CENTRO DE CIENCIAS BASICAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA

CENTRO DE CIENCIAS BASICAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA ACADEMIA DE BIOQUIMICA

MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

LIC. EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA 1er. SEMESTRE

ENERO JUNIO 2007

PROFESOR: M en C Gonzalo Muñoz Andrade M en C Marco Antonio Zamarripa T. TECNICO: LAQB Ma. Guadalupe López LAQB. Héctor Rangel

REGLAMENTO DE LOS LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE QUIMICA •

Antes de asistir a la práctica deberás leer el texto completo y traer por escrito o en un diagrama el planteamiento del experimento a realizar.

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Es obligatorio el asistir con bata y lentes de seguridad.

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Prohibido comer, fumar, beber y masticar chicle.

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Usar guantes de látex desechables y cubre boca cuando se trabaje con muestras biológicas y/o material patológico.

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Se debe de informar inmediatamente al profesor o al técnico cualquier accidente que ocurra durante la práctica.

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Los remanentes de reactivos utilizados no deben regresarse a los envases originales, y deben manejarse con pipetas y espátulas limpias.

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La mayoría de los disolventes orgánicos son volátiles e inflamables, al trabajar con ellos deberá hacerse en lugares ventilados y nunca cerca de la flama. Los recipientes que los contienen deben mantenerse cerrados, en lugares frescos y secos.

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Nunca deberán efectuarse experimentos no descritos en la práctica.

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Salvo indicaciones precisas, nunca tape un tubo de ensaye con el dedo.

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Si es necesario inhalar algún gas se provocará una corriente de aire con la mano entre la boca del recipiente y la nariz.

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No deberá verterse nunca agua a los ácidos, sino al contrario, teniendo precaución, asimismo deberá tenerse mucho cuidado cuando se vierta amoniaco a un líquido caliente, ó a un ácido concentrado a una base fuerte y viceversa.

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Al terminar cualquier experimento el profesor o el técnico indicarán donde se deben de colocar los residuos.

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Siempre consulte al instructor para aclarar cualquier duda.

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Al retirarse del laboratorio dejar su lugar de trabajo limpio.

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OBJETIVO GENERAL El alumno adquirirá los conocimientos, habilidades y actitudes necesarias para un desempeño adecuado en el laboratorio.

METODOLOGIA •

Al inicio del semestre el alumno recibe el manual de laboratorio.

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Los alumnos trabajan en equipo; todos deberán participar en la realización de la práctica. Al finalizar la práctica, se analizarán y discutirán los resultados obtenidos.

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Una semana después de concluida la práctica, el alumno entregará un reporte que deberá contener: Presentación 5% Objetivos 5% Introducción 5% Planteamiento 10% Resultados 10% Discusión de Resultados 25% Cuestionario 10% Conclusiones 25% Bibliografía 5%

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Para la elaboración del reporte, el alumno deberá consultar al menos dos fuentes de información bibliográfica, y cuando menos una de ellas deberá ser un libro.

CRITERIOS DE EVALUACION Los requisitos que debe reunir el alumno para poder aprobar el laboratorio siguientes:

son los

Asistencia al 80% de las sesiones

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Derecho a calificación

Valoración previa a cada práctica

-

Derecho a entrar a la práctica

Entrega puntual de reportes

-

75% de la calificación final

Evaluación final

-

15% de la calificación final

Participación y trabajo en el laboratorio -

10% de la calificación final

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INDICE

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

NOMBRE DE LA PRACTICA Uso del material de laboratorio Preparación de soluciones Fragilidad osmótica de eritrocitos Medición de la actividad del ión hidrógeno en soluciones acuosas Titulación ácido – base y determinación de acidez en la leche Preparación de un Buffer y su acción amortiguadora Propiedades químicas de carbohidratos Preparación de una curva patrón de glucosa Separación de aminoácidos por cromatografía en papel Examen químico de orina Determinación de proteínas por el método de Biuret Determinación cuantitativa de la actividad de amilasa en líquidos biológicos Análisis de lípidos

PAG. 4 6 12 14 21 24 27 29 31 33 39 41 43

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PRACTICA No. 1 USO DEL MATERIAL DE LABORATORIO OBJETIVO: 1.- Conocer el material más utilizado en el laboratorio de Bioquímica 2.- Desarrollar las habilidades necesarias para pesar, pipetear y titular con precisión.

INTRODUCCION: Existe gran variedad en lo que a material de laboratorio se refiere debido a la diversidad de necesidades en la practica y experimentos de laboratorio. El material de vidrio esta elaborado con vidrio de borosilicato que resiste las altas y bajas temperaturas (no cambios bruscos de temperatura), es fácil de desinfectar, inerte y principalmente muy frágil. Además se requiere de material de porcelana, aluminio, plástico, etcétera, que sirve para cubrir una amplia gama de usos. El laboratorio es donde se desarrollan las ciencias experimentales, está provisto de instalaciones especiales, materiales, aparatos, recipientes y elementos indispensables, donde se puede llevar a la practica lo visto en teoría. El llevar a cabo experimentos en laboratorio permite la comprensión y entendimiento de los fenómenos y los hechos que se dan en la naturaleza. Entre las sustancias delicadas se encuentran los ácidos y las bases, que deben de ser manipulados con mucho cuidado, el alumno debe de seguir las indicaciones que el maestro señale, así como tener un comportamiento cuidadoso y de disciplina mientras permanezca en el laboratorio. Si no se tienen los suficientes cuidados se pueden tener accidentes en el laboratorio que pueden manifestarse como lesiones el alumno o daño al material. Para evitar peligros en el laboratorio es necesario evitar: a) b) c) d) e)

Incendio o explosión al utilizar solventes inflamables. El uso de reactivos venenosos, corrosivos o cáusticos. Quemadura y escaldaduras, incluyendo las provocadas por choque eléctrico. Laceraciones provocadas por vidriería rota, cuchillas, navajas, etc. Peligros por agentes reactivos, mutagénicos y /o cancerígenos.

Es importante que cada estudiante ejecute todos los experimentos por si mismo, es decir que tenga una participación en la practica. La limpieza es esencial en todo trabajo bioquímico, por lo tanto todas las precauciones que se tomen en un análisis cualitativo y cuantitativo deberá ser tomado en este curso. Frecuentemente, restos de algún compuesto químico en el material de laboratorio dan resultados erróneos en el experimento que se esta realizando, por lo tanto, todo el material de vidrio deberá lavarse después de ser utilizado. Todo material biológico deberá ser desechado de acuerdo a las especificaciones especiales que les sean dadas por el maestro o instructor de laboratorio tan pronto se haya terminado de usar. Además las mesas deberán limpiarse antes y después de llevar a cavo la practica. En las tarjas no deberán ser arrojados papel filtro, vidrio o material parcialmente insoluble. Cuando se tenga duda de cómo desechar un material, se debe de preguntar al maestro de laboratorio o al instructor. Los mecheros deben de apagarse si no se están utilizando.

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MATERIAL: Balanza Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml Bureta Soporte Pinzas para bureta Vasos de precipitado Espátula Matraz Erlenmeyer

REACTIVOS: Agua Sacarosa cloruro de sodio

METODO: 1. Pipetear distintos volúmenes, utilizando la pipeta adecuada, hasta dominar la técnica. 2. Pesar distintas sustancias, tomando en consideración la tara. 3. Titular repetidamente hasta lograr un control de la técnica. CUESTIONARIO: 1. De la siguiente lista de materiales entregar: Esquema y utilidad de: Material de vidrio. • • • • • • • • • •

Varilla. Agitador. Pipetas. Tubos de ensaye. Vasos de precipitado. Matraces. Probetas. Refrigerantes. Vidrio de reloj. Otros.

Material de porcelana. • • • • •

Cápsula. Crisol Mortero. Embudo Bucher. Otros.

Otros materiales. • • • •

Conexiones. Mangueras de hule. Tubos de vidrio. Soporte

Aparatos: • • •

Balanza. Centrífuga. Estufa.

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PRACTICA No. 2 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

OBJETIVO: Al finalizar la práctica el alumno sera capaz de: 1.- Definira: molaridad, molalidad, normalidad y porcentualidad. 2.- Preparar los tipos de soluciones más frecuentemente empleadas en el laboratorio de bioquímica.

INTRODUCCIÓN: En la naturaleza encontramos dos clases de substancias puras: los elementos y los compuestos; las demás son mezclas. Una mezcla consiste en dos o más substancias puras, separables por medios físicos. Su composición es variable y sus propiedades dependen de ésta y de las propiedades de las substancias que forman parte de ella. Las mezclas son de dos tipos: heterogéneas y homogéneas. Una mezcla heterogénea no es completamente uniforme y sus componentes son distinguibles, en ocasiones a simple vista (ejemplo: una mezcla de azúcar y arena). Una mezcla homogénea tiene apariencia uniforme; las llamadas soluciones son ejemplos de mezclas homogéneas. De acuerdo a su estado físico las soluciones se clasifican en gaseosas, líquidas y sólidas. Las soluciones líquidas son las más comunes y, tal vez, las más importantes para el químico. Generalmente se llama disolvente al componente de una solución que se encuentra en mayor cantidad; los otros componentes se llaman solutos. El agua es la molécula más abundante en los sistemas vivientes y de ahí la importancia de abordar el estudio de las soluciones acuosas en un curso de Bioquímica. Maneras de expresar la concentración A. El mol. Nos ocuparemos en primer lugar del mol. La razón de su existencia es que los átomos de los diferentes elementos no tienen la misma masa. Para expresar la masa de los átomos se recurre a una unidad que no es el gramo ni el miligramo, sino que es la masa de uno de ellos: el átomo de hidrógeno por ser el más sencillo. A su masa se le da el valor convencional de 1 (uno). Las masas relativas de los demás elementos son múltiples de este número; así, la masa del átomo de sodio es 23 veces la del átomo de hidrógeno; la del cloro, 35.5 veces la del hidrógeno, etc. A estas cifras, por referirse a relaciones de masa entre los átomos, se les denomina masas atómicas. Teniendo presente esta relación constante entre las masas de los diferentes átomos, se pueden utilizar cualquiera de las habituales unidades de masa ya que siempre que mantengamos dicha proporción de 1 para el hidrógeno por 39 para el potasio estaremos poniendo en contacto el mismo número de átomos. Así, 1 kilogramo de hidrógeno tendrá el mismo número de átomos que 23 kilogramos de sodio o que 39 kilogramos de potasio o que 35.5 kilogramos de cloro. Lo mismo se puede afirmar de 1 gramo de hidrógeno con respecto a 23 gramos de sodio, o de 39 miligramos de potasio con respecto a 35.5 miligramos de cloro. De todas estas unidades, la perteneciente al Sistema Internacional de unidades es el gramo y por ello es la que debe utilizarse. Así pues, un átomo-gramo es la masa atómica expresada en gramos. Por ello se tiene que un átomo-gramo de hidrógeno es 1 gramo de hidrógeno; un átomo-gramo de sodio son 23 gramos de sodio; un átomo-gramo de potasio son 39 gramos de potasio; y, un átomo-gramo de cloro son 35.5 gramos de cloro.

