghambat pertumbuhan sel HeLa sampai 31% pada konsentrasi 80 ppm.

Aktivitas Antikanker secara In Vitro terhadap Sel Raji Pengujian antikanker dalam penelitian ini dilakukan secara in vitro menggunakan metode MTT assay (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide). Prinsip dari metode ini yaitu mengukur aktivitas dehidrogenase mitokondria pada sel-sel hidup yang memiliki kemampuan untuk mengkonversi MTT menjadi formazan.

Gambar 8 Reaksi pembentukan Kristal formazan dari MTT Semua sampel dalam penelitian ini tergolong aktif dalam menghambat sel kanker Raji karena nilai IC50 di bawah 500 ppm. Machana et al. (2011) melaporkan bahwa suatu ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai antikanker jika nilai

15

IC50 > 500 ppm. Besarnya aktivitas antikanker S. platensis terhadap sel Raji dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Nilai IC50 S. platensis terhadap sel Raji Sampel Konsentrasi (ppm) Penghambatan(%) Biomassa kultur 250 59,80 125 48,60 50 31,58 Biomassa komersial 250 49,39 125 55,36 50 56,63 Fikosianin kultur 250 50,97 125 62,04 50 59,67 Ekstrak kultur 500 51,89 125 38,58 25 36,34 Ekstrak komersial 500 77,59 125 24,08 25 34,62

IC50 (ppm) 166,61

252,29

277,79

424,84

273,33

Biomassa kultur dalam penelitian ini memiliki aktivitas paling tinggi terhadap sel Raji dibandingkan sampel lain dengan nilai IC50 sebesar 166,61 ppm. Nilai ini menunjukkan bahwa untuk menghambat pertumbuhan 50% populasi pada sel Raji menggunakan biomassa kultur membutuhkan konsentrasi sebesar 166,61 ppm. Ekstrak kasar dan fikosianin S. platensis memiliki aktivitas yang lebih rendah dibandingkan pada biomassanya. Menurut Babadzhanov (2004) biomassa S. platensis memiliki kandungan asam amino, lipid dan vitamin. Lipid menurut Murray et al. (2015) memiliki potensi sebagai agen antikanker karena adanya Ω-6 (Polyunsaturated Fatty Acid atau PUFA) dalam lipid dapat bertransformasi menjadi hormon eikosanoid yang dapat mengatur proliferasi dan kematian sel tumor. Serbuk biomassa S. platensis yang dikultivasi menggunakan media organik menurut Fahleny et al. (2014) mengandung komponen aktif diantaranya flavonoid, fenol hidrokuinon, steroid dan saponin. Ekstrak kasar etanol S. platensis menurut Agustini et al. (2015) memiliki komponen aktif triterpenoid/steroid, flavonoid, saponin dan fenolik. Fikosianin merupakan protein yang memiliki komponen biokimia yang memiliki efek antikanker karena dapat menghambat COX-2 (Wan et al. 2016). Hasil penelitian Syahril et al. (2011) menunjukkan bahwa ekstrak etanol S. platensis efektif menghambat pertumbuhan sel kanker MCF7 (kanker payudara) pada konsentrasi 85 ppm. Abu Zaid et al. (2015) dalam penelitiannya menyatakan bahwa ekstrak air dari S. platensis menghasilkan nilai IC50 sebesar 18,8 ppm pada sel kanker HCT116 (kolon) dan 22,3 ppm pada sel kanker HepG2 (liver). Mekjaruskul et al. (2016) dalam penelitiannya menyatakan bahwa ekstrak etanol S. platensis menghasilkan nilai IC50 sebesar 700,28 ppm pada sel kanker MDA-MB-231 (kanker payudara) dan nilai IC50 pada sel HepG2 >800 ppm, sedangkan pada fikosianin dalam penelitian Liu et al. (2000) menghasilkan nilai IC50 sebesar 72,5 ppm pada sel K562 (leukemia). Diastuti et al. (2009)

