I SKRINING FITOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

SKRINING FITOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK METANOL DAUN SIRIH LENGKUNG ( Piper aduncum L.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi Oleh: Clementia Nova NIM : 128114048

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

i


ii


iii


PERSEMBAHAN

Dear God, Thank you for creating such a magical piece Known as a “smile”. It’s indescribable, the feeling when someone smiles at you sincerely, and their eyes sparkle as they do so. No matter how close, no matter how much of a stranger, a sincere smile just melts the heart. Dear God, Thank you for creating another magical piece known as a “cry”. The feeling of seeing someone cry warms my heart, because it simply shows how fragile and connected we all are. And, the feeling when it my selfcry, it brings relief and appreciation to life.

Dear God,

I enjoy talking to You

-Dian Rikasari-

Karya ini saya persembahkan: Untuk Tuhan Yesus Kristus, karena penyertaannya sepanjang hidupku Untuk Orang Tua yang selaluaku hormati dan cintai Untuk Keluarga Bituk yang selalu melengkapi hidupku Untuk KeluargaTiyap yang selalu mendoakan setiap langkahku Untuk Sahabat yang selalu memberi dukungan dan menyemangatiku Dan yang terakhir untuk orang-orang yang membantuku dalam mengerjakan skripsi ini.

iv


v


vi


PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan yang Maha Esa atas berkat, kasih dan kesempatan-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul “SKRINING FITOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK METANOL DAUN SIRIH LENGKUNG ( Piper aduncum L.)”. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Farmasi (S. Farm) program studi fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Dalam proses pengerjaan skripsi ini, penulis mendapat bimbingan, dukungan, kritik, dan saran dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih sedalam-dalamnya kepada: 1. Terima kasih kepada Tuhan Yesus yang sudah memberikan penulis kesehatan, inspirasi dalam menulis, menjaga dan melindungi penulis serta mendampingi penulis dalam keadaan apapun. 2. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogayakarta. 3. Dr. Yustina Sri Hartini M.Si., Aptselaku Dosen pembimbing yang telah memberi bimbingan, dukungan, saran, dan meluangkan waktu untuk berdiskusi bersama Penulis dalam proses pembuatan skripsi ini. 4. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan masukan, kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini. 5. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan masukan, kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini. 6. Agustina Setyawati, M.Si., Apt selaku Kepala Penanggung Jawab Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin penggunaan laboratorium kepada penulis. 7. Segenap laboran dan karyawan Fakultas Farmasi Sanata Dharma, KhususnyaPak Wagiran, Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Sigit, Mas Agung, dan Pak Ketul atas bantuan dan kerjasamanya selama ini. 8. Rekan-rekan penelitian tim Piper, Maria Indah Rosari, Agata Herny, Violeta Jesmile, dan Dewi Kamara terima atas bantuan, kerjasama,

vii


viii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL....................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING...........................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI…..................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN..................................................................

iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ………………. v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................

vi

PRAKATA …………………………………............................................

viii

DAFTAR ISI................................................................................................. ix DAFTAR TABEL......................................................................................... X DAFTAR GAMBAR....................................................................................

xi

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xii INTISARI.....................................................................................................

xiv

ABSTRACT..................................................................................................

xv

PENDAHULUAN…....................................................................................

1

METODE PENELITIAN.............................................................................. 3 HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................... 7 KESIMPULAN DAN SARAN………......................................................... 15 DAFTAR PUSTAKA…...............................................................................

16

LAMPIRAN…………………...................................................................... 21

ix


DAFTAR TABEL Tabel I.

Hasil skrining fitokimia ekstrak metanol daun sirih lengkung…………………………………………………

Tabel II.

Hasil penetapan kandungan fenolik total ekstrak metanol daun sirih lengkung……………………………………..

Tabel III.

11

Perhitungan persen inhibisi berdasarkan absorbansi hari ke-6……………………………………………………..

Tabel IV.

7

13

Aktivitas antikosidan sampel dengan metode thibarbituric acidm (TBA)………………………………

x

14


DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Reaksi Uji Mayer…………………………………………..

8

Gambar 2.

Reaksi antara Tanin dan FeCl3……………………………..

8

Gambar 3.

Reaksi Hidrolisis Saponin dengan air……………………...

9

Gambar 4.

Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol…..… 11

Gambar 5.

Grafik rata-rata absorbansi control negatif, positif, dan sampel……………………………………………………… 12

xi


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1.

Surat determinasi……………………….………………... 21

Lampiran 2.

Gambar daun sirih lengkung……………………………..

22

Lampiran 3.

Hasil skrining Fitokimia daun sirih lengkung..………......

22

Lampiran 4.

Gambar hasil skrining fitokimia daun sirih lengkung....…

23

Lampiran 5.

Penetapan kadar air serbuk daun sirih lengkung….……...

25

Lampiran 6.

Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteu………………………….

26

Lampiran 7.

Perhitungan rendemen ekstrak…………………………...

26

Lampiran 8.

Data penimbangan untuk penetapan kandungan ekstrak metanol………………………………………………….

Lampiran 9.

Data perhitungan konsentrasi asam galat dan ekstrak metanol untuk penetapan kandungan fenolik…………

Lampiran 10.

28

Optimasi Panjang Gelombang Maksimal untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total…………………….

Lampiran 12.

27

Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan fenolik total…………………………………..

Lampiran 11.

27

30

Hasil Pengukuran Kurva Baku untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total………………………………... 31

Lampiran 13.

Perhitungan Kandungan Fenolik Total Ekstrak Metanol...

Lampiran 14.

Data Penimbangan Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC…………………………………………

Lampiran 15.

Hasil optimasi operating time Uji Aktivitas Antioksidan

xii

31

32


FTC………………………………………………………. 32 Lampiran 16.

Hasil optimasi operating time Uji Aktivitas Antioksidan Metode FTC…………………………………………….

Lampiran 17.

Hasil optimasi panjang gelombang uji aktivitas antioksidan metode FTC……………………………….

Lampiran 18.

33

33

Data penimbangan uji aktivitas antioksidan metode FTC – TBA…………………………………………………….

34

Lampiran 19.

Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan metode FTC...

34

Lampiran 20.

Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA……………………………………………...

36

Lampiran 21.

Data PSPP FTC…………………………………………..

38

Lampiran 22.

Data PSPP TBA………………………………………….

39

xiii


INTISARI Munculnya berbagai penyakit degeneratif akibat peroksidasi lipid dapat dicegah dengan antioksidan. Tumbuhan dapat dimanfaatkan sebagai salah satu sumber antioksidan alami karena kandungan senyawa metabolit sekundernya, salah satunya adalah sirih lengkung.Sirih lengkung (Piper aduncum L.) termasuk dalam famili Piperaceae yang diketahui memiliki potensi besar sebagai antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dan aktivitas antioksidan ekstrak metanol khususnya senyawa fenolik yang terdapat pada daun sirih lengkung.Senyawa fenolik sebagai antioksidan alami mampu mengurangi laju reaksi peroksidasi lipid.Skrining fitokimia dilakukan dengan uji tabung dan kandungan fenolik total diuji dengan menggunakan metode Folin-Ciocalteau didasarkan pada reduksi asam fosfotungstat dalam larutan alkali menjadi fosfotungstat biru. Aktivitas antioksidan diuji menggunakan metode FTC (ferric thiocyanate), dimana metode FTC mengukur jumlah hasil peroksida pada tahap awal dari oksidasi lemak dengan ferrous chloride dan hasilnya akan dikonfirmasi dengan metode TBA (thiobarbituric acid). Hasil penelitian menunjukkan bahwa daun sirih lengkung mengandung senyawa golongan alkaloid, flavonoid, saponin, polifenol, tanin steroid dan terpenoid. Kadar fenolik total ektrak metanol daun sirih lengkung sebesar 150,167± 58,323 mg ekivalen asam galat (GAE) per gram ektrak metanol daun sirih lengkung. Aktivitas antioksidan ekstrak metanol daun sirih lengkung yang diukur dengan metode FTC dan TBA berturut – turut menunjukkan persen inhibisi peroksidasi lipid sebesar 6,794 ± 2,211 % dan 91,908 ± 3,721%. Kata kunci : Piper aduncum L., skrining fitokimia, fenolik total, antioksidan, Folin-Ciocalteau,Ferric Thiocyanate (FTC), Thiobarbituric Acid (TBA).

