LABORATORIO DE BIOQUIMICA I
PRÁCTICA 6 CUANTIFICACIÓN PROTEICA POR EL MÉTODO DE BRADFORD INTRODUCCIÓN. En trabajos de bioquímica, frecuentemente es necesaria la determinación de la concentración de proteínas. Para tal objetivo existen diversos métodos y para la elección de uno de ellos habrá que tener en cuenta lo siguiente: o La cantidad total de proteína disponible o La concentración de la solución o La presencia de compuestos que interfieran en el ensayo o La rapidez con la que se necesita el resultado En 1972, Folin y Ciocalteau pusieron a punto un reactivo que lleva su nombre y que fue la base del método descrito después de Lowry en 1951. En el primer paso se forma el complejo de Biuret, dando la reducción de Cu2+ del complejo, para obtener Cu+ y enlaces peptídicos oxidados. En el segundo paso, el Cu+ reduce el reactivo de Folin-Ciocalteau, dando lugar a varios compuestos de color azul que se detectan a una longitud de onda de 750nm. El componente activo de este reactivo es el ácido mixto fosfomolibdotúngstico. La reducción de este reactivo se manifiesta por la pérdida de uno, dos o tres átomos de oxígeno del tungstato y del molibdato, obteniéndose las especies de color azul. Además de la reacción del complejo Biuret formado en la primera etapa, también contribuyen a la reducción del reactivo las cadenas laterales de algunos aminoácidos (Tyr, Trp y en menor medida Cys-Cys, y Cys-His). La susceptibilidad a la composición aminoacídica de las proteínas es una desventaja del método, además algunos agentes reductores utilizados en las preparaciones de las proteínas (βmercaptoetanol, ditiotreitol, EDTA) interfieren en el ensayo. El procedimiento de Lowry esta sujeto a la interferencia por compuestos como el ión potasio, magnesio, EDTA, Tris, reactivos con grupos tiol y carbohidratos. Otros métodos para cuantificar la cantidad proteica es el método de Biuret, que es sensible a todos los anteriores compuestos además de amonio y glicerol. Un procedimiento que elimina los problemas que los dos métodos anteriores, además del tiempo del proceso, es el método de Bradford, que esta basado en las propiedades químicas del principal compuesto, que es el azul brillante de Coomassie G-250, y el cual forma un complejo colorido azul al unirse a las proteínas y rojo en su forma libre. El complejo tiene un alto coeficiente de extinción molar y que se forma rápidamente (2 min) y que es estable por 1 h, lo cual provoca que no exista un tiempo critico en el ensayo. OBJETIVO Que el alumno analice y aplique el fundamento de la técnica de la determinación cuantitativa de proteínas Bradford, además de cuantificar la cantidad de proteína en un extracto crudo. MATERIALES 1 Espectrofotómetro 14 Tubos con tapa de rosca 2 Celdas para espectrofotómetro 1 Gradilla para tubos 1 Palangana 1 Probeta de 100 mL REACTIVOS 2 Matraz aforado de 50 mL NaCl 2 Vasos de precipitados de 100 mL Reactivo de Bradford 1 Micropipeta de 1000 y 200µL, Seroalbúmina bovina (SAB) 1 Piceta con agua destilada Agua destilada 1 Vortex Hongos (Equipo 1): 1 Agitador magnético Seta 1 Mortero con pistilo Champiñon
PRACTICA 6. CUANTIFICACIÓN PROTEICA POR EL MÉTODO DE BRADFORD
LABORATORIO DE BIOQUIMICA I
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES A. 500 mL de solución de NaCl 0.15 M B. Preparación de 50 mL de solución estándar de albúmina de huevo a 1 mg/ mL en NaCl 0.15 M C. Tomar un ejemplar del hongo y macerarlo con 20 mL de NaCl 0.15 M y aforarlo a 50 mL con la misma solución. PROCEDIMIENTO: 1. Adicionar al tubo 1, 800µL de solución patrón SAB y 800 µL de NaCl 0.15 M, agitar y tomar de este tubo 800µL y adicionarlo al tubo 2, al cual se le adicionaran 800 µL de NaCl 0.15 M, agitar. Efectuar este proceso hasta el tubo número 11 del cual se desecharan 800µL. Por otro lado tomar 800µL de la solución de hongos y efectuar 2 diluciones más. Tubo
Sol. SAB (µL)
NaCl 0.15M Vol. Total Conc. (mL) (mg/mL) (µL)
0 0 800 800 1 800 800 800 2 800 800 800 3 800 800 800 4 800 800 800 5 800 800 800 6 800 800 800 7 800 800 800 8 800 800 800 9 800 800 800 10 800 800 800 11 800 800 800 Una vez efectuadas las diluciones, se adicionan 200µL de Reactivo de Bradford a todos los tubos y después de 10 minutos, tomar la lectura de la absorbancia de cada tubo en la longitud de onda de 595 nm, previamente ajustando el espectrofotómetro con el blanco preparado con solución de NaCl (tubo 0). RESULTADOS Y DISCUSIÓN o Reportar una tabla con los datos de las absorbancias, el promedio, la desviación estándar y el % de error grupal. Graficar los promedios de la absorbancia contra la concentración y calcular por regresión lineal el coeficiente de correlación, la pendiente y la ordenada al origen de la recta del equipo y grupal. Calcule además por intrapolación la concentración proteica en mg/L y en mg/g hongo de las soluciones de hongos. CUESTIONARIO 1. Investigue la estructura química del principal componente del reactivo de Bradford 2. Analizando la estructura química, ¿Cuál sería el fundamento de la reacción de Bradford? 3. Enliste que reactivos son compatibles con el reactivo de Bradford 4. Efectue una tabla de la comparación de la sensibilidad del método de Lowry, Biuret y Bradford al cuantificar una serie de proteínas BIBLIOGRAFÍA 9 Bradford M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72: 248-254. 9 Bio-Rad Protein assay: Guide Bio-Rad assay. 2005, USA.
PRACTICA 6. CUANTIFICACIÓN PROTEICA POR EL MÉTODO DE BRADFORD