16

melaporkan bahwa nilai IC50 pada ekstrak etanol daun Rhizopora mucronata terhadap sel Raji sebesar 649,36 ppm. Adanya penghambatan pada sel Raji diduga karena sampel memiliki komponen aktif. Hasil analisis fitokimia menunjukkan bahwa komponen aktif pada ekstrak kasar S. platensis hasil kultivasi menggunakan media organik yaitu flavonoid, steroid, saponin dan fenol hidrokuinon. Salah satu komposisi pada media organik yang digunakan yaitu adanya hormon giberelin. Menurut Khristyana (2005) hormon giberelin memengaruhi metabolisme asam nukleat yang berpengaruh terhadap sintesis protein dan mengatur aktivitas enzim. Sintesis protein akan meningkat dan memacu kerja enzim dalam proses metabolisme. Laju pertumbuhan akan meningkat seiring dengan meningkatnya metabolisme sehingga biosintesis metabolit sekunder juga meningkat. Pertumbuhan sel normal menjadi abnormal akibat mutasi sel limfosit (sel darah putih) pada sistem limfatik disebut kanker kelenjar getah bening. Salah satu sel kanker kelenjar getah bening yang dapat digunakan untuk pengujian kanker kelenjar getah bening yaitu sel Raji. Pengamatan morfologi sel Raji dilakukan pada perbesaran 400 kali dengan perbesaran maksimal 1000 kali. Kenampakan sel Raji pada kontrol negatif dan sel yang ditambahkan sampel dilihat pada Gambar 9 di bawah ini.

1 2

(A)

2

(B)

Keterangan: 1 = sel hidup 2 = sel mati

Gambar 9 Morfologi sel Raji (A) tanpa penambahan sampel, (B) penambahan sampel (Perbesaran 400x) Kenampakan sel Raji berwarna terang dan berbentuk bulat pada sel hidup, sedangkan sel Raji yang mati akan berwarna agak cokelat pudar dan agak redup. Puspitasari dan Ulfa (2009) melaporkan bahwa morfologi sel hidup tampak bersinar cemerlang dan batas membran dengan media akan kelihatan jelas, sedangkan sel mati tampak berbentuk bulat, gelap, tidak bercahaya dan membran selnya terlihat pecah atau agak samar. Sel Raji yang masih hidup menurut Diastuti et al. (2009) berwarna hijau terang dengan pengecatan DNA, sedangkan sel Raji yang mati berwarna jingga. Pengecatan DNA dilakukan untuk mengetahui adanya kematian sel yang telah diujikan atau apoptosis. Sel Raji yang mati tampak terlihat agak pudar pada semua sampel yang telah diinkubasi selama

17

48 jam. Sel yang mati diduga karena sampel mengandung komponen aktif seperti yang terlihat pada Tabel 2. Semua komponen aktif tersebut dapat berpotensi sebagai antikanker. Hasil penelitian Kurniasari et al. (2014) menunjukkan bahwa Spirulina sp. memiliki senyawa aktif flavonoid dan salah satu flavonoid yang teridentifikasi adalah kuersetin. Kuersetin merupakan suatu aglikon yang apabila berikatan dengan glikonnya akan menjadi suatu glikosida. Senyawa ini dapat beraksi sebagai antikanker dan memiliki aktivitas antioksidan yang dimungkinkan oleh komponen fenoliknya yang sangat reaktif.

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Aktivitas antikanker kelenjar getah bening terhadap sel Raji yang paling tinggi terdapat pada biomassa kultur dengan nilai IC50 sebesar 166,61 ppm. Aktivitas antikanker terhadap sel Raji pada sampel biomassa komersial menghasilkan nilai IC50 sebesar 252,29 ppm, fikosianin kultur 277,79 ppm, ekstrak kultur 424,84 ppm dan pada ekstrak komersial 273,33 ppm.

Saran Pemisahan komponen aktif perlu dilakukan agar dapat diketahui senyawa yang bertindak sebagai antikanker pada Spirulina platensis. Pengujian selanjutnya juga dapat dilakukan uji antikanker terhadap sel kanker jenis lain. Pembuktian uji aktivitas antikanker dapat dilakukan secara in vivo terhadap hewan percobaan secara langsung.

DAFTAR PUSTAKA Abu Zaid AA, Hammad DM, Sharaf EM. 2015. Antioxidant and anticancer activity of Spirulina platensis water extracts. International Journal of Pharmacology. 11(7):846-851. Agustian R, Yudiati E, Sedjati S. 2013. Uji toksisitas ekstrak pigmen kasar mikroalga S. platensis dengan metode uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Journal of Marine Research. 2(1):25-31. Agustini TW, Suzery M, Sutrisnanto D, Ma’ruf WF, Hadiyanto. 2014. Comparative study of bioactive substances extracted from fresh and dried Spirulina sp. Procedia Environmental Sciences. 23(2015):282-289. Ali SK, Saleh AM. 2012. Spirulina-an overview. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 4(3):9-15.