xiv


ABSTRACT The emergence of various degenerative diseases was a result of lipid peroxidation which could be prevented with antioxidants. Plants can be used as a source of natural antioxidants for the content of secondary metabolites, one of which is the spiked pepper leaves. Spiked pepper leave (Piper aduncum L.) was categorized as Piperaceae family which were known having major potential as an antioxidant. This study aimed to determine the chemical content and antioxidant activity of methanol extract especially phenolic compounds contained in spiked pepper leaves. Phenolic compounds as natural antioxidants could reduce the rate of lipid peroxidation reaction.Phytochemical screening is done with test tubes and total phenolic content was tested using a method based on the Folin-Ciocalteau fosfotungstat acid reduction in alkaline solution becomes blue fosfotungstat.The antioxidant activity was tested using the method of FTC (ferric thiocyanate), the results would be confirmed by the method of TBA (thiobarbituric acid). The results showed that spiked pepper leave compounds containing alkaloids, flavonoids, saponins, polyphenols, tannins steroids and terpenoids. Total phenolic content of methanol extract of betel leaf arch of 150,167 ± 58,323 mg gallic acid equivalents per g of the methanol extract. The antioxidant activity andmethanol extract of betel leaf arch as measured by the FTC and TBA methods respectively showed the percent inhibition of lipid peroxidation were 6,794 ± 2,211% and 91,908 ± 3,721% Keywords: Piper aduncum L. , screening phytochemicals, antioxidants, FolinCiocalteu, FTC-TBA

xv


PENDAHULUAN Radikal bebas merupakan suatu senyawa molekul yang memiliki elektron yang tidak berpasangan, tidak stabil dan cepat bereaksi dengan senyawa lain (seperti DNA, asam lemak tak jenuh) sehingga membentuk lebih banyak radikal bebas secara berantai. Molekul target yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh (PUFA – Poly Unsaturated Fatty Acids). Jaringan lipid yang dirusak oleh senyawa radikal bebas akan membentuk peroksida yang memicu munculnya berbagai penyakit degeneratif (Lamid, A., 1995; Winarsi, 2007; Parida dan Dhal, 2011). Senyawa yang mampu mengurangi peroksida lemak adalah antioksida, karena memiliki peran sebagai pemberi elektron atau reduktan, dimana senyawa ini akan memberikan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas sehingga akan membentuk molekul normal kembali dan menghentikan berbagai kerusakan yang ditimbulkan (Sasikumar, et al., 2009; Thitilertdecha et al., 2010). Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat melindungi kerusakan sel karena mampu menetralkan radikal bebas dengan mekanisme mendonorkan atom hydrogen ke atom yang tidak memiliki pasangan elektron (Muhtadi,2014). Dalam konsentrasi rendah, antioksidan secara signifikan mampu menghambat reaksi oksidasi (Cadenas dan Packer, 2002).Namun, antioksidan alami lebih banyak diminati dibandingkan antioksidan sintetik, karena antioksidan sintetik seperti butylated hydroxytoluene (BHT) diketahui dapat meningkatkan terjadinya efek karsinogenik (Umemura et al., 2001). Tanaman herbal merupakan merupakan salah satu sumber antioksidan alami dan memiliki peran penting dalam pencegahan penyakit kanker dan penuaan dini. Salah satu senyawa metabolit sekunder dalam tanaman yang diketahui berfungsi sebagai antioksidan adalah senyawa fenol. Hal ini karena kemampuannya meniadakan radikal – radikal bebas dan radikal peroksida sehingga efektif dalam menghambat oksidasi lipida (Kinsella et al, 1993). Senyawa fenolik mampu bertindak sebagai antioksidan dengan memutuskan ikatan rantai radikal bebas secara langsung dan menangkap berbagai spesies

1


reaktif seperti radikal superoksida, hidroksil dan peroksil serta asam hipoklorit (Nurmi, A., 2008). Salah satu famili tanaman yang telah diketahui menunjukkan potensi besar sebagai antioksidan adalah Piperaceae (Dodson, et al. dalam Nahak dan Sahu, 2011). Piper aduncum L. atau sirih lengkung merupakan salah satu tanaman dalam famili piperaceae. Menurut Parmar et al., (1997) kandungan metabolit sekunder yang terdapat dalam Piperaceae adalah fenolik, flavonoid, alkaloid dan terpenoid. Namun, sejauh penelitian peneliti terhadap senyawa aktif pada sirih lengkung belum diketahui. Oleh karena itu pada penelitian ini, peneliti melakukan skrining fitokimia dengan metode uji tabung. Hasil penelitian yang dilakukan Yerwanto Ilang,dkk (2014) menunjukan bahwa ekstrak etanol ranting sirih lengkung memiliki aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50 sebesar 59,838 µg/mg. Dalam penelitian ini metode yang digunakan adalah metode FolinCiocalteu (FC) dan untuk uji aktivitas antioksidan adalah metode Ferric Thiocyanate (FTC) – Thiobarbituric Acid (TBA). Prinsip dari metode FolinCiocalteaun adalah terbentuknya senyawa kompleks berwarna biru yang dapat diukur pada panjang gelombang 765 nm. Metode FTC digunakan untuk mengukur jumlah peroksida awal dari peroksida lemak sedangkan metode TBA untuk mengukur radikal bebas yang dihasilkan setelah peroksida lemak yang dimana peroksida lemak merupakan akumulasi produk pada jaringan tubuh manusia sebagai penyebab utama dari disfungsi seluler pada tubuh (Aqil, Ahmad and Mehmood, 2006). Dalam penelitian ini peneliti menggunakan pelarut metanol karena, etanol merupakan pelarut yang dapat melarutkan beberapa kandungan metabolit sekunder seperti alkaloid, terpenoid, tanin, flavonoid dan polifenol. Selain itu metanol dapat menghambat reaksi oksidasi polifenol yang menyebabkan oksidasi fenolat dan kemudahannya saat penguapan di evaporator (Tiwari et al., 2011). Sehingga, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kandungan senyawa kimia dan aktivitas antioksidan yang terdapat di dalam ekstrak daun sirih lengkung.

2


METODE PENELITIAN BAHAN

Bahan yang digunakan meliputi daun sirih lengkung segar (dari kebun obat “Merapi Farma”) yang dideterminasi di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Bawah Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, akuades, metanol p.a (Merck), etil-asetat p.a (Merck), asam galat p.a (Sigma), natrium karbonat 1 M teknis, etanol (Merck), asam linoleat (Sigma), buffer fosfat 0.02 M (pH 7.0), etanol p.a 99,6 %, etanol 75%, asam linoleat 2,5%, ammonium thiocyanate 30% (Merck), ferrous chloride 0.02 M p.a dalam HCl teknis (Merck), asam tiobarbiturat (Merck), reagen Folin Ciocalteau (Merck), BHT ( butylated hydroxyl toluene) p.a (Sigma), asam trikloroasetat (Merck). ALAT

Peralatan yang digunakan: neraca analitik ( Scalec SBC 22, BP 160P), spektrofotometer UV-Vis (Prekin Elmer Lamda 20), Oven, alat penyerbuk, alat pengayak, centrifuge, Vaccum Rotary Evaporator (Janke & Kunkel), timbangan elektrik BP 160 readability 0.10 mg, waterbath (labo-tech, Heraeus), micropipet 200-1000 μL ; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), orbital shaker, corong Buchner, pompa vakum, vortex (Janke & Kunkel), dan alat-alat gelas (Pyrex-Germany dan Iwaki).

