PEMANFAATAN REKAYASA GENETIKA PADA TANAMAN
Suharsono - Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB - Departemen Biologi, FMIPA, IPB E-mail:
[email protected];
[email protected]
1. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN TERHADAP SERANGGA Metode: Mengekspresikan di tanaman gen penyandi: •insektisidal protoksin dari Bacillus thuringiensis •inhibitor α-amilase •inhibitor protease •lektin
GEN PENYANDI PROTOKSIN Bt Ekspresi gen protoksin Bt di tanaman
PROTOKSIN Bt •B. thuringiensis •beracun bagi: •Lepidoptera (ngengat), •Diptera (lalat dan nyamuk), •Coleoptera (kumbang) •tidak beracun pada mamalia dan biodegradable.
Penggerek tongkol
Penggerek batang Penggerek buah
CARA MENINGKATKAN EKSPRESI •memotong gen (tersisa N-terminal) 998% ujung N: terkonservasi 9ujung C bervariasi 9potong menjadi 646 aa ujung N dari 1156 aa
•menggunakan promoter kuat
Manduca sexta Heliothis zea Keiferia lycopersicella
CARA LAIN MENINGKATKAN EKSPRESI Bt 1. Mutagenesis situs terarah (95.6% WT) Æ 10 x 2. Modifikasi sekuen (78.9% WT) Æ 100 x 3. Menggunakan promoter SSU rubisco + peptida transit + sekuen termodifikasi Æ ekspresi di kloroplast (1% protein daun) 4. Introduksi gen protoksin ke kloroplast Æ 2-3% protein daun
INTEGRASI GEN Bt DI KLOROPLAST Keuntungan: 1. Tidak ada modifikasi protoksin 2. Jumlah kloroplast tiap sel banyak Æ toksin tinggi 3. Tidak ada resiko penyebaran gen melalui polen Kerugian: •Serangga dapat menyerang akar, buah, bunga, batang yang tidak mempunyai kloroplast
PENCEGAHAN RESISTENSI SERANGGA TERHADAP Bt •sebagai agen seleksi Æ serangga resisten Pencegahan: •Ekspresi pada waktu singkat (promoter terinduksi PR-1a Æ pathogen atau asam salisilat atau asam poliakrilat) •Fusi dengan gen toksin lain (inhibitor α-amilase) •Kombinasi dengan insektisida kimiawi dosis rendah •Strategi pengungsian (refugee) dengan 20% area non-transgenik. Serangga resisten di tanaman transgenik (80%) jumlahnya sedikit (99.9% mati) Æ kawin dengan serangga sensitif di area 20% nontransgenik Æ dilusi ketahanan
2. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN HERBISIDA Tanaman resisten herbisida: 1. Menghambat penyerapan herbisida 2. Produksi berlebihan protein sasaran herbisida 3. Mengurangi kemampuan protein sasaran mengikat herbisida 4. Menginaktivasi herbisida melalui metabolisme EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) •substrat sintesis aa aromatik •sasaran herbisida glyphosate Ekspresi EPSPS mutan E. coli di tanaman Æ resisten terhadap glyphosate
CARA LAIN MERAKIT TANAMAN RESISTEN HERBISIDA
TANAMAN RESISTEN TERHADAP BROMOXYNIL •Nitrilase (dari Klebsiella ozaenae) menginaktivasi herbisida bromoxynile Æ tanaman resisten •Herbisida bromoxynil (3,5-dibromo-4hydroxybenzonitrile) Æ menghambat fotosintesis
3. PERAKIAN TANAMAN RESISTEN VIRUS Resistensi alami: •mencegah transmisi virus •mencegah terbentuknya virus •mengatasi gejala virus Rekayasa genetik: •Mencegah terbentuknya (perbanyakan) virus
MENCEGAH PERBANYAKAN VIRUS • Sintesis protein pembungkus virus ÆResisten terhadap TMV, CuMV, AMV, tobacco streak virus, tobacco rattle virus, PVX, PVY,
tobacco etch virus
• Teknologi RNA antisense protein pembungkus CuMV • Teknologi RNAi
EKSPRESI PROTEIN MANTEL VIRUS
Tanaman transgenik mengekspresikan protein mantel: • RNA sense Æ resisten • dengan antisense Æ resisten pada dosis virus rendah
Proteksi dengan protein mantel virus
Resistensi terhadap banyak virus Protein mantel CuMV, Zucchini yellow mosaic virus, WMV2 Æ Cucurbita pepo resisten terhadap ketiga virus
4. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN FUNGI DAN BAKTERI Æ ekspresi pathogenesis-related (PR) protein: β-1,3-glukanase, chitinase, thaumatin-like protein, protease inhibitor, asam salisilat
•chitinase menghidrolisis β-1,4 dari chitin Nacetyl-D-glucosamine (dinding sel fungi)
EKSPRESI ASAM SALISILAT DI TANAMAN •Resisten terhadap fungi dan bakteri •Cara: Ekspresi gen penyandi enzim isochorismate synthase dan isochorismate lyase