18

Astriandari A. 2015. Aktivitas antioksidan dari Spirulina platensis yang dikultivasi dalam media subtituen walne dengan diferensiasi fotoperiode [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Azis S. 2014. Senyawa Alam Metabolit Sekunder Teori, Konsep, dan Teknik Pemurnian. Yogyakarta (ID): Deepublish. hlm:78. Babadzhanov AS. 2004. Chemical Com-posotion of Spirulina platensis cultivated in Uzbekistan. Chemistry of Natural Compounds. 43:21-27. Belay A. 2002. Spirulina platensis (Arthosphira): Physiology, Cell-Biology and Biotechnology. Vonshak A, editor. London (UK): Taylor and Francis e-Library. hlm:139.

Bennet A, Bogoard I. 1973. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58:419-435. Chew KK, Thoo YY, Khoo MZ, Wan AWM, Ho CW. 2011. Effect ethanol concentration, extraction time and extraction temperature on the recovery of phenolic compounds and antioxidant capacity of Centella asiacita extracts. International Food Research Journal. 18:566-573. Chopra K, Bishnoi M. 2008. Spirulina in Human Nutrition and Health. Gershwin ME dan Belay A, editor: Florida (USA): CRC Press. hlm:102. Chrismadha T, Panggabean LM, Mardiati Y. 2006. Pengaruh konsentrasi nitrogen dan fosfor terhadap pertumbuhan, kandungan protein, karbohidrat dan fikosianin pada kultur Spirulina fusiformis. Berita Biologi. 8(3):163-169. Christaki E, Bonos EI, Paneri PF. 2015. Handbook of Marine Microalgae Biotechnology Advances. Kim SK, editor: Waltham (USA): Academic Press. hlm:237. Cohen Z. 2002. Spirulina platensis (Arthosphira): Physiology, Cell-Biology and Biotechnology. Vonshak A, editor. London (UK): Taylor and Francis e-Library. [Depkes] Departemen Kesehatan. 2015. Menkes canangkan komitmen penanggulangan kanker di Indonesia. http://www.depkes.go.id/ (01 Oktober 2015).

Diastuti H, Warsinah, Purwati. 2009. Aktivitas antikanker ekstrak etanol daun Rhizopora mucronata terhadap larva udang Artemia salina Leach dan sel Raji. Molekul. 4(1):12-20. Fahleny R, Trilaksani W, Setyaningsih I. 2014. Aktivitas antioksidan pada formula terpilih tablet hisap S. platensis berdasarkan karakteristik fisik. Jurnal Ilmu dan Kelautan Tropis. 6(2):427-444. Fitrianah L, Fatimah S, Hidayati Y. 2012. Pengaruh komposisi media tanam terhadap pertumbuhan dan kandungan saponin pada dua varietas tanaman gondola (Basella sp). Agrovigor. 5(1):34-47. Guedes C, Pinto IS, Malcata FX. 2015. Handbook of Marine Microalgae Biotechnology Advances. Kim SK, editor. Maltham (USA): Academic Press. hlm:95.