CARA KERJA A. Pembuatan Simplisia Daun Sirih Lengkung Daun sirih lengkung segar yang diperoleh dari kebun obat“MERAPI FARMA” daerah kaliurang KM 21,5. Determinasi daun sirih lengkung dilakukan di Laboratorium Biologi UGM. Daun sirih lengkung dicuci dengan air bersih yang mengalir sambil dibersihkan dari kotoran yang melekat dan kemudian ditiriskan. Pencucian daun dilakukan sebanyak tiga kali, agar daun bersih dari pengotor. Setelah itu daun di letakkan diatas kertas puti dan diangin- anginkan, kemudian dirajang menggunakan pisau berbahan “stainless steel” dengan lebar irisan kurang lebih 1 cm. Kemudian, dikeringkan menggunakan oven pada suhu 600C. Daun yang telah kering selanjutnya

3


disortasi kering, dengan cara dipisahkan kembali dari pengotor yang ikut serta dalam proses pengeringan. Daun yang sudah kering ditunjukan dengan mudahnya daun hancur saat diremas. Daun kemudian diserbuk dan di ayak dengan ayakan dengan no merh 50, kemudian dilakukan uji kadar air dan perhitungan rendemen ekstrak.

B. Skrining Fitokimia a. Uji alkaloid. Ekstrak sebanyak 10 mg ditambahkan 5 mL amonia 25%, lalu ditambahkan 20 mL kloroform. Campuran disaring sehingga diperoleh lapisan air dan lapisan pelarut organik. Lapisan air ditambahkan 2 tetes pereaksi dargendorff atau pereaksi mayer. Jika terbentuk warna orange dengan pereaksi dargendorff atau terbentuk endapan putih dengan penambahan pereaksi Mayer berarti ekstrak mengandung alkaloid (Farnsworth, 1966). b. Uji flavonoid Sejumlah sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37 % dan etanol 95 % dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol (Harborne ,1987). c. Uji Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil akan terus terlihat selama 5 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin (Harborne, 1987). d. Uji polifenol Sejumlah sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70 %. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru (Harborne, 1987).

4


e. Uji tanin Dua gram serbuk simplisia dilarutkan dengan air lalu direaksikan dengan larutan besi (III) klorida 10%, jika terjadi warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin (Harborne, 1987). f. Triterpenoid dan steroid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering lalu ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau (Harborne, 1987).

C. Pembuatan Ekstrak Daun Sirih Lengkung Serbuk simplisia sebanyak 10 gram serbuk diektraksi maserasi menggunakan 100 mL metanol teknis selama 2x24 jam dengan menggunakan orbital shaker. Setelah 2x24 jam dimaserasi, filtrat disaring menggunakan corong Buchner dan ampasnya dimaserasi dengan metanol teknis selama 24 jam kemudian disaring. Proses remaserasi dihentikan bila diperoleh filtrate yang bening, yang berarti sebagian besar senyawa yang larut dalam metanol telah terekstrak. Pelarut pada filtrat dihilangkan dengan cara diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 60oC dan dipekatkan dengan menggunakan waterbath (T= 60o C), untuk diperoleh ekstrak kental kemudian dihitung rendemennya. D. Analisis Kadar Senyawa Fenolik Total Penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin Ciocalteu menurut Rami et all. (2013) yaitu larutan ekstrak metanol diambil 0.5 mL dari konsentrasi 200 μg/mL dan ditambahkan 2 mL reagen Folin Ciocalteu, didiamkan selama 5 menit dalam suhu ruang. Selanjutnya ditambahkan 4 mL Na2CO3 (Natrium Karbonat) 1 M dan inkubasi 30 menit. Absorbansi diukur pada

= 735 nm dengan spektrofotometer. Hasil dinyatakan dalam mg

ekivalen asam galat per gram ekstrak ± SD. Standar kurva yang digunakan adalah asam galat dengan konsentrasi 40, 50, 60, 70, 80 μg/mL. Rumus perhitungan :

T = C.V/M

5


Keterangan T = kandungan fenolik total (mg/g); C= konsentrasi hasil perhitungan dari absorbansi yang didapat (mg/ml); V= volume senyawa uji (ml); M= massa senyawa uji (mg). E. Analisis Aktivitas Antioksidan Metode FTC-TBA (Ferric Thiocyanate – Thiobarbituric Acid) Metode FTC-TBA mengacu pada Aqil, et al (2006). Ekstrak metanol dan standar BHT sebanyak 4 mg, dilarutkan dalam 4 ml etanol absolut dan ditambahkan 4.1 ml asam linoleat 2.5%, 8.0 ml buffer fosfat 0.05 M (pH 7), dan 3.9 mL akuades. Kemudian diinkubasi dalam oven pada suhu 400C (Larutan A). Kemudian, diambil 0.1 ml larutan ke dalam larutan yang telah berisi 9.7 mL etanol 75% dan 0.1 mL ammonium tiosianat 30% (Larutan B). Selanjutnya, 5 menit setelah penambahan 0.1 mL ferrous choride 0.05 M dalam 3.5% HCl, absorbansi warna merah diukur pada

= 488,5 nm. Pengukuran dilakukan setiap

24 jam sampai 1 hari setelah absorbansi kontrol negatif maksimum. Larutan tanpa sampel sebagai kontrol negatif. Selanjutnya, larutan A sampel pada hari pengukuran terakhir diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 20% dan 2 mL asam 2tiobarbiturat 0.67%. Campuran tersebut dipanaskan dalam waterbath pada suhu 950C selama 10 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Absorbansi supernatant tersebut diukur pada

= 532 nm. Rumus

perhitungan persen inhibisi : %Inhibisi = (A0 – A1/A0)x 100% Keterangan A0 = absorbansi maksimum kontrol negatif; A1 = absorbansi maksimum sampel. Dari nilai rata-rata persen inhibisi ± SD dilakukan uji distribusi menggunakan metode deskriptif.Analisis T-test untuk data terdistribusi normal, atau analisis Kruskall-Wallis untuk data tidak terdistribusi normal, dengan taraf kepercayaan 95%.

6


HASIL DAN PEMBAHASAN Skrining fitokimia merupakan analisis kualitatif terhadap senyawasenyawa metabolit sekunder.Suatu ekstrak dari bahan alam terdiri atas berbagai macam metabolit sekunder yangberperan dalam aktivitas biologinya. Senyawasenyawa tersebut dapat diidentifikasi dengan pereaksi-pereaksi yang mampu memberikan

ciri

khas

dari

setiap

golongan

dari

metabolit

sekunder

(Harborne,1987). Skrining fitokimia pada penelitian ini untuk mengetahui senyawa kimia yang terdapat didalam ekstrak metanol daun sirih lengkung.

Tabel 1.Hasil skrining fitokimia ekstrak metanol daun sirih lengkung Metabolit Sekunder

Hasil

Keterangan

Alkaloid

+

terbentuk endapan putih

Flavonoid

+

terbentuk endapan kuning dibagian tengah tabung

Saponin

+

terbentuk busa setinggi 1-10 cm

Polifenol

+

terbentuk endapan putih pada dasar tabung

Tanin

+

Steroid dan Terpenoid

+

terbentuk warna hitam kehijauan pada tabung uji dibanding kontrol terbentuk warna merah kecoklatan pada lapisan bawah dan warna hijau pekat pada lapisan atas

Dalam skrining fitokimia, prinsip yang digunakan pada uji alkaloid yaitu reaksi pengendapan yang terjadi karena adanya penggantian logam. Atom nitrogen yang memiliki pasangan elektron bebas sehingga dapat digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion logam (McMurry dan Fay, 2004). Hasil positif alkaloid pada uji Mayer ditandai dengan terbentuknya endapan putih. Diperkirakan endapan tersebut adalah kompleks kalium-alkaloid yang diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K+ dari kalium tetraiodomerkurat (II) (pereaksi Mayer) membentuk kompleks kalium alkaloid yang mengendap. Perkiraan yang terjadi ditunjukkan pada Gambar 1.