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Ahora bien, los átomos se unen para formar moléculas. Por ejemplo, el carbono, el oxígeno y el hidrógeno se unen para formar, entre otras sustancias, glucosa (fórmula: C6H12O6). La masa molecular de la glucosa es la suma de las masas de los átomos constituyentes, a saber:(12x6)+(1x12)+(16x6) = 72+12+96 = 180. Esta masa puede ser expresada en gramos y, si cuando se habla de átomos se le llamaba átomo-gramo, cuando se refiere a moléculas, se le denomina molécula-gramo o mol. Por el mismo razonamiento se podría hablar de ión-gramo. Todas las moléculas-gramo tendrán el mismo número de moléculas y así se cuenta con una unidad que expresa la proporción de moléculas en una sustancia. En consecuencia, como la masa molecular de la glucosa es 180, un mol de glucosa pesa 180 gramos, 2 moles de glucosa pesan 360 gramos, etc. Se puede establecer la fórmula siguiente: MASA EN GRAMOS = MASA MOLECULAR x NÚMERO DE MOLES y, despejando: NÚMERO DE MOLES = MASA EN GRAMOS/ MASA MOLECULAR Para usos biológicos la unidad mol es muy grande y entonces se utiliza el milimol (mmol), unidad mil veces menor. Por lo tanto, un milimol es igual a la masa molecular expresado en miligramos. Así, NÚMERO DE MILIMOLES = MASA EN MILIGRAMOS/ MASA MOLECULAR Comprendidos los conceptos anteriores, se puede pasar a definir qué es una solución molar. B. Soluciones molares (M). La molaridad de una solución expresa el número de moles de soluto presentes en un litro de solución final. Esto quiere decir que si se disuelven en agua 1 mol de glucosa (180 gramos) y se añade agua suficiente ("se afora") hasta completar un litro, se obtiene una solución molar (1.0M) de glucosa. Para ilustrar más este punto, supongamos que se quieren preparar 500 mililitros de una solución 0.4 M de cloruro de sodio (NaCl). ¿Cuantos gramos de NaCl deben prepararse, sabiendo que la masa "molecular" de la sal es de 58.5? El problema puede abordarse siguiendo este razonamiento: si 1 litro de solución 1.0 M contiene 58.5 gramos de NaCl y 1 litro de solución 0.4 M contiene “x” gramos de NaCl, entonces x = (0.4)(58.5)/1 = 23.4g de NaCl. Estos 23.4 gramos de NaCl sirven para preparar 1 litro (1000 ml) de solución; pero solamente se requiere 0.5 litro (500 ml). Entonces, como 1 litro de solución 0.4M contiene 23.4 gramos de NaCl , 0.5 litro de solución 0.4 M contiene “x” gramos de NaCl, esto es, x = (0.5)(23.4)/1 = 11.7 gramos de NaCl. Por lo tanto, se requieren 11.7 gramos de NaCl y disolverlos en agua hasta completar un volumen de 0.5 litro (500 ml). En el ejemplo anterior, como se pudo ver, se multiplicó la molaridad del problema (0.4) por la masa "molecular" (peso fórmula) del NaCl (58.5) y por el volumen del problema (0.5 litro). Posteriormente se dividió entre 1 litro. Simplificando el procedimiento, se puede aplicar la fórmula siguiente: GRAMOS REQUERIDOS DE LA SUSTANCIA = MOLARIDAD X PESO MOLEC. X VOLUMEN (en litros).

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C. El equivalente (Eq). Desde el punto de vista electroquímico existen dos clases de substancias: unas, que al estar en solución permiten el paso de la corriente eléctrica, reciben el nombre de electrolitos; las otras, que no lo permiten, son llamadas no electrolitos. Ejemplos de electrolitos son el cloruro de sodio, el fosfato de potasio, etc. La glucosa y la urea son ejemplos de no electrolitos. Se sabe que una propiedad de los átomos es la de poderse combinar. En términos químicos esta capacidad de combinación se denomina valencia. La valencia no guarda relación con la masa atómica, sino con el número de electrones combinables; en otras palabras, existen átomos con gran poder combinatorio cuya masa ("peso atómico") es menor que la de otros átomos con valencia menor. Por ejemplo, el sodio tiene un peso atómico de 23 y una valencia de 1; el oxigeno tiene un peso atómico de 16 y una valencia de 2; el carbono tiene un peso atómico de 12 y una valencia de 4, etc. Se requiere, pues, contar con una unidad que evite la dificultad de que los átomos no tengan la misma masa y que permita comparar "actividades" (cargas) por número y no por peso. Por ejemplo, si se tratara de un regimiento de soldados, se hablaría del número de soldados y no del peso corporal del pelotón. Pero esto no es todo: los soldados pueden estar armados de manera diferente, valer cada uno por dos o tres, y es esta razón del valor diferente, de diferente valencia o actividad química la que lleva a la introducción de una nueva unidad: el equivalente (Eq). Se entiende por equivalente químico el peso atómico o molecular de una sustancia, expresado en gramos, y dividido entre su valencia: equivalente (Eq) = masa/ valencia Por tratarse de una unidad demasiado grande para usos biológicos, se utiliza una unidad 1000 veces menor: el miliequivalente (mEq). Otra comparación que ayuda a ilustrar la importancia de determinar equivalentes en lugar de gramos es la siguiente: si se invita a una fiesta 1000 Kg. de niños y 1000 Kg. de niñas, no se puede estar seguro de que se invitó a cantidades equivalentes de niños y niñas. Pero si se invita a 10 niños y a 10 niñas sin tener en cuenta su peso, se puede tener la seguridad de que en la fiesta la cantidad de niños será equivalente a la de las niñas. Si se considera que la actividad fisiológica y química es proporcional a la cantidad de partículas por unidad de volumen (moles o mili moles por litro), y más directamente al total de cargas eléctricas por unidad de volumen (equivalentes o mili equivalentes por litro), con esta última unidad se puede tener una mejor idea de la verdadera acción química que tienen los iones en el organismo. Por ejemplo, en el suero existen 3.65 g de Cl- por litro y 3,25 g de Na+ por litro, y en + apariencia hay un mayor número de iones Cl que de iones Na ; sin embargo, si se toma en cuenta + que la masa de un ión Cl es mayor que la de un ión Na , se puede sospechar que en el suero existe una menor acción química del primero que del segundo. Expresado en mili equivalentes ya + se expresa esta diferencia, puesto que hay 103 mEq de Cl por 142 de Na . Para obtener la actividad química se divide la cantidad necesaria de sustancia (en gramos) entre la valencia. Por lo tanto, teniendo en cuenta ambas características de peso y valencia, se puede generalizar el concepto para todos los elementos, diciendo que las cantidades que representan la masa atómica ("peso atómico") dividido por su valencia, son químicamente equivalentes. Así, 1 gramo de H/1 = 1 g; 23 gramos de Na /1 = 23 g; 39 gramos de K/1 = 39 g; 40 gramos de Ca /2 = 20 g; 16 gramos de O/2 = 8 g; y, 12 gramos de C/4 = 3 g, son equivalentes; en otras palabras, químicamente valen igual y son capaces de neutralizarse exactamente. De lo expuesto se deduce que es fácil convertir gramos en equivalentes y viceversa. Si se quiere saber cuántos equivalentes son 69 gramos de Na, como el peso atómico de Na = 23 y un equivalente de Na = peso atómico en gramos/ valencia = 23 g/1 = 23 gramos de Na, entonces, 3 equivalentes tienen (3)(23) = 69 gramos de Na. Si se quiere saber cuántos mEq son 69 gramos de Ca, dado que el peso atómico de Ca = 40 y un equivalente de Ca = (peso atómico en gramos)/valencia = 40 g/2 = 20 gramos de Ca, entonces 69 gramos de Ca son x = 69 x 1/20 = 3.45 Eq = 3450 mEq.

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Soluciones normales (N). La normalidad de una solución expresa el número de equivalentes de soluto presentes en un litro de solución final. Por ejemplo, si se disuelve en agua destilada el peso equivalente de una sustancia, a completar 1 litro (1000 ml), se habrá preparado un litro de una solución 1 Normal (1 N). Como se recordará, la fórmula utilizada para calcular la cantidad de sustancia necesaria para preparar cualquier volumen de una solución de molaridad determinada es: VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA cuando el volumen se expresa en litros y, VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA cuando el volumen es expresado en mililitros. Para calcular la cantidad en gramos de una sustancia, necesaria para preparar un volumen determinado de una solución de cierta normalidad, se pueden usar las fórmulas siguientes: VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA cuando el volumen se expresa en litros, y VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA cuando el volumen ha sido expresado en mililitros. Ejemplo: Preparar 300 ml de una solución 0.1 N de cloruro de calcio (CaCl2). Volumen = 300 ml Normalidad = 0.1 N Equivalente del CaCl2: Peso atómico de Ca = 40; peso atómico de Cl = 35.5 x 2 (en CaCl2) = 71.0; peso fórmula = 40 + 71 = 111. Valencia (capacidad de combinación) = 2. Peso equivalente = 111 g/2 = 55.5 gramos Substituyendo en la fórmula: gramos de CaCl2 = 300 x 55.5 x 0.1/1000 = 1.665 Resultado: Se necesitan 1.665 g de CaCl2 para preparar 300 ml de una solución 0.1N . D. Soluciones porcentuales (%). En las soluciones, el soluto puede encontrarse a diferentes diluciones en relación con el solvente. Es por ello que se recurre a una terminología especial que indica la cantidad de soluto presente en relación al volumen total de la solución. Dicha relación se puede expresar de varias maneras, una de las cuales son las llamadas soluciones porcentuales. Este porcentaje puede ser: de volumen en volumen (v/ v), de peso en peso (p /p) y de peso en volumen (p /v). 1. De volumen en volumen. En general se emplea para soluciones de líquido en líquido. Por ejemplo: soluciones de etanol en agua, ambos son líquidos. Para preparar una solución porcentual se considera que las substancias "químicamente puras" están formadas sólo por soluto; es decir, están al 100%. Para fines prácticos se usan 100 ml como volumen total de solución; la cantidad de mililitros de soluto empleados en dicha dilución (v/v), es expresa en forma porcentual. Así, si se tiene una solución de etanol al 96% (v /v), quiere decir que por cada 100 ml de solución total, 96 ml corresponden al soluto (alcohol químicamente puro) y el resto, al agua u otro solvente empleado. Ejemplo: se desea preparar una solución de fenolftaleina al 0.5% (v/ v) en alcohol al 96%. En este caso el soluto es la fenolftaleina, y el solvente el alcohol (etanol) al 96%.

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Si sólo se cuenta con alcohol químicamente puro (al 100%), se debe preparar primero una solución de alcohol al 96% (v/v). El método a seguir es el siguiente: en una probeta de 100 ml se vierten 96 ml de alcohol absoluto (100%); posteriormente se añade agua destilada suficiente para completar los 100 ml. Es necesario que el procedimiento se haga en el orden mencionado para que sea exacto: primero el alcohol y luego el agua. A primera vista, parecería lo mismo añadir primero 4 ml de agua y a continuación 96 ml de alcohol absoluto, obteniendo de este modo 4 + 96 = 100 ml de solución. Sin embargo, hay que considerar que puede haber un margen de error, ya que se trata de dos líquidos cuya densidad es diferente: las moléculas de alcohol no mantienen la misma "distancia" entre ellas cuando el alcohol es químicamente puro que cuando se encuentra mezclado con agua. Esta pequeña diferencia puede alterar el volumen final de solución (100 ml). Una vez preparada la solución de alcohol al 96%, se procede a preparar la solución de fenolftaleína al 0.5% (v/ v). En una probeta de 100 ml se coloca 0.5 ml de fenolftaleína, añadiendo posteriormente la cantidad necesaria de alcohol al 96% para completar el volumen de 100 ml. Es importante insistir que los términos porcentuales expresan siempre una relación; es decir, se pueden variar los volúmenes siempre y cuando no se pierda dicha relación. Por ejemplo, si en lugar de 100 ml de la mencionada solución de fenolftaleína al 0.5% (v /v) en alcohol al 96%, sólo se deseasen preparar 25 ml, se sigue el planteamiento siguiente: como 100 ml de solución contienen 0.5 ml de fenolftaleína, entonces 25 ml de solución contienen “x” ml de fenolftaleína, por lo que: x = 25 x 0.5/100 = 0.125 ml de fenolftaleína Resultado: se necesita 0.125 ml de fenolftaleína, y suficiente alcohol al 96% para completar un volumen de 25 ml. El alcohol etílico común tiene 96% de pureza (v /v ). Por lo tanto, si no se cuenta con alcohol puro y se quiere preparar una solución de alcohol al 24%, el planteamiento es como sigue: como 100 ml de solución contienen 96 ml de alcohol puro y “x” ml de solución contienen 24 ml de alcohol puro, entonces: x = 24 x 100/96 = 25 ml de alcohol al 96% (v/ v) Resultado: Se necesitan 25 ml de solución de alcohol al 96% y completar con agua un volumen de 100 ml. Si tan solo se desean 50 ml de esta nueva solución: como 100 ml de alcohol al 24% tienen 25 ml de alcohol al 96%, entonces 50 ml de alcohol al 24% tienen “x” ml de alcohol al 96%, x = 50 x 25/100 = 12.5 ml de alcohol al 96% Resultado: Se requieren 12.5 ml de alcohol al 96% y completar con agua destilada un volumen final de 50 ml. 2. De peso en volumen (p /v). Expresa el número de gramos de soluto en 100 ml de la solución final, independientemente de la naturaleza del solvente. Son las más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Bioquímica. 3. De peso en peso (p /p). Expresa el número de gramos de soluto en 100 gramos de la solución final. Generalmente estas soluciones no se preparan en los laboratorios convencionales, pero conviene conocerlas ya que muchos reactivos comerciales son envasados como soluciones porcentuales de peso en peso. Por ejemplo, los ácidos clorhídrico, sulfúrico, etc. son envasados de esta manera. Así, para al ácido clorhídrico (HCl) al 37% (p /p) en cada 100 gramos de solución, 37 gramos son de HCl puro.