19

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Terjemahan K. Padmawinata & I. Soediro. Bandung (ID): ITB. Huang D, Ou B, Prior RL. 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal Agricultural Food Chemistry. 53(6):1841-1856. Ismail MF, Ali DA, Fernando A, Abdraboh M, Gaur RL, Ibrahim WM. 2009. Chemoprevention of rat liver toxiciy and carcinogenesis by Spirulina. International Journal Biology Science. 5:377-387. Kamble SP, Gaikar RB, Padalia RB, Shinde KD. 2013. Extraction and purification of c-phycocya(GA3)nin from dry Spirulina powder and evaluating its antioxidant, anticoagulation and prevention of DNA damage activity. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 3(08):149-153. Kannan M, Pushparaj A, Dheeba B, Nageshwari K, Kannan K. 2014. Phytochemical screening and antioxidant activity of marine algae Gracilaria corticata and Spirulina platensis. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 6(11):312-318. Kar P, Laight D, Shaw K. M, Cummings M. H. 2006. Flavonoid rich grapeseed extracts: a new approach in high cardiovascular risk patients. International Journal Clinical Practice. 60(11):1484-1492. Khristyana L, Anggarwulan E, Marsusi. 2005. Pertumbuhan, kadar saponin dan nitrogen jaringan tanaman daun sendok (Plantago major L.) pada pemberian asam giberelat (GA3). Biofarmasi. 3(1):11-15.s Kurniasari B, ulanni’am, Roosdiana . 2014. Pengaruh herbal spray berbasis aktif Spirulina sp. terhadap kadar MD pada luka sayatan tikus (Rattus norvegicus) DM T1. Kimia Student Journal 1(1):126-132. Liu Y, Xu L, Cheng N, Lin L, Zhang C. 2000. Inhibitory effect of phycocyanin from Spirulina platensis on the growth of human leukemia K562 cells. Journal of Applied Phycology. 12(2):125-130. Maarez DA, Naguib MM, Sultan YY, Daw ZY, Higazy AM. 2013. Impact of culturing media on biomass production and pigments content of Spirulina platensis. International Journal of Advanced Research. 1(10):951-961. Machana S, Weerapreeyakul N, Barusrux S, Nonpunya A, Sripanidkulchai B, Thitimetharoch T. 2011. Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal plants against the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line. Chinese Medicine. 6(39):1-8. Man S, Gao W, Zhang Y, Huang L, Liu C. 2010. Chemical study and medical application of saponins as anticancer agents. Fitoterapia. 81:703-714. Mekjaruskul C, Fangkrathok N, Sripandikulchai B. 2016. Antioxidative and anticancer activities of selected microalgae extracts isolated from east coast of Thailand. International Conference on Natural Porducts for Helath and Beauty (NATPRO6), 21-23 January, Khan Kaen University. Nor NM, Naqqiuddin MA, Mashor N, Zulkifly S, Omar H, Ismail A. 2015. The effect of different nitrogen sources on continuous growth of Arthrospira

20

platensis simple floating photobioreactor design in outdoor conditionts. Journal Algal Biomass Utilization. 6(4):1-11. Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerjemah: Ratna SH, Teja I, Sri ST, Sri LA. Jakarta (ID): UI Press. hlm: 148. Pirenantyo P, Limantara L. 2008. Pigmen Spirulina sebagai senyawa antikanker. Indonesian Journal of Cancer . 4:155-163. Prasad KN, Hao J, Yi C, Zhang D, Jiang SY, Zhang M, Chen F. 2009. Antioxidant and anticancer activities of Wampee (Clausena lansium (Lour.) Skeels) peel. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009:1-6. Puspitasari E, Ulfa EU. 2009. Uji sitotoksisitas ekstrak metanol buah buni (Antidesma buntus (L) Spreng) terhadap sel HeLa. Jurnal Ilmu Dasar. 10(2):181-185. Ravishankar D, rajora AK, Greco F, Osborn HMI. 2013. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30:1-11. Ren W, Qiao Z, Wang H, Zhu L, Zhang L. 2003. Flavonoids: promising anticancer agents. Medical Research Reviews. 23(4):519-534. Resmawati MB, Masithah ED, Sulmartiwi L. 2012. Pengaruh pemberian pupuk cair limbah ikan lemuru (Sardinella sp.) terhadap kepadatan populasi Spirulina platensis. Journal of Marine and Coastal Science. 1(1):22-33. Ryu B, Himaya SWA, Kim SK. 2015. Handbook of Marine Microalgae Biotechnology Advances. Kim SK, editor: Amerika Serikat (USA): Academic Press. hlm: 312. Salvador JAR, Carvalho JFS, Neves MAC, Silvestre SM, Leitao AJ, Silva MMC, Melo MLS. 2012. Anticancer steroids: linking natural and semi-synthetic compounds. The Royal Society of Chemistry. 1-51. Silveira ST, Burkert JFM, Costa JAV, Burkert CAV, Kalil SJ. 2007. Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using factorial design. Bioresources Technology. 98(1):1629-1634. Syahril M, Roshani O. Hasyimah N, Hafiz M, Sharida MD, Ahmed HY. 2011. Screening of anticancer activities of crude extracts of unicellular green algae (Chlorella vulgaris) filamentous blue green algae (S. platensis) on selected cancer cell lines. International Conference on Applied Science, Mathematics and Humanities. 82-82. Tomaselli L. 2002. Spirulina platensis (Arthosphira): Physiology, Cell-Biology and Biotechnology. Vonshak A, editor. London (UK): Taylor and Francis e-Library. hlm:2.