7


Gambar 1. Reaksi Uji Mayer (McMurry and Fay, 2004)

Flavonoid, fenolik dan tanin merupakan senyawa - senyawa fenol yang memiliki gugus –OH yang terikat pada karbon cincin aromatik. Kemampuan flavonoid sangat potensi untuk antioksidan karena struktur melekul dan posisi dari gugus hidroksilnya (Rajanandh and Kavitha, 2010). Pada ekstrak metanol daunsirih lengkung positif mengandung flavonoid dengan adanya terbentuk endapan warna kuning pada sampel yang direaksikan dengan larutan tembaga asetat. Hal ini dikarenakan flavonoid memiliki cincin benzene yang memiliki gugus hidroksi. Pengujian tanin dilakukan dengan melakukan penambahan FeCl3 yang bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang ada pada tanin. Fungsi FeCl3 adalah menghidrolisis golongan tanin sehingga akan menghasilkan perubahan warna biru kehitaman dan tanin terkondensasi yang menghasilkan warna hijau kehitaman (Sangi dkk., 2008).

Gambar 2. Reaksi antara tanin dan FeCl3 (Sangi dkk., 2008)

8


Pada pengujian saponin, saponin mengandung gugus glikosil yang berperan sebagai gugus polar serta gugus steroid dan triterpenoid yang berfungsi sebagai gugus nonpolar akan bersifat aktif permukaan sehingga saat dikocok dengan air saponin dapat membentuk misel, dimana struktur polar akan menghadap ke luar sedangkan gugus nonpolar akan menghadap ke dalam. Pada kondisi ini akan terbentuk saponin berbentuk seperti busa (Sangi dkk., 2008). Reaksi hidroksil saponin dengan air seperti pada gambar 4.

Gambar 3. Reaksi hidrolisis saponin dengan air (Sangi dkk., 2008)

Identifikasi terpenoid dan steroid pada ekstrak metanol daun sirih lengkung memberikan hasil positif dengan terbentuknya cincin coklat pada pada batas antara kloroform dan H2SO4, selain itu ketika ditambahkan 2 mL asam sulfat terlihat warna hijau menjadi warna hijau pekat. Perubahan warna ini disebabkan adanya oksidasi pada golongan senyawa terpenoid/steroid melalui pembentukan ikatan rangkap terkonjugasi. Prinsip reaksi dalam uji terpenoid adalah kondensasi atau pelepasan H2O dan penggabungan karbokation dan menyebabkan adisi elektrofilik diikuti dengan pelepasan hidrogen. Gugus hidrogen beserta elektronnya

dilepas

sehingga

mengalami

perpanjangan

konjugasi

yang

memperlihatkan adanya cincin coklat (Siadi K., 2012). Senyawa fenolik merupakan penangkal radikal oksigen yang baik dikarenakan potensi reduksi elektron dari radikal fenolik lebih rendah dari pada potensi reduksi electron dari radikal oksigen (Grace,2005; Bors,et al., 1990). Senyawa ini merupakan senyawa yang paling banyak terkandung dalam tumbuhan. Senyawa ini dapat bertindak sebagai antioksidan untuk mencegah penyakit jantung, mengurangi peradangan, menurunkan kejadian kanker dan diabetes, serta 9


mengurangi tingkat mutagenesis pada sel (Khoddami, et al, 2013). Estimasi kandungan fenolik total tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu.Prinsip metode Folin-Ciocalteu didasarkan pada transfer elektron dalam medium alkali dari senyawa fenolik ke dalam kompleks asam fosfomolibdat/fosfotungstat untuk membentuk kompleks biru yang dapat dideteksi secara spektroskopis pada panjang gelombang sekitar 760 nm (Singleton, et al., 1999). Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan membuat kurva baku asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar kurva baku karena asam galat merupakan turunan dari asam hidrobenzoat yang tergolong asam fenol sederhana. Kandungan fenol asam organik ini juga bersifat murni dan stabil (lee, et al., 2003). Pembuatan kurva baku asam galat dilakukan sebanyak tiga replikasi dan untuk menentukan kandungan fenolik total digunakan persamaan dengan nilai r terbaik. Nilai r menunjukkan nilai linearitas yaitu korelasi antara konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linearitas (nilai r = 1 atau mendekati 1) maka korelasi juga semakin baik. Berdasarkan ketiga persamaan regresi yang telah didapat (lampiran 9), persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total adalah persamaan regresi linier replikasi ketiga, yaitu y = 0,00624x + 0,0974 dengan linearitas r = 0,9924. Koofisien korelasi yang baik dilihat dari kesetaraan antara penambahan konsentrasi asam galat dan penambahan absorbansi. Absorbansi sampel yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam persamaan tersebut untuk memperoleh

nilai

kandungan

fenolik

total

sampel.

Hasil

menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sirih lengkung

perhitungan

memiliki nilai

kandungan fenolik total sebesar 184.533 ± 4.244 mg ekivalen asam galat per gram sampel.

10


Table 2.Hasil penetapan kandungan fenolik total ekstrak metanol daun sirih lengkung Kandungan

Rata-rata ±

Fenolik Total

SD

Konsentrasi

Absorbansi

Replikasi 1

200 μg/ml

0.346

185.8

Replikasi 2

200 μg/ml

0.349

188

Replikasi 3

200 μg/ml

0.338

179.8

184.533 ± 4.244

%CV

%

Adapun prinsip dasar kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat dengan menggunakan alkali seperti natrium karbonat, dimana absorbansi yang terbentuk akibat fosfotungstat biru sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang terdapat dalam sampel (Cicco dan Latanzio, 2011 ; Cindric et al., 2011). Reaksi yang terjadi sebagai berikut:

Gambar 4. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol (Sumber: Hardiana et al., 2012)

Pada penetapan kandungan fenolik total ektrak metanol daun sirih lengkung, larutan menunjukan warna biru setelah ditambahkan reagen Folinciocalteu dan larutan Na2CO3. Hal ini menunjukan bahwa terdapat senyawa fenolik yang terkandung didalam ekstrak metanol daun sirih lengkung. Setelah menentukan kandungan fenolik total, kemudian dilakukan pengujian aktivitas antioksidan ekstrak metanol daun sirih lengkung. Uji antioksidan dilakukan dengan metode FTC - TBA dengan mekanisme asam lionoleat. Metode FTC dan TBA merupakan metode pengukuran aktivitas antioksidan berdasarkan kemampuannya dalam menghambat reaksi peroksidasi lipid. Sebelum dilakukan replikasi, dilakukan orientasi untuk mengetahui profil absorbansi percobaan. Profil absorbansi percobaan digunakan untuk mengetahui 11


kapan terjadinya absorbansi maksimal dan penurunannya. Asam lemak yang digunakan pada percobaan ini adalah asam linoleat dan senyawa standar yang digunakan adalah BHT sedangkan kontrol adalah emulsi asam lemak tanpa mengunakan senyawa antioksidan. Metode FTC digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksida lipid dan metode TBA untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap kedua peroksida lipid dan mengukur radikal

bebasyang

ada

setelah

oksidasi

peroksida

(Aqil,et

al.,

2006;

Rezaeizadeh,et al., 2011). Metode FTC digunakan untuk menentukan tingkat hidroperoksida lipid dalam suatu sistem biologis. Pada metode ini, asam linoleat digunakan sebagai sumber peroksida. Peroksida yang terbentuk selama oksidasi asam linoleat akan bereaksi dengan Fe2+ untuk membentuk ion Fe3+ yang kemudian akan bereaksi

Absorbansi

dengan thiocyanate untuk membentuk kompleks warna merah. 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0

kontrol positif kontrol negatif sampel 1

2

3

4

5

6

7

Hari Ke-

Gambar 5. Grafik rata-rata absorbansi kontrol negatif, positif dan sampel

Pembacaan terjadinya proses peroksidasi lipid dapat dilakukan sampai kontrol negatif menunjukkan nilai absorbansi maksimum dan pada penelitian ini, absorbansi maksimum kontrol negatif diperoleh pada hari keenam, seperti yang tergambar dalam profil absorbansi (gambar 3). Nilai absorbansi menunjukkan jumlah radikal peroksida yang terbentuk selama proses oksidasi. Antioksidan dapat menghambat oksidasi asam linoleat yang ditandai dengan penurunan kadar oksidan hidroperoksida yang terbentuk dibandingkan kontrol. Penurunan kadar hidroperoksida berbanding lurus terhadap absorbansi dari senyawa Fe(SCN)3 dalam larutan uji (Arif et al., 2014). Hal ini berarti, profil kenaikan absorbansi