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E. Soluciones molales (m). Una solución molal es la que contiene el peso molecular de una sustancia en 1000 gramos de solvente; es decir, la cantidad de solvente es fija y a ella se agrega la sustancia por disolver. Por ejemplo, una solución 1 molal (1 m) de glucosa, cuyo peso molecular es de 180, se prepara agregando a 1000 g de agua, 180 g de glucosa. MATERIAL: Balanza Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml Vasos de precipitado 50 y 100 ml Espátula Matraces aforados 50 y 100 ml

REACTIVOS: Agua Sacarosa Cloruro de sodio Etanol Ácido clorhídrico Ácido sulfúrico

METODO: Preparación de soluciones A. Soluciones porcentuales (%). Material: cloruro de sodio (NaCl); sacarosa (C11H22OH10); agua destilada. Procedimientos: a. Preparar 50 ml de solución de cloruro de sodio al 10% (p /v). b. A partir de la solución de cloruro de sodio al 10%, preparar 100 ml de una solución salina al 1%. c. A partir de una solución de etanol al 96% (v /v), preparar 50 mililitros de una solución de etanol al 18 % (v/ v) en agua. B. Soluciones molares. Material: cloruro de sodio; agua destilada, ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorhídrico (HCl). Procedimientos: Preparar 100 ml de una solución de cloruro de sodio 0.5M. a. A partir de la solución anterior, preparar 100 ml de una solución 0.1 M de cloruro de sodio. b. Preparar 100 ml de una solución 0.1 M de ácido clorhídrico. c. Preparar 100 ml de una solución 0.1 M de ácido sulfúrico. C. Soluciones normales Material: cloruro de sodio; agua destilada, ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorhídrico (HCl). Procedimiento: a. Preparar 50 ml de una solución de NaCl 0.4 N b. Prepare 50 ml de los reactivos restantes a una concentración 0.4 N. D. Soluciones molales. Material: sacarosa; agua destilada. Procedimiento: Preparar 100 ml de una solución de sacarosa 0.5 molal. CUESTIONARIO:

Defina los siguientes términos: mol, equivalente químico, normalidad, molaridad, molalidad, solución porcentual p/ p, solución porcentual p/ v, solución porcentual v/ v.

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PRACTICA NO. 3 FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS

OBJETIVO: El alumno efectuará e interpretará la prueba de fragilidad osmótica de los eritrocitos frente a soluciones salinas hipotónicas.

INTRODUCCIÓN: La osmolaridad del plasma sanguíneo oscila normalmente entre 290 a 310 miliosmolas por litro. Una solución con esta osmolaridad es isotónica con respecto al plasma y recibe el nombre de solución fisiológica. Ejemplo: Una solución de cloruro de sodio al 0.8 por ciento (p/v) y una solución de glucosa al 5 por ciento (p/v) son isotónicas con respecto al plasma y, por lo tanto, son soluciones fisiológicas. Las soluciones que contienen mayor número de osmolas por litro que el plasma son hipertónicas, en tanto que las que tienen menor número de osmolas son hipotónicas. Cuando se depositan glóbulos rojos en una solución isotónica al plasma, no sufren cambios en su volumen y contenidos; en cambio, si se colocan glóbulos rojos en una solución hipertónica, sale agua del interior celular. Por otra parte, al poner en contacto glóbulos rojos con una solución hipotónica o, en un caso extremo, con agua destilada, el agua penetra al interior de las células. Una anemia hemolítica es el resultado de una elevada tendencia a la destrucción de los glóbulos rojos; la clasificación de este tipo de anemias se basa en la identificación del factor causante de la hemólisis, el cual puede ser de naturaleza hereditaria (factor intracorpuscular) o adquirida (factor extracorpuscular). Se ha estudiado el límite de tonicidad de los eritrocitos y se ha visto que la fragilidad osmótica está aumentada en la esferocitosis hereditaria, en algunas ocasiones en la enfermedad hemolítica autoinmune, en la enfermedad hemolítica del recién nacido (por anticuerpos anti-A y, con menos frecuencia, por anticuerpos anti-Rh) y en la anemia hemolítica por envenenamiento químico o por quemaduras graves. Por el otro lado, se ha observado una menor fragilidad osmótica de los eritrocitos en la talasemia, en la anemia de células falciformes (drepanocitosis) y en trastornos en los que aparecen eritrocitos de escaso espesor (dianocitos o células “en blanco de tiro”).

MATERIAL: Tubos de ensayo de 5 ml Gradilla Pipetas de 1 y 5 ml Jeringa Torunda Torniquete Guantes desechables Parafilm

REACTIVOS: Tubo con Hepárina sódica NaCl 0.5% (p/v) Agua destilada

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METODO: 1.- Obtener por punción venosa sangre heparinizada (10 ml). 2.- Montar una serie de tubos como se indica en la tabla siguiente: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

NaCl 0.5% (ml) 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4

Agua destilada (ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1

Sangre completa (ml) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

Con (%) 0.50 0.48 0.46 0.44 0.42 0.40 0.38 0.36 0.34 0.32 0.30 0.28

3.- Tapar cada tubo. Agitar suavemente por inversión. 4.- Dejar reposar durante 1 a 2 horas, observando cada 30 minutos. Importante: no mover la gradilla. 5.- Se debe tener cuidado de no agitar los tubos para poder observar si en el sobrenadante hay hemólisis. Anotar en qué tubo se inicia ésta y en cuál es total

INTERPRETACIÓN Normal:

Inicio de hemólisis........................... 0.44 a 0.38% Hemólisis total................................. 0.34 a 0.30%

CUESTIONARIO: Defina los términos siguientes: a) osmolaridad b)

ósmosis

c) solución isotónica d)

solución hipertónica

e)

solución hipotónica

f)

fragilidad osmótica, anemia

g) anemia hemolítica, h) anemia auto inmune, i)

talasemia,

j)

drepanocitosis,

k) dianocito.

14

PRACTICA NO. 4 MEDICION DE LA ACTIVIDAD DEL ION HIDROGENO EN SOLUCIONES ACUOSAS

OBJETIVO: 1.-Conocer y aplicar algunos métodos para la determinación de pH. 2.- Determinar el pH de varias sustancias problemas. INTRODUCCIÓN: C O N C E P T O D E pH Para poder comprender qué es pH, es necesario revisar antes algunos conceptos, tales como: ácido, base, disociación, ionización y concentración. Por otra parte, resulta indispensable tener una idea precisa acerca de los logaritmos. Disociación. La disociación es el proceso de separación de uno o más elementos de una molécula compuesta, que da como resultado fragmentos más simples: átomos, radicales libres, iones. En los sistemas biológicos, el agua es el solvente en el que se encuentran disueltos los compuestos disociados. Cuando una molécula se separa dando iones positivos (cationes) e iones negativos (aniones), el proceso de disociación puede ser también llamado ionización. +

Ácido y base. Se define como ácido a una sustancia capaz de ceder protones (H ) en solución. El grado de acidez dependerá del número de protones o hidrogeniones libres. En general, se consideran dos tipos de ácidos: fuertes y débiles. Un ácido fuerte es el que se disocia casi por completo y, por tanto, deja libres a prácticamente todos los hidrogeniones que posee. Un ácido débil es aquél que se disocia parcialmente, de tal manera que la mayoría de los protones se encuentran unidos al anión (base conjugada) y sólo una pequeña proporción de ellos están libres. Una base o álcali es una sustancia capaz de aceptar o combinarse con protones y/o capaz de incrementar la concentración de iones oxhidrilo (OH ) en solución. Los ácidos y las bases se neutralizan mutuamente, molécula a molécula, ya que las bases aceptan los protones de los ácidos cuando ambos son mezclados. Como resultado, se establece un equilibrio entre las cargas del ácido y las de la base y, por consiguiente, la ausencia de protones libres. Las substancias que pueden actuar indistintamente como ácidos o como bases son conocidas como anfotéricas. Grado de acidez o alcalinidad. Para poder valorar el grado de acidez o alcalinidad de una sustancia, se ideó una escala basada en la concentración de hidrogeniones libres obtenidos por la disociación del agua. La cantidad de moléculas de agua disociadas puede variar conforme a su pureza y a la temperatura, pero la relación entre la concentración de moléculas de agua disociadas y la concentración de moléculas de agua no disociadas permanece constante. A esta constante se le denomina constante de disociación del agua (KD). +

-

KD = [H ][ OH ]/[H2O]

(1)

15

El agua pura, a 25 °C, tiene una [H ] = [OH ] = 1.0 x 10 M. La [H2O] = 55.555 M. y, para fines prácticos, se puede considerar que permanece constante ante el evento de disociación. Por lo tanto, la ecuación (1) puede rearreglarse definiendo una nueva constante, la KW o constante del producto iónico del agua, la cual tiene un valor numérico, a 25 °C, de 1.0 x 10-14 (¿por qué?). +

-

-7

+

-

-14

[H2O] KD = KW = [H ][ OH ] = 1.0 x 10

(2)

El danés Sörensen inventó una manera abreviada para referirse a la concentración de protones libres en solución, que denominó pH, el cual se define como: pH = log 1/[ H+] = - log [H+]

(3)

De manera análoga, podría definirse pOH como: pOH = log 1/[ OH ] = - log [OH-] -

(4)

Generalizando, pK = log 1/K = - log K

(5)

Así pues, el pH del agua pura a 25 °C es igual a 7, y el pOH = 7.0 (¿por qué?). Si se aplican logaritmos negativos a cada uno de los miembros de la ecuación (2), se obtiene la relación siguiente: pKw = pH + pOH = 14 (6) En consecuencia, el valor mínimo de pH es 0 y su valor máximo es 14. Asimismo, pOH puede tener un valor mínimo de 0 y un valor máximo de 14. De la ecuación (6) también se deduce que al aumentar el valor de pH, disminuye el valor de pOH y viceversa. Escala de pH. [H ] 1 +

[OH− ]

pH 0

pOH 14

1 x 10

-1

1

13

1 x 10

-2

2

12

1 x 10

-3

3

11

1 x 10

-4

4

10

1 x 10

-5

5

9

1 x 10

-6

6

8

1 x 10

-7

7

7

1 x 10

-8

8

6

1 x 10

-9

9

5

1 x 10

-10

10

4

1 x 10

-11

11

3

1 x 10

-12

12

2

1 x 10

-13

13

1

-14

14

0

1 x 10 1

1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10

Sol. NEUTRA

-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

*Concentraciones en molas/litro a 25 °C. + Se dice que el pH = 7 es neutro, ya que en dicha situación [ H ] = [OH-]. Un pH menor que 7 es ácido, pues predominan los protones sobre los oxhidrilos libres. Finalmente, un pH mayor que 7 es básico o alcalino, ya que predominan los oxhidrilos sobre los protones libres en solución.

