LAPORAN PRAKTIKUM MIKROB DAN POTENSINYA
PENGUKURAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD
KHAIRUL ANAM P051090031/BTK
BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010
PENGUKURAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD Pendahuluan Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara kolorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert‐Beer) pada panjang gelombang 465‐595 nm (cahaya tampak).
Gambar 1. Struktur molekul Coomasie Blue
Bahan dan Metode Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri Bacillus subtilis dan Bacillus sp. umur 18 jam dalam larutan kaldu nutrient yang ditambahkan 1% pati tapioca yang kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. diperoleh supernatant yang kemudian disebut dengan ekstrak enzim kasar (EEK) Reagen Bradford dibuat dengan cara menimbang 0.01 g coomasie brilian blue (CBB) G‐250 yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85% (v/v). Campuran dihomogenkan (dikocok kuat) lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap dan suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5 kali sebelum digunakan.. Larutan standar protein dibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine serum albumin) yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm. Larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok
ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100 ppm. Dari larutan stok tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein dengan menambahkan 0.1 ml seri larutan standar dengan 5 ml reagen Bradford. Kemudian larutan divortex dan di inkubasi pada suhu ruang selama 10‐60 menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan didapatkan persamaan matematik untuk larutan standar protein yang diperoleh dari nilai absorbansi standar, yang akan digunakan pada pengukuran kadar protein terlarut. Pengukuran protein terlarut. Pengukuran sampel dilakukan dengan cara menambahkan 0,1 ml ekstrak enzim kasar dengan 5 ml reagen Bradford divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10‐60 menit. Absorbansi Larutan sampel protein dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva standar protein, akan didapatkan kadar protein terlarut yang terkandung dalam larutan ekstrak enzim kasar. Hasil dan Pembahasan Dari hasil pembacaan spektrofotometri larutan standar BSA maka diperoleh kurva standar sebagai berikut.
Gambar 2. Kurva standar larutan BSA Dari nilai absorbansi standar BSA, maka diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan regresi y = 1.445x + 0.258. Apabila absorbansi sampel adalah 0.360 dan 0.369 dari ekstrak enzim kasar yang
diperoleh dari biakan Bacillus sp. lalu dimasukkan ke dalam persamaan regresi, maka rata‐rata kadar proteinnya adalah 0.074 mg/ml atau 74 ppm larutan EEK sedangkan untuk ekstrak enzim kasar dari biakan Bacillus subtilis diperoleh absorbansi sampelnya adalah 0.347 dan 0.350, maka rata‐rata kadar protein adalah 0.063 mg/ml atau 63 ppm larutan EEK. Oleh karena itu, dari hasil percobaan tersebut dapat diketahui bahwa protein terlarut pada EEK dari biakan Bacillus sp. lebih banyak daripada protein terlarut yang ada pada EEK dari biakan Bacillus subtilis. Kesimpulan 1. Kadar protein terlarut EEK Bacillus sp. sebesar 74 ppm sedangkan kadar protein terlarut EEK Bacillus subtilis 63 ppm. 2. Kadar protein terlarut pada biakan Bacillus sp. lebih banyak daripada protein terlarut yang ada pada EEK dari biakan Bacillus subtilis. DAFTAR PUSTAKA 1. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microorganisms quantities of protein in utilizing the principle of protein‐dye binding. Anal. Biochem 72:248‐254.