Walter A, Carvalho JCD, Soccol VT, Faria ABBD, Ghiggi V, Soccol CR. 2011. Study of phycocyanin production from Spirulina platensis under different light spectra. Brizilian Archives of Biology and Technology an International Journal. 54(4):675-682.

21

Wan D, Wu Q, Kuca K. 2016. Nutraceutical Efficacy, Safety and Toxicity. Gupta RC, editor. Amerika Serikat (USA): Academic Press. Wulandari DA, Setyaningsih I, Syafrudin D, Asih PBS. 2016. Ekstraksi fikosianin dari Spirulina platensis dan aktivitas antimalarial secara in vitro. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 19(1):17-25. Yan LL, Zhang YJ, Gao WY, Man SL, Wang Y. 2009. In vitro and in vivo anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla Var. Yunnanensis. Experimental Oncology. 31(1):27-32. Yildirim I, Kutlu T. 2015. Anticancer agents: saponin and tannin. International Journal of Biological Chemistry. 9(6):332-340. Yong W, Qian K, Qian KX, Qian D. 2001. Anticancer activity of phycocyanin. Journal of Zhejiang University (Engineering Science). 35(6):672-675.

21

LAMPIRAN

22

Lampiran 1 Komposisi media organik (Urea, RI1 dan Plant Catalyst) Unsur hara (makro) Plant Catalyst 2006 Unsur Nitrogen (N) Phosphor (P) P3O5 Kalium (K) Calcium (Ca) Magnesium (Mg) Belerang/Sulphur (S) Besi/Ferum (Fe) Chlor (Cl)

Kandungan 0,23% (wt) 5,54% (wt) 12,70% (wt) 0,88% (wt) < 0,05 ppm 25,92 ppm 0,02% (wt) 36,45 ppm 0,11 (wt)

Sumber: Sucofindo (2000) Unsur hara (mikro) Plant Catalyst 2006 Unsur Mangan (Mn) Tembaga (Cu) Seng (Zn) Boron (B) Molibdenum (Mo) Carbon (C) Cobalt (Co) Natrium (Na)

Kandungan 2,37% < 0,03 ppm 11,15 ppm 0,25% (wt) 35,37 PPM 6,47 (wt) 9,59 ppm 27,42%

Sumber: Sucofindo (2000) Unsur hara pupuk Organik RI1 Komposisi Nitrogen Phospor Kalium Natrium (Na) Calcium (Ca) Magnesium (Mg) Sulfur (S) Besi (Fe) Mangan (Mn) Tembaga (Cu) Seng (Zn) Hormon dalam %: Zeatin 255,23 Mikroba probiotik: G A3 (Gibberelin) Asam amino (dalam%): - Asam aspartat - Asam glutamat - Serin - Glisin - Histidin

Keterangan 1,94 0,79 0,11 0,08 171,28 7,06 3,28 73,79 IAA 276,72

1,146 4,630 1,250 1,246

23

Lampiran 2 Perhitungan Nilai IC50 Sampel kontrol negatif

Konsentrasi 250 125 50 250 125 50 500 125 25 500 125 25 250 125 50

Biomassa kultur

Biomassa komersial

Ekstrak kultur

Ekstrak komersial

Fikosianin kultur

Absorbansi rata-rata 0,38 0,15 0,20 0,26 0,19 0,17 0,16 0,18 0,23 0,24 0,09 0,29 0,25

%penghambatan 60,53 47,37 31,58 50 55,26 57,89 52,63 39,47 36,84 76,32 23,68 34,21

0,19 0,14 0,15

50 63,16 60,53

Penghambatan (%) = 0,38 – 0,15 =

x 100%

0,38 = 60,53% Nilai penghambatan (%) yang didapatkan kemudian digunakan untuk membuat regresi linear dengan sumbu (X) konsentrasi dan sumbu (Y) penghambatan (%) sehingga didapatkan persamaan regresi linear.

Penghambatan (%)

Biomassa Kultur 70 60 50 40 30 20 10 0

y = 0,1407x + 26,558 R² = 0,9622

0

50

100 150 200 Konsentrasi (ppm)

250

300

Dari persamaan linear yang dihasilkan, maka akan didapatkan nilai IC50 dengan memasukkan nilai y = 50 ke persamaan tersebut.