12


tidak hanya digunakan untuk mengetahui kapan terjadinya absorbansi maksimal dan penurunan reaksi peroksidasi lipid, tetapi juga menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sirih lengkung positif memiliki aktivitas antioksidan atau kemampuan dalam menghambat radikal peroksida yang ditandai dengan absorbansi yang berada di bawah absorbansi kontrol negatif. Profil rata-rata absorbansi baik kontrol maupun sampel uji menunjukkan absorbansi tertinggi terjadi pada hari keenam, yang menunjukkan pembentukan peroksida terus terjadi hingga hari keenam. Kemudian absorbansi turun pada hari ketujuh yang menyiratkan bahwa mulai terjadi dekomposisi peroksida, dimana peroksida yang terbentuk akan berikatan dengan senyawa radikal lainnya hingga membentuk senyawa baru yang lebih stabil dan menyebabkan jumlah peroksida mulai menurun (Pane, 2013). Tabel 3. Perhitungan % inhibisi berdasarkan absorbansi hari ke-6

Kontrol positif

Sampel

Absorbansi

% inhibisi

Replikasi 1

1,952

10.990

Replikasi 2

1,965

10.397

Replikasi 3

1,955

9.530

Replikasi 1

2,100

4.241

Replikasi 2

2,016

8.071

Replikasi 3

2,016

8.071

Rata-rata ± SD % inhibisi

10.306 ± 0.734

6.794 ± 2.211

Hari keenam inkubasi didapatkan rata - rata absorbansi tertinggi FTC untuk kontrol negatif, kontrol positif dan sampel adalah sebesar 2.193; 1.957; 1.976. Persentase penghambatan ekstrak pada hari dimana absorbansi mencapai absorbansi tertinggi menunjukkan besarnya penghambatan terhadap jumlah maksimal peroksida yang terbentuk. Besarnya penghambatan kontrol positif (BHT) dan sampel terhadap peroksida yang terbentuk sebesar 10.306 ± 0.734 dan 6.794 ± 2.211. Hal ini menunjukan aktivitas penghambatan lipid maksimum oleh BHT lebih tinggi daripada ekstrak metanol daun sirih lengkung. Dari hasil perhitungan menunjukkan bahwa ekstrak methanol daun sirih lengkung kurang

13


mampu menghambat peroksidasi lemak yang terbentuk dibandingkan BHT yang merupakan antioksidan sintetis. Meskipun demikian ekstrak metanol daun sirih lengkung tetap memiliki aktivitas antioksidan yang ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang lebih kecil dibandingkan kontrol negatif. Setelah pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FTC dilakukan penegasan dengan menggunakan metode TBA untuk mengukur nilai MDA, yang merupakan produk oksidasi sekunder yang terbentuk setelah tahap pertama peroksidasi lipid. Pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah oksidasi peroksida. Pada tahap kedua peroksidasi lipid, asam linoleat yang sudah banyak terbentuk menjadi radikal terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil, yaitu MDA (malondialdehid). Secara teoritis, senyawa tiga karbon malondialdehid (MDA) adalah produk dekomposisi utama karbonil pada proses autooksidasi dari lipid tak jenuh (Tokur et al., 2006). Tujuan dilakukannya pengukuran antioksidan dengan metode ini untuk mengetahui banyaknya senyawa MDA yang terbentuk, dimana senyawa ini merupakan turunan senyawa peroksida yang terbentuk pada tahap kedua reaksi peroksida lemak. MDA digunakan sebagai biomarker untuk mengetahui tahap akhir proksidasi lipid. Prinsip metode ini adalah pengukuran serapan dengan spektrofotometer dari reaksi MDA dengan asam 2-tiobarbiturat yang berwarna merah muda pada panjang gelombang 532 nm (Moon and Shibamoto, 2009). Pada hari ketujuh jumlah peroksida yang terbentuk sudah menurun ditunjukkan dengan menurunnya nilai absorbansi kontrol positif. Hal ini disebabkan karena sudah mulai terbentuknya MDA dari asam linoleat sehingga pengukuran TBA dilakukan pada hari kedelapan. Tabel 3. Aktivitas antioksidan sampel dengan metode TBA

Sampel

Absorbansi

Persen Inhibisi *

Kontrol (-)

1.001 ± 0.004

0

BHT

0.168 ± 0.009

83.217 ± 0.88

Ektrak metanol daun sirih lengkung

0.060 ± 0.001

91.908 ± 3.721

Catatan: *Data diwakili Rata-rata ± SD. Hasil replikasi tiga kali.

14


Tabel diatas menunjukkan bahwa nilai absorbansi persen inhibisi ekstrak metanol daun sirih lengkung terhadap MDA lebih besar daripada kontrol positif (BHT) dengan nilai persen inhibisi ekstrak metanol daun sirih lengkung sebesar 91.908 ± 3.721%, sementara nilai persen inhibisi BHT sebesar 83.217 ± 0.88 %. Secara statistik, nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (p<0,05). Hal ini menunjukan bahwa pada tahap kedua peroksida lipid, aktivitas penghambatan MDA oleh ekstrak metanol daun sirih lengkung lebih besar dibandingkan penghambatan peroksida pada tahap pertama peroksida lipid, aktivitas penghabatan radikal bebas lebih besar dibandingkan tahap pertama.

KESIMPULAN DAN SARAN Ekstrak metanol daun sirih lengkung (Piper aduncum L.) mengandung senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, flavonoid, saponin, polifenol, tanin, steroid dan terpenoid. Kandungan senyawa fenolik total ekstrak metanol dari daun sirih lengkung sebesar 184.533 ± 4.244 mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanol. Aktivitas antioksidan ekstrak metanol daun sirih lengkung yang dinyatakan dalam %inhibisi dengan metode FTC sebesar 6.794 ± 2.211% dan dengan metode TBA sebesar 91.908 ± 3.721%. Perlunya dilakukan penelitian lanjutan untuk melihat korelasi jumlah kandungan fenolik total terhadap kemampuan penghambatan radikal bebas yang terbentuk dari reaksi peroksidasi lipid.

15


DAFTAR PUSTAKA Aqil, F., Ahmad, I.,and Mehmood, Z, 2006, Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionaly Used Indian Medicinal Plants, Turk J Biol, Vol 30, pp. 177 – 183. Arcana, Jatava, S., Paul, R., and Tiwari, A., 2011, A Rich Source of Natural Immuno –Modulator , International Journal Of Pharmacology, 7 : 198205. Arif D.Y., Jose, C., dan Teruna, H.Y., 2014, Total Fenolik, Flavanoid serta Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-Heksana, Diklorometan dan Metanol Amaranthus spinosus L EM5-Bawang Putih, JOM FMIPA, 1(2): 359-369. Artini, P. E. U. D., Astuti, K. W., Warditiani, N. K., 2003, Uji Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Rimpang Bangle ( Zingiber purpureum Roxb.), Jurnal Farmasi Udayana, Indonesia. Bors, W., Heller, W., Michel, C. & Saran, M., 1990, Flavonoids as Antioxidants: Determination of Radical-Scanvenging Effeciencies, Methods Enzymol, Vol.186, pp. 343-355. Cadenas, E., and Packer, L., 2002, Handbook of Antioxidant, Second Edition, USA, MarcellDekker Ich,pp. 4. Cicco, N., dan Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate Concentration on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination of Phenolics with Low Concentration in the Presence of Methanol: A Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, Am. J. Anal. Chem., pp. 840-845. Cindric, I.J., Kunstic, M., Zeiner, M., Stingeder, G., dan Rusak, G., 2011, Sample Preparation Methods for the Determination of the Antioxidative Capacity of Apple Juices, Croat. Chem. Acta, 84(3), pp. 435-438. Departemen Kesehatan RI, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid V, Jakarta: Diktorat Jendral POM-Depkes RI, hal. 549-553. Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 695.