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INDICADORES DE pH Existen varios colorantes orgánicos, sintéticos o de origen natural, que cambian de color cuando varía el pH de la solución en la que se encuentran disueltos. Ya que la mayoría de los ácidos y las bases empleados en el laboratorio son incoloros, los indicadores son útiles al hacer posible que los cambios de pH sean observables por las variaciones en la coloración de las soluciones. Los indicadores de pH son usualmente ácidos o bases débiles. En el caso de un ácido, su disociación puede representarse como sigue: HInd

+

H + Ind

-

Cuando se agrega una base a la forma ácida del indicador (HInd), aquélla reacciona con él para obtener la forma básica del indicador (Ind-). Se forma de este modo un sistema amortiguador y, por lo tanto, su pH se puede calcular de la misma forma que en otras soluciones amortiguadoras. En el caso de algunos indicadores, su color es determinado por la disociación de la sustancia, como sucede con el rojo de metilo. La forma ácida (no disociada) es roja; la forma básica es amarilla. Dependiendo de la proporción que guarden las concentraciones de ambas formas, se pueden observar todas las tonalidades intermedias entre estos colores extremos. En otros casos, como el de la fenolftaleina, una forma del indicador es incolora y la otra es coloreada. El color final de la solución depende de la cantidad presente de la forma coloreada. Los indicadores pueden usarse para determinar el pH de alguna solución, mediante la comparación entre el color del indicador en una solución de pH conocido y el color del indicador en la solución problema.

A LG U N O S I ND I C AD O R E S D E p H D E U SO F RE CU E NT E NO M B R E V U L G A R Azul de timol Anaranjado de metilo Verde de bromocresol Azul de bromofenol Rojo de metilo Rojo de clorofenol Púrpura de bromocresol Azul de bromotimol Rojo de fenol Rojo de cresol Azul de timol Fenolftaleína Timolftaleína Rojo congo Rojo de alizarina Tornasol Rojo neutro

pK 1.7 3.5 4.7 4.0 5.1 6.0 6.2 7.0 7.9 8.3 8.9 9.7 9.9

6.85

COLOR Y ZONA ÚTIL DE rojo 1.2 amarillo rojo 3.1 amarillo amarillo 3.8 azul amarillo 3.0 azul rojo 4.2 amarillo amarillo 5.1 rojo amarillo 5.4 púrpura amarillo 6.0 azul amarillo 6.8 rojo amarillo 7.2 rojo amarillo 8.0 azul incoloro 8.3 rojo amarillo 9.3 azul azul-rojo 3.0 violeta amarillo 3.7 rosa rojo 5.0 azul amarillo 6.8 naranja

pH 2.8 4.4 5.5 4.6 6.3 6.7 7.0 7.6 8.4 8.8 9.6 10.0 10.5 5.2 4.2 8.0 8.0

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preparacion de una escala colorimÉtrica de pH mediante el uso de buffer estandar e indicadores Este método de estimar el pH se basa en el hecho de que un indicador ácido-base, existe en solución como dos especies de diferente color en un intervalo de pH alrededor de su pKa. Los indicadores son ácidos débiles cuyas formas no disociadas (Hind) y disociada (Ind) tienen color diferente. Por medio de la preparación de una serie de soluciones amortiguadoras cuyos valores de pH son conocidos y se agrupan alrededor del pKa del ácido indicador, y que contienen la misma concentración del mismo, se obtiene una escala colorida estándar en la que la tonalidad de cada solución depende de su valor de pH particularmente añadiendo la misma concentración de indicador que la presente en las soluciones estándar. El color de la solución problema es entonces comparado visualmente o colorimétricamente con los colores de la serie de los buffers estándar. De esta manera es posible conocer el pH de una solución con una aproximación de 0.2 unidades de pH. Este procedimiento esta sujeto a errores. A menudo las soluciones que contienen proteínas muestran grandes variaciones de pH debido a que las proteínas pueden unirse a una u otra forma del indicador, por lo que ocurre un desplazamiento en el equilibrio de su disociación. Un segundo error es causado por la presencia de otras sustancias coloridas en la solución. Este puede cancelarse, si la interferencia no es muy grande, mediante el empleo de un tubo “blanco” de la sustancia colorida en el que el indicador esta ausente.

Uso del potenciómetro: El pH es formalmente definido como el logaritmo negativo de la actividad del ión hidrógeno. Algunas aproximaciones a la verdadera actividad del ión hidrógeno pueden ser medidas por medio del electrodo de hidrogeno. Este consiste en un electrodo platinado sumergido en la solución que va a ser probada. Se hace pasar gas hidrogeno a través de la solución la media celda así formada consiste de H2 gaseoso en equilibrio con iones H+, generándose un potencial eléctrico medible. El potencial medido con un electrodo de hidrógeno, a una atmósfera de presión y en una solución que contiene la unidad de actividad del ión hidrógeno, es considerado igual a cero a todas las temperaturas. Este es el estándar. En ocasiones, el pH determinado con el electrodo de hidrógeno es arbitrario, y se han adoptado algunas conversiones para la relación entre el pH y el potencial eléctrico, de manera que los valores de pH determinados por otros procedimientos y en diferentes laboratorios pueden ser comparados. En todos los casos, la solución estándar usada para relacionar el pH a la fuerza electromotriz deberá especificarse. Como el electrodo de hidrógeno no es adecuado para estimar el pH de soluciones que contienen substancias reductoras, es necesario usar otro método para dichas soluciones. Uno conveniente emplea el electrodo de vidrio. El electrodo de vidrio es una membrana delgada de un vidrio especial. Esta membrana encierra una media celda delgada de plata-cloruro de plata (Ag -AgCl). La otra mitad de la celda es un electrodo de calomel formado por cloruro de mercurio (HgCl2) sobre mercurio sólido. En el interior de la celda de vidrio que contiene el electrodo de calomel hay ácido clorhídrico 0.1 M, solución que establece un pH constante y conocido en un lado de la membrana de vidrio. Un puente de KCl conecta la solución de pH desconocido con la media celda.

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MATERIAL: 15 Tubos de ensayo de Gradilla 2 Pipetas de 10 ml 4 pipetas de 5 ml

REACTIVOS: CH3COOH 0.2 M. CH3COONa 0.2 M. KH3PO4 0.1 M NaOH 0.1 M Ácido bórico-KCl 0.1 M Ácido bórico 0.1 N. INDICADORES: Anaranjado de metilo. Rojo de metilo. Azul de bromotimol . Rojo de cresol. Fenolftaleína. Azul de timol. 3 soluciones problema de pH desconocido.

METODO: PREPARACION DE ESCALA COLORIMETRICA DE pH UTILIZANDO INDICADORES 1.- Para realizar la escala de pH en un rango de 3.6 - 10, se dividirá el grupo en 3 equipos cada uno de los equipos preparará una serie de pH, en donde tendrán once valores de pH diferentes, a cada equipo corresponde preparar lo siguiente: EQUIPO No. 1 No. DE TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH A PREPARAR 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6

CH3COOH 0.2 M 9.3 ml 8.8 ml 8.2 ml 7.3 ml 6.3 ml 5.1 ml 4.0 ml 2.9 ml 2.1 ml 1.4 ml 0.9 ml ADICIONAR PRIMERO

CH3COONa 0.2 M 0.7 ml 1.2 ml 1.8 ml 2.7 ml 3.7 ml 4.9 ml 6.0 ml 7.1 ml 7.9 ml 8.6 ml 9.1 ml ADICIONAR DESPUES

Después agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones: A la primera serie de 5 tubos (tubos del 1 al 5) adicionar 5 gotas del indicador anaranjado de metilo y agitar cada tubo. A los tubos 6 al 11 adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo y agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos. Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación de sus problemas.

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EQUIPO No. 2 No. DE TUBO 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

pH A PREPARAR 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0

KH2PO4 0.1 M 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml ADICIONAR EN 1º LUGAR

NaOH 0.1 M O.6 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.7 ml 2.3 ml 2.9 m 3.4 ml 3.9 ml 4.2 ml 4.5 ml 4.6 ml ADICIONAR EN 2º LUGAR

H2O DEST. 4.4 ml 4.2 ml 3.8 ml 3.3 ml 2.7 ml 2.1 ml 1.6 ml 1.1 ml 0.8 ml 0.5 ml 0.4 ml ADICIONAR EN 3º LUGAR

Después agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones: A los tubos del 12 al 18 adicionar 5 gotas del indicador azul de bromotimol y del 19 al 22 rojo de cresol, y agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos. Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación de sus problemas. EQUIPO No. 3 No. DE TUBO

pH A PREPARAR

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0

AC. BORICO-KCl 0.1 M 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml ADICIONAR EN 1º LUGAR

NaOH 0.1 M

H2O DEST.

0.6 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.6 ml 2.1 ml 2.7 ml 3.2 ml 3.7 ml 4.1 ml 4.4 ml ADICIONAR EN 2º LUGAR

4.4 ml 4.2 ml 3.8 ml 3.4 ml 2.9 ml 2.3 ml 1.8 ml 1.3 ml 0.9 ml 0.6 ml ADICIONAR EN 3º LUGAR

Después agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones: A los tubos del 23 al 26 adicionar 5 gotas del indicador azul de timol y agitar cada tubo. A los tubos del 27 al 32 adicionar 5 gotas del indicador fenolftaleina y agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos. Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación de sus problemas. 2.- Reúnanse los 3 equipos con la serie de tubos que prepararon para llevar a cabo la comparación visual de sus problemas.

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3.- Determinar el pH de las tres soluciones problema por medio de comparación visual. Para determinar el pH tomar 10 ml de cada solución, colocarlas en su respectivo tubo de ensaye y agregar 5 gotas del indicador que se le indique. Comparar la coloración de valor de pH medido con el potenciómetro para realizar la comparación práctica. Reportar los valores de pH obtenidos en la práctica y teóricamente en una tabla. SOLUCION DE: PROBLEMA

pH ESCALA COLORIMETRICA

pH POTENCIOMETRO

1 2 3

TAREA: TRAER PARA LA PRÁCTICA SIGUIENTE MUESTRAS DE LECHE BRONCA Y DE DISTINTAS MARCAS DE LECHE PASTEURIZADA Y ULTRAPASTEURIZADA.

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PRACTICA No 5 TITULACIÓN ÁCIDO - BASE Y DETERMINACIÓN DE LA ACIDEZ EN LA LECHE OBJETIVOS: Al término de la práctica el alumno será capaz de: 1.- Determinar la normalidad aparente de un ácido, titulándolo con una base cuya concentración es conocida. 2.- Determinara la acidez o alcalinidad de diferentes muestras de leche e indicar si la leche es apta para consumo humano.

INTRODUCCIÓN.

La titulación es un tipo de análisis volumétrico mediante el cual se determina la concentración de una sustancia en solución utilizando otra solución cuya concentración se conoce. Titulación ácido-básica: Una solución conocida de una base puede utilizarse para determinar la concentración de un ácido y viceversa. Como es sabido, los ácidos y las bases se neutralizan mutuamente: ácido + base = sal + agua. Ejemplo: HCl + NaOH = NaCl + H20. Un mol de base neutraliza exactamente a un mol de ácido, de tal manera que, conociendo la concentración y el volumen de base empleados para neutralizar un volumen conocido de un ácido, se puede calcular la concentración del ácido problema. Como no sería posible darse cuenta de cómo ocurre esta reacción y en cuál momento se ha neutralizado por completo la solución problema (ésa cuya concentración se desconoce), se requiere el empleo de algo que posibilite su observación; por ejemplo, una sustancia que cambie de color al variar el pH de la solución que la contiene (indicador de pH). La titulación ácido-básica puede efectuarse de la manera siguiente: la solución tipo o estándar (solución cuya concentración se conoce) se coloca en una bureta. Al leer la graduación debe tomarse como referencia el nivel inferior del menisco (parte más convexa) cuando se emplean líquidos transparentes, y el nivel superior cuando se trata de líquidos opacos. El ojo del observador debe estar al nivel del menisco para evitar errores de paralaje. La solución problema se coloca en un matraz Erlenmeyer. Se le añaden unas gotas de indicador de pH, el cual le dará un color característico. Por ejemplo, el rojo de fenol es de color amarillo en solución ácida y de color rojo en solución alcalina. Así, si se tiene un ácido fuerte cuya concentración se desconoce, se le agrega rojo de fenol y se añade gota a gota una solución básica de concentración conocida, llegará un momento en el que el color no será amarillo ni rojo, sino un color intermedio correspondiente a una solución neutra. La solución tipo debe dejarse caer gota a gota sobre la solución problema, al tiempo que se agita el matraz. Es conveniente colocar debajo del matraz que contiene la solución problema una hoja de papel blanco, para observar el cambio de coloración (punto de vire). Acidez y pH. Existen dos maneras de expresar la acidez de una solución. La primera es la + acidez total o titulable. La segunda es la concentración de iones hidrógeno (H ) libres en solución. Por ejemplo, una solución 1 N de ácido benzoico tiene la misma acidez total que una de ácido clorhídrico 1 N, pero esta última tiene una concentración de iones hidrógeno libres que es cerca de 100 veces más grande que la primera (¿por qué?).