24

y = ax + b = 0,1407x + 26,558 50 = 0,1407x + 26,558 50 – 26,558 = 0,1407x x = 166,61 nilai x yang didapatkan merupakan nilai IC50, sehingga nilai IC50 biomassa kultur yaitu 166,61 ppm.

penghambatan (%)

Biomassa Komersial 60 58 56 54 52 50 48

y = -0,0397x + 60,016 R² = 0,9978 0

50

100 150 200 konsentrasi (ppm)

250

300

Persamaan regresi: y = -0.0397x + 60,016 50 = -0.0397x + 60,016 50-60,016 = -0.0397x x = 252,29 Nilai IC50 biomassa komersial yaitu 252,29 ppm

penghambatan (%)

Fikosianin Kultur 80

60

y = -0,058x + 66,112 R² = 0,7085

40 20 0

0

50

100 150 200 konsentrasi (ppm)

Persamaan regresi linear: y = -0.058x + 66,112 50 = -0.058x + 66,112 50-66,112 = -0.058x x = 277,79 Nilai IC50 fikosianin kultur yaitu 277,79 ppm

250

300

25

penghambatan (%)

Ekstrak Kultur 60 50 40 30 20 10 0

y = 0,0351x + 35,088 R² = 1

0

100

200 300 400 konsentrasi (ppm)

500

600

500

600

Persamaan regresi linear: y = 0,0351x + 35,088 50 = 0,0351x + 35,088 50-35,088 = 0,0351x x = 424,84 Nilai IC50 ekstrak kultur yaitu 424,84 ppm

penghambatan (%)

Ekstrak Komersial 128 64 32 16 8 4 2 1

y = 0,1087x + 20,289 R² = 0,8848

0

100

200 300 400 konsentrasi (ppm)

Persamaan regresi linear: y = 0,1087x + 20,289 50 = 0,1087x + 20,289 50-20,289= 0,01087x x = 273,33 Nilai IC50 ekstrak komersial yaitu 273,33 ppm

26

Lampiran 3 Dokumentasi penelitian

Sel S. platensis (perbesaran 4×10)

Penyegaran S. platensis

Kultur massal S. platensis

Pemanenan S. platensis

Biomassa basah S. platensis

Biomassa kering komersial

Biomassa kering S. platensis

27

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kabupaten Serang, Banten, tanggal 22 November 1994. Penulis merupakan anak ketiga dari pasangan H. Abdul Malik dan Hj. Euis Junaeroh. Pendidikan formal yang ditempuh oleh penulis di antaranya yaitu SDN Ujung Tebu III, MTs Islamiyah Ciomas, dan MAN 2 Kota Serang. Penulis masuk di Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN undangan pada tahun 2012 di Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penulis pernah melaksanakan Praktik Lapang di UD Usaha Suwaga Jaya, Gresik-Jawa Timur dengan judul praktik lapang “Kelayakan Dasar pada Pengolahan Otak-Otak Bandeng di UKM UD Usaha Suwaga Jaya, Gresik-Jawa Timur”. Selama masa perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum beberapa mata kuliah, yaitu asistem praktikum Biokimia Hasil Perairan, Mikroorganisme dan Fermentasi Hasil Perikanan, Mikrobiologi Hasil Perairan dan Teknologi Pengolahan Hasil Perairan. Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif menjadi anggota di Himpunan Profesi Mahasiswa Teknologi Hasil Perairan (HIMASILKAN) sebagai sekretaris HIMASILKAN selama 2 periode, yaitu periode 2013-2014 dan 2014-2015 serta aktif di beberapa kepanitiaan baik di Departemen THP maupun di luar THP. Penulis pernah mengikuti Seminar Nasional Hasil Litbang Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan yang diselenggarakan oleh Pusat Penelitian dan Pengembangan Daya Saing Produk dan Bioteknologi Kelautan Perikanan sebagai pemakalah oral pada tahun 2016. Penulis juga mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) IPB pada tahun 2014 hingga 2016 dan menjadi salah satu penerima hibah DIKTI pada bidang PKM-Kewirausahaan pada tahun 2015 dengan judul “Mrs. EM TORU stor Rumput Laut lternatif Finger Food Kaya Serat Rendah Kalori untuk para Snackers”. PKM-Penelitian dengan judul “Sediaan Bahan Herbal Alami dari Spirulina platensis yang Dikultivasi secara Organik sebagai Bahan Antikanker Limfoma (Kelenjar Getah Bening)” pada tahun 2016.