16


Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 7, 410. Donson, C.D., Dyer, L. A., Searcy, J., Wright, Z., and Letoumeau, D.K., 2000, Cenocladamide: A Diydropyridone Alkaloid from Piper Cenocladum, Phytochemistry, Vo. 53, pp. 51-54. Fang YZ.,Yang S., Wu G., 2002, Free Radicals, Antioxidants, and Nutrition, Nutrition 18:872– 879. Farnworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plant, J. Pharm. Sci P. 55. Gandjar, I.B., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 220-251, 353-365. Grace, S.C., 2005, Phenolics as Antioxidants in Antioxidants and Reactive Oxygen Species in Plants (ed. Smirnoff, N.), Blackwell Publishing, Oxford, UK, pp. 141 – 168. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, 49-51, Bandung, ITB Press. Hardiana, R., Rudiyansyah, dan Zaharah, T.A., 2012, Aktivitas Antioksidan Senyawa Golongan Fenol dari Beberapa Jenis Tumbuhan Famili Malvaceae, JKK, 1(1): 8-13. Khoddami, A., Wilkes, M.A., dan Roberts, T.H., 2013, Techniques for Analysis of Plant Phenolic Compounds, Molecules, 18: pp. 2328-2375. Kikuzaki, H., and Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effects of Some Ginger Constituents, Journal of Food Science, Vol. 58, No. 6, pp. 1407-1410. Kinsella, J,E., Frankel, E., German, B. and Kanmer, J., 1993. Possible Mekanisme for the Protective role of Antioxidants in Wine and Plants Foods, J Food technology. 4: 5 – 89. Kusumanto, 2014, Uji Aktivitas Antioksidan MenggunakanMetode Deoksiribosa dan Penetapan Kandungan Fenolik Total pada Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Buah Jambu Mete (Annacardium occidentale L.), Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

17

Skripsi,


Lamid, A., 1995, Vitamin E sebagai Antioksidan, Media Litbangkes, Vol. V, No. 01, hal. 14-16. Lee, K.W., Kim, Y.J., Lee, H.J., dan Lee, C.Y., 2003, Cocoa Has More Phenolic Phytochemicals and A Higher Antioxidant Capacity Than Teas and Red Wine, J. Agric. Food Chem., 51., pp. 7292-7295. MCMurry, J dan Fay, R.C., 2004.Chemisty 4th Edition. New Jersey : Prentice Hall. Moon, JK,. Shibamoto, T. 2009. Antioxidant Assays for Plant and Food Components. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57: 1655-1666. Muhtadi, Hidayati A. L., Suhendi. A., Haryoto., Sudjono.T.A.,2014, Pengujian Daya Antioksidan Dari Beberapa Ekstrak Kulit Buah Asli Indonesia Dengan Metode FTC, Simposium Nasional RAPI XIII - 2014 FT UMS, ISSN 1412-9612. Nurhayati, K. Siadi dan Harjono.2012. Pengaruh Konsentrasi Natrium Benzoat dan Lama Penyimpanan Pada Kadar Fenolat Total Pasta Tomat. UNS, Semarang. Hal 1-5. Nurmi, A., 2008, Antioxidants Studeis on Selected Lamiaceae Herbs In Vitro and In Humans, Yliopistopaino, University Print, Helsinki, Finland, 33. Pane, E.R., 2013, Uji Aktivitas Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Metanol Kulit Pisang Raja (Musa paradisiaca Sapientum), Valensi, 3(2): 76-81. Parida, R., dan Dhal, Y., 2011, A Study on The Micro-Propagation and Antioxidant Activity of Piper longum ( An Important Medicinal Plant ), Journal of Medicinal Plants Research, 5(32): 6691-6994. Parmar, V.S., Jain, S.C., Bisht, K.S., Jain, R., Taneja, P., Jha, A., Tyagi, O.D., Prasad, A.K., Wengel, J., Olsen, C.E., dan Boll, P.M., 1997, Phytochemistry of The Genus Piper, Phytochemistry, 46(4): 597-673. Rajanandh, M.G., Kavitha, J., 2010. Quantitative Estimation of Bsitosterol, Total Phenolic and Flavonoid Compounds in The Leaves of Moringa oleifera. Int. J. Pharm Tech Res. 2, 1409-1414. Rami, E., Sipai, S., dan Patel, I., 2013, Studies on Qualitative and Quantitative Phytochemical Analysis of Piper Longum Linn., International Journal of Pharma and Bio Scienes, 4(3): pp. 1381-1388.

18


Rezaeizadeh, A., Zuki, A.B.Z., M., Abdollahi, Goh, Y.M., Noordin, M.M., Hamid, M., dan Azmi, T.I., 2011, Determination of Antioxidant Activity in Methanolic and Cloroformic Extracts of Momordica charantia, African Journal of Biotechnology, 10(24): 4932-4940. Sangi, M., M.R.J. Runtuwene., H.E.I. Simbala., V.M. A. Making.2008. Analisis Fitokimia Tumbuhan Obat di kabupaten Minanghasa Utara. Chem. Prog. 1(1): 47-53. Santanu, S., Upal, K.M., Dilip, K.P., Sambit,. P. and Sourabh, J.,2010, Antioxidant potential of crude exstract and different fractions of enthydra fluctuans Lour, Iranian Journal of Pharmaceutical Research 9 (1) : 75-82. Sasikumar, J.M., Maheshu, V., dan Jayadev, R., 2009, In Vitro Antioxidant Activity of Methanolic Extracts of Berberis Tinctoria Lesch. Root and Root Bark, India Journal of Herbal Medicine and Toxicology, 3(2), pp. 53-58. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela- Raventos RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent. Methods in Enzymology, 1999. p.152-178. Subarnas A., 2001, Komponen Aktif Antioksidan Dalam Bahan Alam, Seminar Nasional dan Lokakarya. Pemahaman Konsep Radikal Bebas dan Peranan Antioksidan dalam Meningkatkan Kesehatan Menuju Indonesia Sehat 2010. Pusat penelitian

kesehatan. Bandung : Lembaga Penelitian

Universitas Padjadjaran. Svehla, G., 1990, Vogel Buku Teks Analisa Kuantitatif Anorganik. Edisi V. Jakarta: Kalman Media Pustaka. Hal: 300 – 303. Setyowati, E.P., Jenie, U.A., Sudarsono, Kardono, B., Rahmat, R., dan Meiyanto, E., 2007, Isolasi Senyawa Sitotoksik Spons Kaliapsis, Majalah Farmasi Indonesia, 18(4): 183-189. Thitilertdecha, N., Teerawutgulrag, A., Kilburn, J.D., dan Rakariyatham, N., 2010, Identification of Major Phenolic Compound from Nephelium lappaceum L. and Their Antioxidant Activities, Molecules, 15, pp. 14531465.

19


Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011, Phytochemical Screening and Extraction : A Review, Internasionale Pharmaceutica Sciencia, Vol. 1, India, pp. 98-106. Umemura, T., Kodama, Y., Hioki, K., Inoue, T., Nomura, T., dan Kurokawa, Y., 2001, Butylhydroxytoluene (BHT) Increases Susceptibility of Transgenic rasH2 Mice to Lung Carcinogenesis, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, Volume 127, Issue 10, pp. 583-590. Vemerris dan Nicholson, 2006, Phenolic Compound Biochemistry, Springer, USA, pp. 1-2. Wang, L. and Weller, C. L., 2006, Recent Advances in Extraction of Nutraceuticals from Plants, Trends in Food Science & Thechnology 17, 300-312. Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami & Radikal Bebas : Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta, hal. 13-15, 17, 20, 49-60. Yerwanto, I., Syelvia, L. K., Rudi, K., Fauzy, R., dan Partomuan, S., Uji Aktivitas Antioksidan Dan Toksisitas Ekstrak N-heksan Dan Etil Asetat Ranting Sirih Lengkung (Piperaduncum L.), Prosiding Seminar Nasional Kimia 2014. HKI-Kaltim.

20


Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman

21


Lampiran 2. Gambaran daun Sirih Lengkung ( Piper aduncum L.)