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Sörensen (1909) adoptó el término pH como una medida de la concentración de iones hidrógeno y lo definió como el logaritmo (base 10) negativo de la concentración de iones + + hidrógeno, expresada en moles por litro: pH = log10 1/[H ] = - log10 [H ]. Cálculos estequiométricos. La unidad práctica usada en los cálculos de estequiometría es el miliequivalente (mEq: milésima parte de un equivalente). Un mililitro (ml) de una solución 1 N contiene un miliequivalente de soluto. Esta es una unidad práctica y conveniente ya que se puede calcular el número de mili equivalentes de soluto en una solución dada, multiplicando simplemente su normalidad (mEq/ ml) por el volumen (en ml). Por ejemplo, 25.0 ml de NaOH 0.080 N contienen 25.0 x 0.080 = 2 mEq de NaOH. Ya que un miliequivalente de ácido equivale químicamente a un miliequivalente de base, la siguiente relación resulta obvia: Normalidad1 x Volumen1 = mEq = Normalidad2 x Volumen2 y en forma abreviada: N1 x V1 = N2 x V2. La ecuación anterior puede utilizarse en la resolución de problemas como el que a continuación se plantea: 25.0 ml de NaOH 0.080 N fueron neutralizados exactamente con 32.0 ml de una solución de HCl. ¿Cuál es la normalidad de la solución de ácido? Dado que N1 x V1 = N2 x V2, entonces N1 = (N2 x V2)/V1 = (25.0 x 0.080)/32 = 0.0625 N Determinación de la Acidez de la Leche.

La prueba se basa en la saturación de las funciones ácidas de la leche mediante un álcali, en presencia de un reactivo indicador cuyo color descubre el final de la reacción. Estequiometría. El número de mililitros (ml) gastados de NaOH 0.1 N se puede transformar en partes de ácido láctico por volumen de leche multiplicándolo por 0.009, factor que representa la cantidad de ácido neutralizada por un ml de sosa 0.1 N. Ejemplo: se gastaron 2.2 ml de NaOH 10 N para titular 10 ml de leche. Entonces, la leche contiene 2.2 x 0.009 = 0.0198 partes de ácido Láctico 10 ml, o bien, 0.198 partes en 100 ml, o bien, 1.98 partes en 1,000 ml. El Reglamento de la Secretaría de Salud establece que la leche apta para su consumo debe tener, en cuanto a acidez en ácido láctico, no menos de 1.4 ni más de 1.7 por mil.

METODOLOGÍA. Experimento #1: Titulación de un ácido fuerte con una base fuerte. Materiales. Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, matraz Erlenmeyer, vasos de precipitado, pipetas de Mohr, solución de ácido clorhídrico (problema), solución de hidróxido de sodio 0.1 N, solución de azul de bromotimol. Procedimiento. Medir exactamente 10.0 ml de una solución problema de ácido clorhídrico y verterlos a un matraz Erlenmeyer. Añadir tres gotas de azul de bromotimol. Titular con NaOH 0.1 N hasta el punto final. Calcular la normalidad aparente del ácido.

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Experimento #2: Titulación de un ácido débil con una base fuerte. MATERIALES. Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, matraz Erlenmeyer, vasos de precipitado, pipetas de Mohr, solución de ácido acético (problema), solución de hidróxido de sodio 0.1 N, solución de fenolftaleína. PROCEDIMIENTO. Medir exactamente 10.0 ml de una solución problema de ácido acético y verterlos a un matraz Erlenmeyer. Añadir tres gotas de fenolftaleína. Titular con NaOH 0.1 N hasta el punto final. Calcular la normalidad aparente del ácido.

Experimento # 3: Determinación de la Acidez de la Leche. MATERIALES. Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, cápsula de porcelana, agitador de vidrio, vasos de precipitado, pipetas de Mohr, solución de hidróxido de sodio 0.1 N, solución de fenolftaleína al 1% en alcohol, muestra (s) de leche. PROCEDIMIENTO 1. Llenar la bureta con la solución de NaOH 0.1 N. 2. Mezclar perfectamente la leche que va a ser estudiada (bronca, pasteurizada o ultrapasteurizada. 3. Transferir 10 ml de leche a la cápsula de porcelana. 4. Añadir tres gotas de solución de fenolftaleína a la muestra de leche. Mezclar. 5. Añadir gota a gota a la cápsula de porcelana la solución de NaOH que contiene la bureta, agitando constantemente. La prueba termina cuando se obtiene un color rosa o salmón en la leche. 6. Repetir el procedimiento con todas las muestras de leche.

RESULTADOS Calcular la acidez en ácido láctico (partes por 1,000 ml) de cada una de las muestras. ¿Cumple(n) la(s) leche(s) con el reglamento sanitario?

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PRACTICA NO. 6 PREPARACIÖN DE UN BUFFER Y SU ACCION AMORTIGUADORA OBJETIVO. Preparar una solución buffer y observar su acción amortiguadora en material biológico. INTRODUCCIÓN. La definición más general de una solución amortiguadora o buffer es que son soluciones que resisten mucho los cambios de pH cuando se les añaden ácidos o bases. Casi siempre están formadas por ácidos débiles y sus sales. Al agregar iones de hidrógeno en forma de un ácido fuerte a una solución amortiguadora, descompone la sal de la mezcla buffer y se forma un ácido débil que se disocia poco a poco y por lo tanto no modifica el pH en forma significativa. Cuando se añade a la misma solución amortiguadora iones OH en forma de una base fuerte, reacciona con el ácido de la mezcla buffer y se forma agua y una sal disociada, que tampoco determina una notable variación del pH. Ejemplo: Se tiene una solución amortiguadora formada por un ácido débil, ácido acético y su base conjugada (acetato de sodio) en solución, el ácido acético esta débilmente ionizado y el acetato de sodio esta fuertemente ionizado: CH3COOH CH3COONa

H + Na +

-

CH3COO CH3COO

-

La mayor parte de los iones CH3COO provienen del acetato de sodio si se le añade un ácido fuerte por ejemplo HCl la reacción que ocurre es la siguiente: +

-

+

-

+

-

Na + CH3COO + H + Cl Na + Cl + CH3COOH Si a ese sistema se le añade una base fuerte por ejemplo NaOH se le da la siguiente ecuación: H+ + CH3COO- +

Na+

+

OH-

CH3COONa

+

H2O

Por lo anterior se asume que el cambio de pH es mínimo. El pH de cualquier sistema amortiguador puede calcularse con la ecuación de HendersonHasselbalch. pH = pKa +

log (CH3COO-/CH3COOH)

Las sustancias amortiguadoras o buffers tienen un papel importante para la regulación del pH en los medios biológicos celulares y extracelulares. Su función es reducir al mínimo los cambios en la concentración de iones hidrógeno y por lo tanto, también en la concentración de iones hidroxilo, cuando se agregan pequeñas cantidades de ácidos o bases.

Para describir un sistema amortiguador se requieren dos parámetros: 1.- El pH de la solución amortiguadora: El cual indica la región de concentración del ión hidrógeno en el cual se realiza el efecto amortiguador (alrededor de +/- una unidad de pH amortiguador).

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2.- La Capacidad Amortiguadora: Es decir, la capacidad de resistir la adición de ácido o base con poco cambio de pH, lo que se relaciona de manera directa con la concentración de todos los constituyentes del amortiguador. Para que los procesos bioquímicos del cuerpo se produzcan en forma adecuada es necesario que la concentración de iones hidrógeno se controle con extrema precisión. Por ejemplo, el pH de la sangre se encuentra dentro de los limites de 7.3 - 7.5 siendo regulado por el sistema amortiguador bicarbonato/ ácido carbónico. Otro sistema importante son los grupos laterales de la histidina en la hemoglobina. En la saliva el sistema Ácido Carbónico /Bicarbonato y Fosfato. Algunos amortiguadores y los rangos de pH en que actúan son los siguientes:

Fosfato ácido de potasio. Acetato de sodio. Ftalato ácido de potasio. Fosfato ácido de potasio. Ácido bórico. Ácido bórico. Fosfato disódico.

Amortiguador. Ácido clorhídrico. Ácido acético. Hidróxido de sodio. Hidróxido de sodio. Borato de sodio. Hidróxido de sodio. Hidróxido de sodio.

PH aproximado. 1.8 – 3.8 3.6 – 5.6 4.0 – 6.0 5.8 – 7.8 7.5 – 9.5 8.2 – 10.2 10.5 – 12.0

MATERIAL Y REACTIVOS. 4 vasos de precipitado de 100 ml 2 pipetas de 10 ml 4 pipetas de 5 ml 6 tubos de ensaye 1 gradilla 2 pipetas Pasteur con bulbo 1 Vaso de precipitado de 250 ml 1 Potenciómetro

100 ml. de KH2PO4 0.15 M. 100 ml. de Na2HPO4 0.15 M. NaOH 0.1 M HCl 0.1 M Albúmina de huevo al 2 %, 75 ml Agua destilada

PROCEDIMIENTO. I.- PREPARACIÓN DE LA SOLUCION BUFFER. En un vaso de precipitado de 250 ml colocar 77 ml de la solución de KH2PO4 0.15 M. Añadir 49 ml de la solución de Na2HPO4 0.15 M y medir con el potenciómetro hasta obtener un pH de 7.0 (Si es necesario regular utilice cualquiera de las dos soluciones para lograr el pH solicitado. Guarde su solución buffer para el experimento número dos.

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II.- ACCIÓN AMORTIGUADORA DEL BUFFER PREPARADO Y UN BUFFER BIOLÓGICO. Poner en una gradilla dos series de tubos numerados del 1 al 6, seguir con las indicaciones dadas por la siguiente tabla: TUBO No. 1 2 3 4 5 6

SOLUCION A COLOCAR 10 ml H2O destilada 10 ml solución buffer preparada 10 ml albúmina de huevo 10 ml H2O destilada 10 ml solución buffer preparada 10 ml de albúmina de huevo

PH INICIAL

ADICIONAR

pH FINAL

4 gotas HCl 0.1 N 4 gotas HCl 0.1 N 4 gotas HCl 0.1 N 4 gotas de NaOH 0.1 N 4 gotas de NaOH 0.1 N 4 gotas de NaOH 0.1 N

1.- Realizar primero la medición del pH de las soluciones que se indican en el tubo 1 al 6 antes de agregar el HCl y el NaOH. 2.- Después con el mismo potenciómetro determinar la capacidad amortiguadora de cada solución midiendo el pH final después de la adición del ácido y la base fuerte.

PRESENTACION DE RESULTADOS. a) Del experimento I, reportar el pH obtenido para la solución buffer preparada. b) Del experimento II, reportar el pH inicial y final obtenido para cada tubo y explicar sus resultados obtenidos.

CUESTIONARIO. 1.- ¿Por qué el agua destilada observa mayor alteración de pH?. 2.- ¿Por qué considera que la albúmina de huevo debe tener propiedades amortiguadoras?. 3.- ¿Que papel desempeñan las soluciones buffer dentro de la bioquímica? (En general. 4.- Qué sucede cuando en un sistema amortiguador la concentración molar de la sal y el ácido que integran la solución son iguales?.

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PRACTICA NO. 7 PROPIEDADES QUÍMICAS DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO Caracterizar, hasta donde sea posible, un carbohidrato problema mediante algunas pruebas químicas cualitativas.

INTRODUCCIÓN. Los azúcares se comportan como ácidos débiles y tienen las características químicas de aldehídos o cetonas. Por ello, los álcalis aumentan la enolización de los azúcares. La tautomerización es una reacción típica de azúcares, los cuales contienen un grupo aldehído libre o un grupo cetónico. En ausencia de álcali existe un equilibrio entre las formas enólicas y cetónicas, predominando estas últimas. Cuando se les añade álcali, los enoles ácidos forman una sal y, por efecto de la acción de masas, se desplaza el equilibrio hacia la derecha. La adición de ácido a una mezcla en equilibrio alcalino, restablece el equilibrio tautomérico hacia la forma cetónica. Otra reacción importante es la que ocurre entre el grupo carbonilo y un alcohol, formando hemiacetales y acetales. Un monosacárido posee ambos grupos funcionales (carbonilo y alcohol) en su molécula y puede reaccionar con otros azúcares. La reacción puede ocurrir también dentro de una misma molécula de azúcar, dando paso a la formación de hemiacetales cíclicos. Ahora bien, muchas de las propiedades de los azúcares simples sólo pueden ser explicadas suponiendo la formación del anillo, siendo ésta la forma más estable de las moléculas. Los álcalis disminuyen la formación del anillo al favorecer la formación de la sal enólica.