5. PERAKITAN TANAMAN TOLERAN CEKAMAN DAN KEGUGURAN Ekspresi Super Oksida Dismutase (SOD): •tahan panas, herbisida methyl viologen (paraquat), layu (bunga potong) Ekspresi glutation peroksidase (-s-transferase) (GST): •tahan garam, beku
Toleran terhadap cekaman garam/kering •perlu osmoprotectant: ¾gula, alkohol, prolin, trehalose, D-ononitol, mannitol, sorbitol, glisin betain, 3methylsulfoniopropionate •ekspresi choline dehydrogenase (betA) Æ betain
6. PENUNDAAN BUAH MASAK DAN BUNGA LAYU Buah masak: •ekspresi polygalacturonase dan cellulase Æ ekspresinya dihambat: masak buah tertunda (layu bunga, gugur daun tertunda) Bagaimana menghambat ekspresi? •RNA antisense thd gen penyandi •mengalihkan jalur sintesis enzim
MENGALIHKAN JALUR SINTESIS ETILEN untuk menghambat sintesis etilen
ACC= amino cyclopropan carboksilik acid
Degradasi ACCÆ sintesis etilen dihambat
7. MANIPULASI PIGMENTASI BUNGA Antosianin (flavonoid) Æ pigmen bunga Chrysanthemum + cDNA CHS sense/antisense Î bunga putih Astaxanthin: •pink (salmon, udang) •dari bakteri & mikroalga •mencegah telur rusak karena UV •meningkatkan daya hidup & laju tumbuh Æ antioksidan Produksi astaxanthin: -ekspresi cDNA β-caroten ketolase (β-C-4 oxygenase) alga hijau (Haematococcus pluvialis)
8. MODIFIKASI KANDUNGAN NUTRISI memperbaiki: -kualitas nutrisi: jagung, kacang polong (kandungan aa di biji) -komposisi asam lemak dari tanaman penghasil minyak -rasa buah dan sayuran
MENINGKATKAN KANDUNGAN LISIN Over produksi lisin: menghentikan feedback inhibition oleh aspartokinase & dihydrodipicolinic acid synthase Æekspresi gen DHDPS lysin-feedback-insensitive dari Corynebacterium & AK lysin-feedback-insensitive dari E. coli dikendalikan promoter biji Æ biji mengandung 2-5 x lisin
Kandungan lipid Kanola transgenik: antisense gen stearate desaturase dari Brasicca Æ akumulasi asam stearat (tidak menjadi asam oleat)
Vitamin A Mamalia: β-carotene (provitamin A) Æ vitamin A β-carotene: pigmen karotenoid pada membran tanaman fotosintetik Ekspresi β-carotene di beras via A. t: 1: Phytoene synthase (psy) 2: Lycopene b-cyclase (lcy) 1+2 Æ padi Æ beras mengandung βcarotene shg berwarna kuning/emas Æ golden rice
9. MODIFIKASI RASA DAN TAMPILAN
Mencegah perubahan warna Polifenol oksidase: oksidasi monofenol/o-difenol Æ o-quinon Æ perubahan warna buah/sayuran Perubahan warna dihambat dengan menghambat sintesis polifenol oksidase Kentang: Æ antisense polifenol oksidase +p35S/pGBSSÆ resisten thd black spot Æ Sense polifenol oksidase Æ tidak tahan
Pemanis Monellin: -Dioscoreophyllum cumminsii -3000 x lebih manis darpd sukrosa -Dimer: rantai A 45 aa, B 50 aa dengan ikatan lemah nonkovalen -Rusak oleh: panas, asam
Pemanis rendah kalori
Kandungan pati Kentang: 20-30 amilosa (rantai lurus); 70-80% amilopektin (rantai bercabang) Æ rasio keduanya: perubahan sifat fisik & kimia pati
Amilosa: ikatan α-1,4
Amilopektin: ikatan α-1,4 dan α-1,6
Biosintesis pati
Glukan+glukan Æ α-1,6 Æ amilopektin
p35S + antisense startch branching enzyme Æ amilosa naik: 28% Æ 60-80%
Tanaman sebagai bioreaktor
Produksi agen terapetik di tanaman transgenik (skala lab)
Antibodi Keunggulan tanaman drpd bakteri: integrasi DNA di genom tanaman lebih stabil, protein mengalami pemrosesan spt di sel hewan, lebih murah (produksi antobodi per gram di sel hibridoma: $ 5000, bakteri: $ 1000, tanaman: $ 10-100), dapat disimpan di biji shg tahan lama pada suhu ruang
Produksi biopolimer Biosintesis poly (3-hydroxybutyric acid) dari acetyl-CoA
Alcaligenes eutrophus Acetyl Co-A 3-ketothiolase
Acetoacetyl Co-A
D-3-Hydroxybutyryl co-A
Acetoacetyl Co-A reductase
PHA
Poly(3-hydroxybutyric acid) synthase
PHA: bioplastik, di A. eutrophus Æ 1 operon Æ tidak dikenal tanaman Æ ekspresi 3 gen terpisah: A. thaliana Æ target ke kloroplast Æ 1 mg /g daun segar PHA
Mengubah kandungan lignin Lignin: tinggi Æ mutu pulp dan hijauan pakan rendah rendah: antisense 4-Coumarate:coenzyme A ligase