Lampiran 3. Hasil skrining Fitokimia daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.) Metabolit Sekunder

Hasil

Ciri khas larutan

Alkaloid

+

terbentuk endapan putih

flavonoid

+

terbentuk endapan kuning dibagian tengah tabung

Saponin

+

terbentuk busa setinggi 1-10 cm

polifenol

+

terbentuk endapan putih pada dasar tabung

Tanin

+

Steroid dan terpenoid

+

terbentuk warna hitam kehijauan pada tabung uji dibanding kontrol terbentuk warna merah kecoklatan pada lapisan bawah dan warna hijau pekat pada lapisan atas

22


Lampiran 4. Gambar Hasil skrining Fitokimia daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.) 1.

Pemeriksaan Alkaloid dengan pereaksi Mayer

Blangko

Larutan Uji

Foto Uji tabung pemeriksaan alkaloid dengan pereaksi mayer Keterangan gambar : Blangko mayer : HCl + pereaksi Mayer Sampel

2.

: ekstrak + HCl + pereaksi Mayer terdapat endapan putih

Pemeriksaan flavonoid dengan pereaksi tembaga asetat

Keterangan Blangko : larutan ekstrak Larutan Uji : ekstrak + tembaga asetat

blangko Sampel

23


3. Pemeriksaan Tanin dan Polifenol dengan FeCl3 dan Gelatin

Tabung 1

Tabung 2

Tabung 3

Keterangan : Tabung 1 : larutan ektrak metanol Tabung 2 : larutan ekstrak metanol dan FeCl3 10% Tabung 3 : larutan ekstrak metanol dan gelatin 1% 4. Pemeriksaan Saponin keterangan : Tabung : larutan ekstrak metanol dengan penetesan HCl 2 N

5. Pemeriksaan Terpenoid dan Streroid Keterangan : Blangko

: larutan ektrak metanol

Larutan Uji : larutan ekstrak metanol, kloroform dan H2SO4 Larutan Uji

Blangko

24


Lampiran 5. Penetepan kadar air serbuk daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.) Penetapan kadar air dilakukan menggunakan alat moisture balance dengan metode Gravimetri. Pemanasan serbuk daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.) dilakukan pada suhu 110ºC dalam waktu 15 menit. Hasil penetapan kadar air serbuk daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.) Bobot

Replikasi I

Replikasi II

Replikasi III

Sebelum pemanasan

5,042 g

5,022 g

5,016 g

Sesudah pemanasan

4,588 g

4,563 g

4,553 g

Kadar air

0,454 g

0,459 g

0,463 g

Rata-rata kadar air

0,458 g

= 9,004 %

= 9,139%

= 9,031%

= 9,058 %

Kadar air serbuk yang dipersyaratkan adalah kurang dari 10%. Kadar air serbuk daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.) sebesar 9,058 %, sehingga memenuhi persyaratan.

25


Lampiran 6. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteau

Keterangan: A = Kontrol positif (asam galat + reagen Folin - Ciocalteau + Na2CO3) B = Kontrol negatif (metanol : air (1:1) + reagen Folin - Ciocalteau + Na2CO3) C = Sampel (ekstrak metanol daun sirih lengkung + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3)

Lampiran 7. Perhitungan rendemen ekstrak a. Ekstrak metanol daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.) (gram) Bobot simplisia yang digunakan Bobot wadah Bobot cawan + ekstrak Bobot ekstrak

10.00 gram 125.2500 gram 125.3581 gram 0.1081 gram

% rendemen ekstrak = % rendemen ekstrak = Lampiran 8. Data penimbangan untuk penetapan kandungan ekstak metanol a. Penimbangan asam galat (larutan stok) Asam galat untuk operating time Replikasi 1 Replikasi 1 (gram) (gram) Bobot beker 63.7284 61.4635 Bobot beker + isi 63.7385 61.4735 Bobot isi 0.0101 0.0100

26

Replikasi 1 (gram) 62.1535 62.1636 0.0101


Lampiran 9. Data perhitungan konsetrasi asam galat dan ekstrak metanol untuk penetapa kandungan fenolik total a.

Contoh perhitungan konsentrasi asam galat Bobot asam galat replikasi 1 = 0,0101 g = 10,1 mg Konsentrasi larutan induk asam galat = Perhitungan seri konsentrasi replikasi 1

Seri 1 :

Seri 2 :

V1.C1 = V2.C2

V1. C1 = V2.C2

0.4 ml x 1010 µg/ml = 10 ml x C2

0.5 ml x 1010 µg/ml = 10 µl x C2

C2 = 40.4 µg/ml

C2= 50.5 µg/ml

Seri 3 :

Seri 4 :

V1. C1 = V2.C2

V1. C1 = V2.C2

0.6 ml x 1010 mµ/ml = 10 ml x C2

0.7 ml x 1010 µg/ml = 10 ml x C2

C2 = 60.6 µg/ml

C2 = 70.7 µg/ml

Seri 5 : V1. C1 = V2.C2 0.8 ml x 1010 µg/ml = 10 ml x C2 C2 = 80.8 µg/ml

Seri 1 Seri 2 Seri 3 Seri 4 Seri 5

Replikasi 2 konsentrasi 1000 µg/ml 40 50 60 70 80

27

Replikasi 3 konsentrasi 1010 µg/ml 40.4 50.5 60.6 70.7 80.8


Lampiran 10. Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan fenolik total a. Replikasi 1 OT 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Absorbansi konsentrasi asam galat pada 40 μg/ml 60 μg/ml 0.341 0.401 0.366 0.482 0.376 0.528 0.382 0.545 0.385 0.549 0.386 0.551 0.386 0.550 0.386 0.551 0.386 0.549 0.386 0.552 0.385 0.533 0.385 0.553

750 nm 80 μg/ml 0.574 0.607 0.626 0.635 0.640 0.640 0.640 0.639 0.639 0.639 0.638 0.638

Pada replikasi 1, OT yang didapat 30 menit.

b. Replikasi 2 Absorbansi konsentrasi asam galat pada 750 nm 40 μg/ml 60 μg/ml 80 μg/ml 5 0.344 0.408 0.581 10 0.368 0.490 0.610 15 0.377 0.532 0.627 20 0.384 0.544 0.636 25 0.386 0.549 0.640 30 0.386 0.548 0.641 35 0.387 0.548 0.640 40 0.386 0.549 0.640 45 0.386 0.549 0.640 50 0.386 0.550 0.639 55 0.385 0.537 0.638 60 0.385 0.546 0.638 Pada replikasi 2, OT yang didapat 25 – 30 Menit. OT

28


c. Replikasi 3 Absorbansi konsentrasi asam galat pada 750 nm 40 μg/ml 60 μg/ml 80 μg/ml 5 0.345 0.406 0.581 10 0.362 0.487 0.606 15 0.379 0.529 0.633 20 0.387 0.535 0.650 25 0.399 0.538 0.653 30 0.402 0.544 0.664 35 0.404 0.543 0.664 40 0.414 0.543 0.661 45 0.418 0.544 0.659 50 0.420 0.543 0.665 55 0.423 0.544 0.667 60 0.425 0.544 0.665 Pada replikasi 3, OT yang didapat 25 – 30 Menit OT

Lampiran 11. Optimasi Panjang Gelombang Maksimal untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total

a. Konsentrasi 40 μg/ml

29


b. Konsentrasi 60 μ

c. Konsentrasi 80 μg/ml

Lampiran 12. Hasil Pengukuran Kurva Baku untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total a. Replikasi 1 Seri 1 2 3 4 5

Konsentrasi 40,4 µg/mL 50,5 µg/mL 60,6 µg/mL 70,7 µg/mL 80,8 µg/mL

Absorbansi 0,349 0,430 0,499 0,606 0,620

Persamaan kurva baku A = 0,07 B = 0,00718 r = 0,9831

Absorbansi 0,390 0,419 0,484 0,569 0,624

Persamaan kurva baku A = 0,1264 B = 0,00618 r = 0,9894

y = 0,00718x + 0,07

b. Replikasi 2 Seri 1 2 3 4 5

Konsentrasi 40,0 µg/mL 50,0 µg/mL 60,0 µg/mL 70,0 µg/mL 80,0 µg/mL

y = 0,00618x + 0,1264

30


c. Replikasi 3 Seri

Konsentrasi 1 2 3 4 5

Absorbansi 40,4 µg/mL 50,5 µg/mL 60,6 µg/mL 70,7 µg/mL 80,8 µg/mL

Persamaan kurva baku 0,369 A = 0,0974 B = 0,00699 0,424 r = 0,9924 0,492 0,587 y = 0,00699x + 0,0974 0,622