PARTE EXPERIMENTAL Para el desarrollo de los siguientes experimentos se utilizarán soluciones de glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y almidón, a una concentración de 1 % (p/v).

A. PRUEBA DE MOLISH. Objetivo. Detectar la presencia de carbohidratos. Reactivos. Reactivo de Molish (sol. de alfa-naftol en etanol, al 95%) y ácido sulfúrico concentrado. Fundamento. La reacción depende de la formación de furfural y sus derivados por la acción deshidratante del ácido sobre un carbohidrato. El furfural se combina con el alfa-naftol para formar un compuesto coloreado. Aunque no es una prueba específica, un resultado negativo (ausencia de color) sugiere la ausencia de carbohidratos. Procedimiento. A 0.5 mililitro (ml) de cada una de las soluciones que van a ser probadas, añada 1 gota del reactivo de Molish. Agite los tubos. En cada caso, incline el tubo y añada, de manera lenta y cuidadosa, 0.75 ml de ácido sulfúrico concentrado (15 gotas). Resultado positivo. Aparición de un color violeta en la unión entre los líquidos.

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B. PRUEBA DE BENEDICT. Objetivo. Detección de azúcares reductores. Fundamento. Las soluciones alcalinas de cobre son reducidas por azúcares que poseen un grupo aldehído o cetónico libre y se forma óxido cuproso insoluble. Reactivo. Solución de Benedict (contiene sulfato cúprico, carbonato de sodio y citrato de sodio). Procedimiento. A 1.25 ml de solución de Benedict añada exactamente 0.25 ml de cada una de las soluciones que van a ser probadas. Sumerja los tubos en un baño de agua hirviente durante 5 minutos. Posteriormente, permita que se enfríen lentamente. Observe el color y si se forma un precipitado. Un cambio en el color de la solución no indica un resultado positivo. Deberá producirse un precipitado de color amarillo, verde o rojo.

C. PRUEBA DE BARFOED. Objetivo. Detectar monosacáridos en presencia de disacáridos Fundamento. La reacción de Barfoed difiere de la de Benedict en que la reducción ocurre en medio ácido. IMPORTANTE: Los disacáridos también responderán a la prueba si la solución de azúcares es hervida durante un tiempo suficiente para producir hidrólisis. Reactivos. Reactivo de Barfoed: Contiene sulfato cúprico y ácido láctico disueltos en agua. Procedimiento. Coloque en un tubo de ensaye 0.25 ml de la solución problema y 0.25 ml de la solución de Barfoed (hacerlo para todas las soluciones que se van a probar). Prepare un tubo control: 0.25 ml de agua más 0.25 ml de la solución de Barfoed. Sumerja los tubos en un baño de agua hirviente durante 3 minutos. Permita que se enfríen. Añada a cada tubo 0.25 ml del reactivo de ácido fosfomolíbdico. Agite los tubos. Resultado positivo. Un color azul oscuro es indicativo de la presencia de monosacáridos.

D. PRUEBA DE SELIWANOFF. Objetivo. Detección de cetosas. Fundamento. Esta prueba depende de la formación del 4-hidroximetil-furfural y de su reacción posterior con el 1,3-dihidroxibenceno (resorcinol), de la que resulta un compuesto de color rojo cereza. En general, la prueba es específica para cetosas; sin embargo, grandes cantidades de glucosa u otros azúcares pueden interferir produciendo compuestos de color similar. Reactivo. Reactivo de Seliwanoff: Contiene resorcinol disuelto en ácido clorhídrico. Procedimiento. A 0.5 ml del reactivo de Seliwanoff añada 1 gota de cada una de las soluciones que van a ser probadas. Sumerja los tubos en agua hirviente durante 2 minutos. Observe el color que se desarrolla. Si se produce un precipitado, fíltrelo y disuélvalo en etanol, el cual, en caso de un resultado positivo, debe adquirir color rojo. Resultado positivo. Un color rojo cereza es indicativo de la presencia de cetosas.

RESULTADOS Construya una tabla con los resultados obtenidos con las diferentes soluciones (incluyendo la solución problema) en las diferentes pruebas.

DISCUSIÓN Para cada una de las soluciones problema conteste las siguientes preguntas 1. ¿Contiene carbohidratos? 2. Si la respuesta anterior es afirmativa, a. ¿Se trata de un carbohidrato reductor? b. ¿Es un monosacárido? c. ¿Es una cetosa?

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PRACTICA NO. 8 PREPARACION DE UNA CURVA PATRON PARA GLUCOSA

OBJETIVOS Al finalizar esta práctica, el alumno sabrá: 1.- Preparar una curva patrón para glucosa. 2.- Determinar la concentración de glucosa de una solución problema, interpolando la curva patrón.

INTRODUCCIÓN Una curva patrón se construye al graficar valores conocidos de concentración de una sustancia de interés contra las unidades obtenidas al aplicar a dicha sustancia un método químico cuantitativo. Por ejemplo, en un medio alcalino la glucosa reduce al cobre cúprico, para formar oxido cuproso insoluble el cual, a su vez, puede reducir al arsenomolibdato formándose un ión colorido. La intensidad del color depende de la cantidad de glucosa presente; la absorbencia de dicha solución puede determinarse colorimétricamente. Al graficar la absorbencia medida versus concentraciones conocidas de glucosa se construye de una curva patrón. Ahora bien, si se tiene una solución problema de glucosa se le puede someter al mismo procedimiento que a las soluciones de concentración conocida. Posteriormente, la absorbencia de la solución problema puede interpolarse en la curva patrón para determinar su concentración. Bases químicas: Al hacer reaccionar glucosa (agente reductor) con hidróxido cúprico en medio alcalino, se forma oxido cuproso (color rojo). El óxido cuproso es insoluble y se precipita, por lo que no puede valorarse colorimétricamente. Cuando se añade a esta solución fosfomolibdato, éste se reduce a un ión de color azul cuya absorbencia puede medirse con un colorímetro. GLUCOSA (agente reductor) + + Reactivo de cobre (Cu ) -

incubación e

Oxido cuproso + Fosfomolibdato

Compuesto coloreado en proporción a la concentración a la concentración (medible colorimetricamente)

agua destilada

compuesto coloreado con volumen adecuado para medición calorimétrica.

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MATERIAL Y REACTIVOS: a). Reactivos: b). Aparatos: 1.- Solución patrón de glucosa (20mg/100 ml) 1.- Espectrofotómetro. 2.- Reactivo de cobre estabilizado en medio 2.- Recipiente con agua a ebullición. alcalino. 3.- Reactivo de fosfomolibdato. 4.- Solución de glucosa de concentración desconocida (problema)

PROCEDIMIENTO 1.- Disponga 6 tubos de ensaye de la manera siguiente: TUBO

1 blanco. Patrón de 0 glucosa (ml) Agua 1.0 destilada (ml) Reactivo de 1.0 cobre (ml) Sol. 0 problema (ml)

2

3

4

5

0.25

0.50

0.75

1.0

6 problema. 0

0.75

0.50

0.25

0

0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

0

0

0

0

1.0

Agitar e incubar durante 20 minutos a ebullición, permita que los tubos se enfríen. Reactivo de 1.0 fosfomolibda to (ml) Agua 9.5 destilada (ml)

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

9.5

9.5

9.5

9.5

9.5

2.- Agite los tubos. Determine la absorbencia a 540 nm. 3.- Dibuje la curva patrón: gráfica de absorbencia vs. concentración de glucosa (microgramos/ ml). RESULTADOS Interpole la absorbencia de la solución problema en la curva patrón, para determinar la concentración de glucosa.

CUESTIONARIO 1.- ¿Que es una curva patrón?. 2.- ¿Que utilidad tiene? 3.- ¿Como se interpola un valor? 4.- ¿Cuál es el efecto de la glucosa sobre el reactivo de cobre?.

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PRACTICA NO.9 SEPARACION DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL

OBJETIVO: Separar una mezcla de compuestos químicamente semejantes para su identificación.

INTRODUCCION: En 1903 el botánico ruso M. T. Sweet elaboró la primera técnica para separar distintos componentes coloreados de un extracto vegetal. A esta técnica se la ha dado el nombre de cromatografía debido a que la separación de las sustancias dan diferentes colores. Existen diferentes tipos de cromatografía. La cromatografía en papel es una forma sencilla que ha llegado a ser un instrumento analítico extraordinariamente valioso para el químico orgánico y para el bioquímico. En esta técnica se emplea papel filtro, una gota de solución que contiene la muestra y que se coloca en cierto punto sobre el papel de donde hay una migración como resultado de flujo por una fase móvil. El movimiento de la fase móvil es causado por fuerzas capilares. La gravedad también contribuye al movimiento. Puede decirse que la cromatografía en papel es un tipo de cromatografía por partición en el que la fase estacionaria es agua absorbida sobre la superficie hidrofílica del papel. Un disolvente orgánico actúa como fase móvil. Por tratamiento apropiado del papel, el agua puede ser sustituida por una fase líquida estacionaria no polar; pueden usarse soluciones acuosas como reveladores. En otra variación, el papel es impregnado con sílice anhidra o una resina de intercambio de iones. La trayectoria de una muestra se puede describir en función de su factor de retardo o relación al frente que se define como: Factor de retardo = Rf =

Distancia del movimiento del soluto

Distancia del movimiento del solvente Para compensar las variables intercontroladas, la distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia estándar en idénticas condiciones. La cromatografía presta valiosa ayuda en el análisis de sustancias complejas como proteínas, tierras raras, etc. MATERIAL Y REACTIVOS:

2 tiras de papel filtro 2 frascos con disolvente y tapa 1 parrilla eléctrica

Muestras de aminoácido: (leucina y ácido aspártico) Solución disolvente (butanol: ácido acético: agua, 4:1:1) Solución reveladora de ninhidrina

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PROCEDIMIENTO: 1.- En un extremo del papel filtro, hacer dos pequeñas marcas con lápiz a un extremo del borde y separarlas entre sí una distancia de un centímetro. 2.- Poner una gota en una de las marcas señaladas del aminoácido No. 1. 3.- Repetir la operación con una gota del aminoácido No. 2.

4.- En otro papel colocar una gota de una mezcla de los aminoácidos. 5.- Introduzca las tiras de papel filtro en un frasco o vaso que contenga la mezcla del solvente (utilice un frasco para cada tira). 6.- Deje avanzar el frente del solvente hasta aproximadamente 1 cm antes de que llegue al borde superior. 7.- Una vez seco el papel, rociar con solución de ninhidrina (revelador específico) para aminoácido. Dejar secar nuevamente. 8.- Calentar las hojas de papel filtro en una parrilla eléctrica (tener cuidado de no quemarlas) hasta la aparición de manchas coloreadas. Ellas representan el sitio donde se encuentran los aminoácidos que reaccionaron con la ninhidrina.

RESULTADOS: 1.- Medir la distancia desde el punto de colocación de la solución de los aminoácidos al centro de las manchas (d). 2.- Medir la distancia del sitio de colocación de los aminoácidos al sitio donde llegó el solvente (D). 3.- Calcular el Rf para cada aminoácido, de acuerdo a la siguiente fórmula: Rf = d/ D 4.- El Rf se calculará para cada uno de los aminoácidos individuales y para la mezcla. 5.- Identificar cada aminoácido. 6.- ¿Cual corrió más y por que?.

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PRACTICA NO.10 DETERMINACION DE PROTEINA POR EL METODO DE BIURET

OBJETIVO: Determinar fotocolorimetricamente la concentración de proteína de una solución problema, usando una curva estándar. FUNDAMENTO:

ESPECTROFOTOMETRÍA DE BIOMOLÉCULAS. t Tomado de: Boyer, R.F.: Modern Experimental Biochemistry, 1s ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA, 1986, pp. 145-157. Algunas de las primeras mediciones experimentales sobre las biomoléculas incluían un estudio de sus interacciones con la luz. Las observaciones iniciales mostraron que cuando la luz incide sobre una solución, ocurren por lo menos dos procesos distintos: la dispersión y la absorción de luz. Ambos fenómenos constituyen ahora la base de algunas técnicas útiles para analizar y caracterizar biomoléculas. En el caso de algunas biomoléculas, el proceso de absorción de luz es seguido por la emisión de luz de una diferente longitud de onda. Este proceso, llamado fluorescencia, depende de la estructura molecular y de factores ambientales y sirve como una valiosa herramienta para la caracterización y el análisis de moléculas y procesos dinámicos biológicamente significativos. Otra técnica que involucra las moléculas y la luz es la polarimetría. En este caso se estudia la interacción de la luz polarizada en un plano con moléculas ópticamente activas. A. Principios básicos de la espectrofotometría de absorción. El espectro electromagnético está formado por un continuo de ondas con propiedades diferentes. Las regiones de importancia primaria en bioquímica incluyen la luz ultravioleta (UV, 180320 nm) y la luz visible (320-800 nm). La luz en estas regiones del espectro tienen la energía suficiente para excitar los electrones de valencia de las moléculas. La longitud de onda de la luz, definida por la ecuación (1) es la distancia entre las crestas de ondas adyacentes. λ = c/v

(1)

λ = longitud de onda c = velocidad de la luz v = frecuencia, número de ondas que pasan por cierto punto por unidad de tiempo. La luz también se comporta como si estuviera formada por partículas energéticas. La cantidad de energía, E, asociada con estas partículas (o fotones), está dada por la ecuación donde

E = hv

(2)

en la que h = constante de Planck Cuando un fotón de cierta energía interacciona con una molécula, puede ocurrir uno de dos procesos. El fotón puede ser desviado (dispersado), o puede transferir su energía a la molécula, produciendo un estado de excitación de la misma.

La dispersión de la luz es la base física de varios métodos experimentales empleados para caracterizar macromoléculas. Antes del desarrollo de la electroforesis, las técnicas de dispersión

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de la luz eran utilizadas para determinar las masas moleculares ("pesos" moleculares) de macromoléculas. Las técnicas de difracción de rayos X, microscopía electrónica, dispersión de luz láser, y dispersión de neutrones dependen en alguna medida del proceso de dispersión de la luz. El otro proceso mencionado líneas arriba, la transferencia de la energía de un fotón a una molécula, es la absorción. Para que un fotón sea absorbido, su energía debe ser igual a la diferencia de energía entre dos niveles energéticos de la molécula. Las moléculas poseen un conjunto de niveles cuantizados de energía. Aunque son posibles varios estados, para los fines presentes consideraremos sólo dos estados electrónicos: un estado basal (B) y el primer estado excitado (S1). Estos dos estados difieren en la distribución de los electrones de valencia. Cuando los electrones son promovidos de un orbital en estado basal B a un orbital de mayor energía (en S1), se dice que ocurre una transición electrónica. La energía asociada con la luz ultravioleta y la luz visible es suficiente para promover a las moléculas de un estado electrónico a otro, esto es, desplazar electrones de un orbital a otro. En cada nivel energético electrónico existe un conjunto de niveles vibracionales. Estos representan cambios en el estiramiento y doblamiento de los enlaces covalentes. Las transiciones entre estos niveles son la base de la espectroscopía infrarroja. La transición electrónica de una molécula de B a S1, tiene una elevada probabilidad de ocurrir si la energía del fotón se corresponde con la energía necesaria para promover un electrón del nivel energético E1 al nivel energético E2: E2 - E1 = hc/ λ

(3)

Puede ocurrir una transición desde cualquier nivel vibracional en B a algún otro estado vibracional en S1. Empero, no todas las transiciones tienen la misma probabilidad. La probabilidad de absorción es descrita por la mecánica cuántica. Un espectro UV-visible se obtiene midiendo la luz absorbida por una muestra como función de la longitud de onda. Como las moléculas de la muestra sólo pueden absorber "paquetes" discretos de energía (longitudes de onda específicas) teóricamente el espectro debe estar formado por líneas discretas. Sin embargo, los numerosos niveles vibracionales de cada nivel energético electrónico incrementa el número de transiciones posibles. Esto da como resultado un espectro de picos amplios. Un espectro de absorción puede ayudar en la identificación de una molécula, ya que la longitud de onda de absorción depende de los grupos funcionales o del arreglo de los átomos en la molécula. A lo largo de un espectro de absorción pueden encontrarse picos de absorción máxima o zonas de mínima absorción. Un segundo parámetro evaluado en la espectroscopía de absorción es la eficiencia o grado de absorción a determinadas longitudes de onda. Este parámetro es tradicionalmente llamado coeficiente de extinción. Es definido por la ley de Beer-Lambert: A = EBC

(4)

donde A = absorbencia = - log I/I0 I0 = intensidad de luz que irradia a la muestra I = intensidad de luz transmitida a través de la muestra E = coeficiente de extinción del material absorbente b = recorrido de la luz a través de la muestra (espesor de la celdilla) c = concentración del material absorbente en la muestra Como la absorbencia, A, deriva de un cociente (-log I/I0), no tiene unidades; por lo tanto, las unidades de E dependen de las unidades de b y c. E es más convenientemente utilizado en forma de coeficiente de extinción molar, ε, definido como la absorbencia de una solución 1.0 M de

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la sustancia absorbente pura en una celdilla de 1 cm bajo condiciones específicas de longitud de onda y solvente. B. Instrumentación para medir la absorción de luz UV-visible El espectrofotómetro es utilizado para medir experimentalmente la absorbencia. Este instrumento produce luz de una longitud de onda preseleccionada, la dirige a través de la muestra (usualmente disuelta en un solvente y colocada en una cubeta) y mide la intensidad de la luz transmitida por la muestra. Sus componentes principales son: una fuente de luz, un monocromador (que incluye diversos filtros, rejillas y espejos), una cámara para la muestra, un detector y un registrador. Fuente luminosa. Para mediciones de absorción en la región UV se usa una lámpara de hidrógeno a alta presión o de deuterio. Estas lámparas producen radiación en el rango de 200 a 300 nm. La fuente de luz para la región visible es la lámpara de tungsteno, con un rango de longitudes de onda de 320 a 800 nm. Los instrumentos con ambos tipos de lámpara tienen mayor flexibilidad y pueden ser empleados para estudiar la mayoría de las moléculas biológicamente significativas. Monocromador. Las dos lámparas mencionadas producen emisiones continuas de todas las longitudes de onda dentro de su rango. Por tanto, un espectrofotómetro debe poseer un sistema óptico para seleccionar luz monocromática (luz de una longitud de onda específica). Los instrumentos modernos utilizan un prisma o, más a menudo, rejillas de difracción para producir la longitud de onda deseada. Debe notarse que la luz emitida por el monocromador no es completamente de una sola longitud de onda, sino que es realzada en dicha longitud de onda. Esto es, la mayor parte de la luz es de una sola longitud de onda, pero están presentes longitudes de onda más cortas y más largas. Antes de que la luz monocromática incida sobre la muestra, pasa a través de una serie de hendiduras, lentes, filtros y espejos. Este sistema óptico concentra la luz, aumenta la pureza espectral y la enfoca hacia la muestra. El operador de un espectrofotómetro tiene poco control sobre la manipulación óptica del haz luminoso, excepto en el ajuste de la anchura de la rejilla. La luz que pasa del monocromador a la muestra encuentra una "ventana" o hendidura. En algunos instrumentos ésta está ajustada para que pase un haz de luz de cierta anchura. Los instrumentos más costosos tienen hendiduras variables, lo que permite al operador controlar su anchura. La anchura de la rejilla determina la intensidad de la luz que incide sobre la muestra y su pureza espectral. Al disminuir la anchura de la hendidura, aumenta la pureza espectral de la luz, pero disminuye la cantidad de luz dirigida hacia la muestra. En este caso, el factor limitante es la eficiencia o sensibilidad del detector. Establecer la anchura apropiada de la hendidura requiere un equilibrio entre la pureza espectral y la sensibilidad del detector. Cámara de la muestra. La luz monocromática procesada es entonces dirigida hacia una cámara de muestra, que puede acomodar una amplia variedad de porta muestras. La mayoría de las mediciones UV-visible se hacen en soluciones de las moléculas de interés. La muestra es colocada en un tubo o cubeta de vidrio, cuarzo, u otro material transparente. Las cubetas de vidrio son las menos costosas, pero, como absorben luz UV, pueden ser usadas sólo a longitudes de onda superiores a 320 nm. El cuarzo o sílice fundido debe ser empleado en el rango UV (200-320 nm). La calidad y condiciones de las cubetas son factores críticos en la espectrofotometría. Las cubetas de alta calidad son muy costosas y deben ser objeto de un mantenimiento cuidadoso.

Los espectrofotómetros más baratos son instrumentos de "un solo haz" que permiten la inserción de una sola cubeta a la vez en el porta cubetas. Este es el caso del Coleman Modelo 6/35, del Bausch & Lomb Modelo 20 o del Seqoia-Turner Modelo 340. Los instrumentos más sofisticados son de "doble haz" y aceptan dos cubetas a la vez: una que contiene la muestra disuelta en el solvente y otra que contiene solvente puro.

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Con frecuencia los espectrofotómetros son usados para monitorear velocidades de reacciones químicas. Cuando se efectúan estas mediciones la cubeta que contiene la muestra debe tener una temperatura constante. Muchas cámaras de muestra permiten la circulación de un líquido cuya temperatura es constante, alrededor del porta cubetas. Detector. La intensidad de la luz que pasa a través de la muestra en estudio depende de la cantidad de luz que es absorbida por la misma. La intensidad es medida por un detector fotosensible, generalmente un tubo foto multiplicador (TFM). El TFM detecta una pequeña cantidad de energía luminosa, la amplifica mediante una cascada de electrones acelerados por dínodos, y la convierte en una señal eléctrica que puede ser transferida al registrador. Registrador. Los instrumentos menos costosos dan una lectura directa de absorbencia y/o transmitencia en forma análoga o digital. Estos instrumentos son apropiados para mediciones a una sola longitud de onda; sin embargo, si se desea un "barrido" de absorbencia vs. longitud de onda, entonces debe utilizarse un registrador. Algunos espectrofotómetros están equipados con un registrador de pluma. El rango de absorbencia de la mayoría de los registradores es de 0 a 1, pero los instrumentos más costosos pueden ser utilizados a niveles superiores de absorbencia (1-2) o niveles inferiores, de mayor sensibilidad (0-0.1, 0-0.01, etc.). C. Aplicaciones de la espectrofotometría de absorción Ahora que estamos familiarizados con la teoría y la instrumentación de las espectrofotometría de absorción, podremos comprender más fácilmente el funcionamiento y las aplicaciones típicas de un espectrofotómetro. Como virtualmente todas las mediciones UV-visible se hacen en muestras disueltas (en solventes adecuados), sólo se mencionarán estas aplicaciones. Aunque pueden hacerse muchos tipos diferentes de operaciones con un espectrofotómetro, todas las aplicaciones caen en una de dos categorías: a) medición de la absorbencia a una longitud de onda fija; y, b) medición de la absorbencia en función de la longitud de onda. Para las mediciones de absorbencia a una longitud de onda fija con un instrumento de "un haz", se coloca una cubeta que contiene el solvente puro y se ajusta la absorbencia a "cero". Una cubeta que contenga solvente más muestra se coloca entonces en la cámara, y su absorbencia es leída directamente del registrador. El ajuste a cero con el solvente puro ("blanco") permite obtener la lectura directa de la absorbencia de la muestra. Un espectro de absorción de un compuesto puede obtenerse "barriendo" un rango de longitudes de onda y graficando la absorbencia obtenida a cada longitud de onda. La mayoría de los espectrofotómetros de "doble haz" recorren automáticamente el rango deseado de longitudes de onda y registran la absorbencia como función de la longitud de onda. Si el solvente es colocado en la cámara de referencia y el solvente más la muestra en la posición de la muestra, el aparato restará automáticamente a absorbencia del solvente de la absorbencia total (solvente más muestra) a cada longitud de onda; de aquí que la gráfica del registrador sea realmente un "espectro diferencial" (absorbencia de la muestra más solvente menos absorbencia del solvente). Ambos tipos de mediciones (longitud de onda fija y espectro de absorción) son comunes en la bioquímica, y deberíamos ser capaces de interpretar los resultados de ambas.