Lampiran 13. Perhitungan Kandungan Fenolik Total Ekstrak Metanol Kandungan

Rata-rata ±

Fenolik Total

SD

Konsentrasi

Absorbansi

Replikasi 1

200 μg/ml

0.346

185.8

Replikasi 2

200 μg/ml

0.349

188

Replikasi 3

200 μg/ml

0.338

179.8

184.533 ± 4.244

Contoh perhitungan kandungan fenolik total: Contoh perhitungan kandungan fenolik total replikasi 1 : y = 0,00669x + 0,0974 0,346 = 0,00669x + 0,0974 x = 37.159 µg/mL = 0,0372 mg/mL Bobot ekstrak = 0.0100 gram Kandungan fenolik total = X

= 0.0372

= 185.8 mg

Maka kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 185.8 mg ekivalen asam galat per gram sampel. CV =

31

%CV

%


Lampiran 14. Data Penimbangan Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC a. Penimbangan BHT (kontrol positif) Bobot gelas beker

= 63,0377 gram

Bobot gelas beker + isi = 63,0418 gram Bobot zat

= 0,0041 gram

Lampiran 15. Hasil optimasi operating time Uji Aktivitas Antioksidan FTC Menit ke 1 3 5 7 10

Absorbansi pada panjang gelombang 500 nm Pengukuran 1 Pengukuran 2 Pengukurann 3 0,985 0,959 0,948 0,918 0,907 0,899 0,875 0,875 0,874 0,864 0,862 0,860 0,855 0,853 0,853

Operating time yang didapat adalah 5 menit

Lampiran 16. Hasil optimasi operating time Uji Aktivitas Antioksidan metode FTC a. Penimbangan BHT (kontrol positif)

Bobot gelas beker Bobot gelas beker + isi Bobot zat

Replikasi 1 (gram) 61,5081



61,5122

61,7657

63,6609

0,0041

0,004

0,004

Lampiran 17. Hasil optimasi panjang gelombang uji aktivitas antioksidan metode FTC a. Replikasi 1

32


b. Replikasi 2

c. Replikasi 3

Lampiran 18. Data penimbangan uji aktivitas antioksidan metode FTC – TBA a. Penimbangan BHT (kontrol positif) Bobot gelas beker = 62,4275 gram Bobot gelas beker + isi = 62,4316 gram Bobot zat = 0,0041 gram b. Penimbangan sampel ekstrak metanol daun sirih lenkung Bobot cawan Bobot cawan + isi Bobot zat

Replikasi 1 (gram) 22,7628 22,7668 0,004

33

Replikasi 2 (gram) 22,7834 22,7874 0,004

Replikasi 3 (gram) 23,3523 23,3563 0,004


Lampiran 19. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan metode FTC a. Nilai absorbansi kontrol negative, kontrol positif dan sampel Hari ke1 2 3 4 5 6 7

R1 1,604 1.729 2.081 2.135 2.157 2.157 1.959

Kontrol (-) R2 R3 1,587 1,599 1,716 1,722 2,057 2,065 2,145 2,168 2,194 2,208 2,159 2,263 1,946 1,945

R1 1,457 1,474 1,927 1,933 1,955 1,952 1,749

Kontrol (+) R2 R3 1,426 1,466 1,495 1,470 1,930 1,939 1,935 1,949 1,942 1,954 1,965 1,955 1,889 1,885

R1 1,251 1,570 1,949 1,994 2,060 2,100 1,918

Sampel R2 1,251 1,567 1,959 2,000 2,005 2,016 1,939

R3 1,241 1,567 1,979 2,010 2,014 2,016 1,939

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi kontrol negatif dengan spektrofotometri UV/Vis maka dapat dismpulkan bahwa pada ke-6 reaksi peroksidasi lipid telah mencapai batas maksimum. b. Rata – rata absorbansi kontrol negative, kontrol positif dan sampel Hari ke1 2 3 4 5 6 7

Kontrol (-) Rata-rata ± SD % CV 1.597 ± 0.009 0,563 % 1.722 ± 0.007 0,406 % 2.068 ± 0.012 0,580 % 2.149 ± 0.017 0,791 % 2.186 ± 0.026 1,189 % 2.193 ± 0.061 0.729 % 1.950 ± 0.006 0.308 %

Kontrol (+) Rata-rata ± SD % CV 1.450 ± 0.021 1.448 % 1.480 ± 0.013 0.878 % 1.932 ± 0.006 0.310 % 1.939 ± 0.009 0.464 % 1.950 ± 0.007 0.359 % 1.957 ± 0.007 0.358 % 1.841 ± 0.080 4.345 %

% CV = % CV =

= 0,563 %

34

Sampel Rata-rata ± SD 1.568 ± 0.002 1.248 ± 0.006 2.011 ± 0.051 2.044 ± 0.048 2.003 ± 0.008 1.976 ± 0.026 1.932 ± 0.012

% CV 0.127 % 0.481 % 2.536 % 2.348 % 0.399 % 1.316 % 0.621 %


c. Grafik absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel selama tujuh hari. 2.4

Absorbansi

2.2 2.0 1.8

kontrol positif

1.6

kontrol negatif

1.4

sampel

1.2 1.0 1

2

3

4 5 Hari Ke-

6

7

d. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode FTC Rata – rata absorbansi kontrol negatif hari ke – 6 = 2,193 Persen inhibisi Hari ke-

=

(A0 – A1/A0) x 100%

Kontrol + (BHT) (%) Replikasi 1 Replikasi Replikasi 3 2

6

10.990

Hari ke-

Replikasi1

6

4.241

10.397

9.530

Sampel (%) Replikasi Replikasi 3 2 8.071

8.071

Rata-rata ± SD

% CV

10.306 ± 0.734

7.122

Rata-rata ± SD

% CV

6.794 ± 2.211

32.543

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1 hari ke- 6: % inhibisi

= =

% CV =

4.241 %

=

= 32.543 %

35


e. Grafik nilai % inhibisi Kontrol Positif dan Sampel Rata-rata % inhibisi kontrol positif 0

5

10

15

% Inhibisi

Rata-rata % inhibisi sampel

Lampiran 20. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel Kontrol Negatif

Kontrol Positif

Sampel

R1

R2

R3

R1

R2

R3

R1

R2

R3

1.000

1.005

0.998

0.178

0.165

0.161

0.059

0.060

0,124

b. Profil absorbansi kontrol negative, kontrol positif dan sampel Kontrol Negatif 1.001 ± 0.004

c.

Rata – rata ± SD Kontrol Positif 0.168 ± 0.009

Sampel 0.060 ± 0.001

Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode TBA % inhibisi % inhibisi

= = =

% CV =

(A0 – A1/A0) x 100%

83.217 %

=

= 4.052 %

36


Kontrol Positif (BHT) Absorbansi kontrol negatif Absorbansi Replikasi 1 % inhibisi

1.001 0.178 82.218

Absorbansi kontrol negatif Absorbansi Replikasi 3 % inhibisi

1.001 0.616 83.916

Absorbansi kontrol negative Absorbansi Replikasi 2 % inhibisi

1.001 0.165 83.516

Rata – rata ± SD % inhibisi

83.217 ± 0.88

Ekstrak Metanol Daun Sirih Lengkung Absorbansi kontrol negatif Absorbansi Replikasi 1 % inhibisi Absorbansi kontrol negatif Absorbansi Replikasi 3 % inhibisi

1.001 0.059 94.106

Absorbansi kontrol negative Absorbansi Replikasi 2 % inhibisi

1.001 0.060 94.006

Rata – rata ± SD % inhibisi

1.001 0.124 87.612

91.908 ± 3.721

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1: % inhibisi

= =

37

94.106%


Lampiran 21. Data PSPP FTC

38


Lampiran 22. Data PSPP TBA

39

I SKRINING FITOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS

Recommend Documents