Medición de la concentración de una solución. De acuerdo con la ley de Beer y Lambert, la absorbencia de un material en solución depende directamente de la concentración de dicha sustancia. Comúnmente se usan dos métodos para medir la concentración. Si se conoce el coeficiente de extinción de la especie absorbente, entonces la concentración puede calcularse tras la medición experimental de la absorbencia de la solución. Sin embargo, esta aplicación tiene limitaciones. La mayoría de los espectrofotómetros son útiles para medir absorbencias con un valor máximo de 1, aunque los aparatos más sofisticados pueden medir absorbencias tan altas como 2. Asimismo, algunas substancias no obedecen la ley de Beer y Lambert; esto es, la absorbencia no aumenta de manera lineal con la concentración. Esto puede ocurrir con substancias que se asocian o disocian en solución. La linearidad es fácilmente verificada preparando una serie de

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concentraciones de la especie absorbente y midiendo la absorbencia correspondiente a cada concentración. Si la ley de Beer-Lambert es válida, la gráfica de absorbencia vs. concentración debe ser lineal. Si no se conoce el coeficiente de extinción de una sustancia, su concentración en solución puede ser determinada si se conoce la absorbencia de una solución patrón (estándar) del compuesto. Alternativamente, la concentración de un especie en solución puede ser determinada preparando una curva estándar (patrón) de absorbencia vs. concentración. Identificación de biomoléculas desconocidas. El espectro UV-visible de una biomolécula revela mucho acerca de su estructura molecular. Por lo tanto, una de las primeras mediciones experimentales sobre una biomolécula desconocida debe ser el análisis espectral. Las moléculas naturales a menudo contienen grupos cromóforos que tienen espectros característicos. El procedimiento para obtener un espectro de absorción UV-visible comienza con la preparación de una solución de la especie en estudio. Una solución estándar debe prepararse en un solvente adecuado. Se transfiere una alícuota de la solución a una cubeta, la cual es colocada en la posición de la muestra en la cámara del espectrofotómetro. Otra cubeta con el solvente puro es colocado en el porta cubetas de referencia. El espectro es recorrido en el intervalo deseado de longitudes de onda y se calcula el coeficiente de extinción para cada longitud de onda en la que la absorbencia es máxima.

Cuando un compuesto que contiene dos o más grupos carbamilo, unidos directamente o separados por un solo átomo de C o N, es colocado en una solución alcalina con sales de cobre, se forma un complejo de color violeta. Esta reacción constituye la base de un método cuantitativo de determinación de proteína. esta determinación debe hacerse en ausencia del ión NH4, el cual produce un color que causa interferencia. REACTIVOS: 1.- Solución patrón de proteína (8 mg de albúmina /ml). 2.- Reactivo de Biuret. 3.- Solución problema. APARATOS: 1.- Espectrofotómetro Baush & Lomb (Spectronic 20). 2.- Baño María.

METODO: 1.- Llene 6 tubos de ensayo de la manera siguiente: TUBO Sol. problema (ml) Patrón de proteínas (ml) NaCl 0.9 % (ml) Reactivo de Biuret (ml)

1 blanco. 0

2

3

4

5

0

0

0

0

6 problema. 1.0

0

0.25

0.50

0.75

1.0

0

3.0

2.75

2.50

2.25

2.0

2.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

38

2.- Caliente los tubos en el baño (50 ºC) durante 10 minutos. 3.- Enfríe los tubos en agua corriente. 4.- Determine en el espectrofotómetro la absorbancia a 540 nm; ajuste a cero con el “blanco” (tubo # 1). 5.- Dibuje la curva patrón (absorbencia vs. concentración de proteína). 6.- Determine la concentración de proteína (mg/ml) de la solución problema interpolando la curva patrón.

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PRACTICA NO. 11 EXAMEN QUIMICO DE ORINA

OBJETIVOS 1. El alumno comprenderá la importancia de la valoración del examen químico de orina. 2. El alumno será capaz de entender los fundamentos de las diferentes pruebas con química seca para el examen químico de orina. FUNDAMENTO El riñón y su producto de eliminación, la orina, constituyen el principal sistema en la homeostacia del organismo humano. El riñón filtra, retiene o excreta diversos productos presentes en la sangre de acuerdo a la necesidad de conservarlos o eliminarlos. Cada producto presente en la orina tiene un mecanismo individual de eliminación o de retención; su identificación y cuantificación en la orina nos permite realizar evaluaciones, constituyéndose el examen general de orina como un examen de rutina en la practica diaria, ya que la presencia o el aumento de estos compuestos ayudan a él diagnóstico o a seguir la evolución o evalución de diversos padecimientos. Son numerosos los compuestos que podemos identificar y cuantificar en la orina. El examen general de orina es dividido en un examen químico y otro microscópico de sedimento. Actualmente el EGO es realizado mediante química seca utilizando una tirilla que contiene una serie de parámetros, que son interpretados mediante una carta de colores y concentraciones o bien es evaluada en un urinómetro o reflectometro.

MATERIAL 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Reflectómetro. Escala de colores y concentraciones. Recipiente para colecta de orina. Tubos para análisis de orina. Tiras reactivas para orina. Gradilla. Papel sanitario. Guantes.

MUESTRA Muestras de orina adecuadamente colectadas.

METODOLOGÍA Ajustarse a la metodología del fabricante. Fabricante: Modelo del reflectómetro: Carta de colores y concentraciones.

40

RESULTADOS. Identificación de las muestras:

Muestra 1

Muestra 2

Valor de Densidad: Valor de pH: Valor de Leucocitos: Valor de Nitritos: Valor de Proteína: Valor de Glucosa: Valor de Cetonas: Valor de Urobilonógeno: Valor de Bilirrubina: Valor de Sangre: Valor de Hemoglobina:

Valores normales: Densidad: 1.010 – 1.020 Leucocitos, nitritos, proteína, cetonas, bilirrubinas y sangre: Negativo. pH: 5 – 6.5 Glucosa y urobilinógeno: Negativo

CUESTIONARIO. 1. ¿Cómo influye en el pH, el hecho de que las muestras de orina sean procesadas mucho tiempo después (aprox. 4 horas) en el resultado? 2. ¿Por qué razón la tira reactiva debe de ser leída en un tiempo especifico? 3. ¿Cuál es el fundamento de la prueba para la determinación de Cetonas, Bilirrubina y Urobilinógeno?

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PRACTICA No. 12 DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA EN LIQUIDOS BIOLOGICOS

OBJETIVO Determinar cuantitativamente la actividad de amilasa en líquidos biológicos mediante el método amiloclástico iodométrico. INTRODUCCION La amilasa producida en el páncreas exócrino y en las glándulas salivales, escinde los enlaces alfa 1-4 glucosídicos de los polisacaridos (almidón y glucógeno). Se encuentra elevada en el suero de pacientes con pancreatitis aguda, alcanzando los valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes. También se ve aumentada en este caso la excreción urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de que la actividad sérica ha alcanzado los niveles normales. También es posible encontrar valores aumentados en cualquier caso de “abdomen agudo” o intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.

FUNDAMENTO El sustrato, almidón tamponado, se incuba con la muestra, produciéndose la hidrólisis enzimática. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color respecto de un sustrato color (sin muestra) es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en Unidades Amilolíticas (Smith & Roe)/ 100 ml (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarogénicas (Somogyl)/100 ml.

MATERIALES Y REACTIVOS Baño de agua agua Tubos de ensayo Micropipetas Espectrofotómetro Pipetas serológicas

Suero sanguíneo u orina Solución de almidón 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer fosfatos 0.1 M en NaCl 0.15 M Reactivo de Yodo (0.01 eq/l de yodo en ácido clorhídrico 0.02 M)

PROCEDIMIENTO 1. Marcar un tubo de ensaye como control (c) y otro como desconocido (d). 2. Agregar 1 ml de sustrato a cada tubo. o 3. Dejar 5 min en baño de agua a 37 C 4. Agregar 0.02 ml de la muestra al tubo marcado como desconocido o 5. Incubar a 37 C por 7 minutos y medio 6. Agregar 1 ml del reactivo de yodo a cada uno de los tubos 7. Mezclar y agregar 8 ml de agua destilada a ambos tubos 8. Mezclar por inmersión y leer la absorbancia en el espectrofotometro a 640 nm ajustando a cero con agua destilada. Nota: El color de la reacción es estable durante 1 hr. o Si la temperatura ambiente es superior a 25 C, la lectura deberá efectuarse dentro de los 20 min

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CALCULO DE LOS RESULTADOS

Amilasa (UA/dl)= (c - d)/c x 1000

Unidades: Una unidas Amilolítica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 min, en las condiciones de la reacción. En esta técnica se incuban 0.02 ml de muestra con 0.5 mg de almidón contenidos en 1 ml de sustrato durante 7 min y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con 10.000 mg de almidón durante 30 min. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra sería de 1000 UA/ dl. Para las unidades de actividad amilásica, la fracción de almidón digerido se multiplica por 1000.

VALORES DE REFERENCIA

Condición clínica Normal Pancreatitis aguda Pancreatitis crónica Parotiditis Parotiditis c/complicación pancreática Procesos abdominales agudos (sin pancreatitis)

Suero (UA/dl) <120 300 a 12.000 hasta 200 200 a 350

Orina (UA/hora) <260 Más de 900 Más de 300 350 a 750

más de 350

más de 750

normal

normal

CUESTIONARIO 1.- Explique la importancia bioquímica de la cuantificación de la actividad enzimática 2.- Que factores afectan el comportamiento enzimático 3.- Mencione tres enzimas de importancia clínica

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PRACTICA NO. 13

ANÁLISIS DE LÍPIDOS OBJETIVO: Realizar pruebas generales para identificar algunas propiedades de un lípido.

INTRODUCCIÓN. Los lípidos son moléculas orgánicas que se caracterizan generalmente por ser insolubles en agua y muy solubles en solventes orgánicos. Esta propiedad física refleja la naturaleza hidrofóbica de su estructura hidrocarbonada. En esta práctica se van a realizar una serie de pruebas cualitativas para poner de manifiesto algunas propiedades de los lípidos como son: solubilidad, detección de peróxidos y saponificación.

MATERIALES Y REACTIVOS. 7 Tubos de ensayo 2 Pipetas de 1 ml. 4 Pipetas de 2 ml. Baño María. Soporte completo Gradilla

Aceite vegetal. Agua. Etanol. Eter etílico. Tetracloruro de carbono Mezcla de Acido acético y Cloroformo. KI al 5 %. NaOH 2 N o al 10 %.

PROCEDIMIENTO. A) PRUEBA DE SOLUBILIDAD. 1. Enumerar cuatro tubos de ensaye y prepararlos de la siguiente forma: TUBO Aceite Vegetal. Agua Etanol Tetracloruro de carbono. Eter etílico.

1 1 ml. 2 ml.

2 1 ml.

3 1 ml.

4 1 ml.

2 ml. 2 ml. 2 ml.

2.- Observar el grado de solubilidad y anotar los resultados.

B) DETECCIÓN DE PERÓXIDOS. 1.- Colocar en un tubo de ensayo 1 ml. de aceite vegetal y 2 ml. de mezcla de ac. Acético l cloroformo. 2.- Agitar fuerte y agregar 2 gotas de KI, agitar nuevamente. 3.- Esperar 10 minutos y observar cambios.

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C) SAPONIFICACIÓN. 1.- Colocar 2 ml. de aceite vegetal en un tubo. 2.- Agregar 1 ml. de NaOH. 3.- Agitar para formar una emulsión. 4.- Calentar en Baño María durante 5 minutos. 5.- Dejar reposar el tubo y observar cambios. CUESTIONARIO. 1.- Da una definición de lípidos. 2.- Explica con reacciones químicas en que consiste la saponificación.

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