APÉNDICE G Identificación bioquímica de enterobacterias por el sistema API 20E OBJETIVO: - Establecer la metodología en la identificación de enterobacterias por medio de pruebas bioquímicas estandarizadas y miniaturizadas. GENERALIDADES: El sistema API 20E (Biomériux 2010) es un sistema de pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negtivos, mediante 23 pruebas bioquímicas estandarizadas y miniaturizadas y una base de datos. Este sistema puede identificar 108 géneros y 104 especies de estas bacterias. La galería API 20E consta de 20 microtubos que contienen los sustratos deshidratados de las pruebas bioquímicas tradicionales. Se inoculan con una suspensión bacteriana que rehidrata los medios y después de la incubación se observan los cambios de color con o sin adición de reactivos (Tabla 1). La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la tabla de lectura y la identificación mediante la tabla de identificación “Analytical Profile Index API 20E” o el software “APILAB”. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES 1 caja de agar MacConkeya Colorantes y reactivos para tinción de Grama Tiras para prueba de oxidasaa 1 tubo de 16 x 150 mm con 5 ml de solución salina isotónica 0.85% (P/V)b 1 tubo de 16 X 150 mm con solución de MacFarland (mezlcar 0.3 ml de BaCl2 al 1% y añadir 9.7 ml de H2SO4 al 1%)b Tiras API 20E (1 por colonia que se desee identificar)b Aceite mineral estérilb Agua para llenado de la cámara húmedab Reactivo de cloruro férrico (TDA)c Reactivo de Kovac’s (IND)c Reactivo para VP1 (potasa alcohólica al 40%)c Reactivo para VP2 (α-naftol)c MATERIAL - 1 pipeta Pasteur estérilb - Mecheroa, b - asa microbiológicaa, b
- Incubadora 35±2°Ca, b - Bulbo o propipetab NOTAS: a Material necesario al inicio de la técnica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la técnica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la técnica. PROCEDIMIENTO * Resembrar las colonias seleccionadas por estría en Agar MacConkey. * Incubar a 35±2°C durante 18 a 24 h. * Realizar tinción de Gram y observar características morfo-coloniales de la cepa con el objetivo de verificar pureza de la colonias seleccionadas. En caso de tener un carácter Gram-negativo y observar uniformidad en morfología y tamaño de bacterias proceder con el siguiente paso. * Efectuar la prueba de la oxidasa. En caso de ser negativa proceder con el siguiente paso. * Suspender el crecimiento obtenido en 5 ml de solución salina al 0.8% (P/V) (NaCl 0.8 %) hasta igualar turbidez del tubo 3 de MacFarland (preparar mezclando 0.3 ml de BaCl2 al 1% y añadir 9.7 ml de H2SO4 al 1%). * Proceder a inocular el sistema API 20E de acuerdo con la siguiente metodología: * Llenar el tubo y la cúpula de las pruebas CIT, VP, GEL con la suspensión bacteriana. * Llenar los tubos pero no las cúpulas de las demás pruebas. * Llenar la cúpula de las pruebas ADH, LDC, ODC, URE y H2S con aceite mineral estéril para obtener anaerobiosis. * Incubar a 35±2°C durante 18 a 24 h. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Pasado el tiempo de incubación consultar el Cuadro 1, para la adición de reactivos en los tubos respectivos y para la interpretación de resultados. Consultar el Cuadro 2 para obtener un número de identificación característico para cada especie. Consultar la Tabla de identificación del sistema API 20E (API 20E Analytical Profile Index, Bio-Mériux 2019) o el software APILAB (Bio-mériux), para determinar el género y la especie de la cepa aislada (En caso de no contar con la bibliografía mencionada, se podrá consultar el Bergey’s Manual para la identificación de la cepa aislada con base en los resultados de las pruebas bioquímicas). Cuadro 1. Tabla de lectura para las pruebas bioquímicas del sistema API 20E. Pruebas
Sustratos
Reacciones/Enzimas
Resultados Negativo Positivo
ONPG ADH LDC ODC CIT H2S
ortonitrofenol-βgalactósido arginina lisina ornitina citrato sódico
β-galactosidasa
incoloro
amarillo (1)
arginina dehidrolasa lisina descarboxilasa ornitina descarboxilasa utilización de citrato
amarillo amarillo amarillo verde pálido/amarillo incoloro/grisáceo
rojo/naranja (2) naranja rojo/naranja(2) azul-verde/verde (3) depósito negro
producción de H2S
URE
tiosulfato sódico urea
TDA
triptofano
triptofano deaminasa
IND
triptofano
producción de indol
VP
piruvato sódico
producción de acetoína
GEL
gelatinasa
GLU
gelatina de Kohn glucosa
MAN
manitol
INO
inositol
SOR
sorbitol
RHA
ramnosa
SAC
sacarosa
MEL
melibiosa
AMY
amigdalina
ARA
arabinosa
ureasa
fermentación/oxidación (4) fermentación/oxidación (4) fermentación/oxidación (4) fermentación/oxidación (4) fermentación/oxidación (4) fermentación/oxidación (4) fermentación/oxidación (4) fermentación/oxidación (4) fermentación/oxidación (4)
amarillo rojo/naranja TDR/lectura inmediata después de agregar el reactivo TDA (5) amarillo marrón oscuro IND/lectura 2 min después de agregar el reactivo IND (5) amarillo anillo rojo VP1 mas VP2/lectura 10 min después de agregar los reactivos VP1 y VP2 (5) incoloro rosado/rojo no ha difusión de difusión de pigmento negro pigmento negro azul/azul-verdoso amarillo azul/azul-verdoso
amarillo
azul/azul-verdoso
amarillo
azul/azul-verdoso
amarillo
azul/azul-verdoso
amarillo
azul/azul-verdoso
amarillo
azul/azul-verdoso
amarillo
azul/azul-verdoso
amarillo
azul/azul-verdoso
amarillo
(1) Un amarillo muy pálido debe considerarse como positivo. (2) Un color naranja después de 24 h de incubación debe considerarse negativo. (3) La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis). (4) La fermentación empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidación en la cúpula. (5) TDA:cloruro férrico; IND: reactivo de Kovac’s; VP1: hidróxido de potasio 40%; VP2: α-naftol. Fuente: Manual del sistema de identificación para Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negativos mediante 23 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos, (1989).
Cuadro 2. Sistema de numeración de las pruebas positivas, para determinar el número de identificación de enterobacterias por el sistema de identificación bioquímica API 20E. VAL OR ASIG NAD O a
a
ONP G
ADH
LDC
1 2 4 sumar valores
ODC
CIT
H2S
1 2 4 sumar valores
URE
TDA
IND
1 2 4 sumar valores
VP
GEL
GLU
1 2 4 sumar valores
MAN
INO
SOR
1 2 4 sumar valores
RHA
SAC
MEL
1 2 4 sumar valores
AMY
ARA
OX
1 2 4 sumar valores
Se le asigna este número si el resultado de la prueba fue positivo; si el resultado fue negativo el valor asignado es cero.
Fuente: Giles M. (1995) “Estudio sobre las interacciones microbianas importantes para el incremento de proteína durante la fermentación del pozol”. Tesis de licenciatura. Facultad de Química, UNAM. 73 p.
BIBLIOGRAFÍA. Bio-mériux (1989) “API 20E SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN PARA Enterobacteriaceae Y OTROS BACILOS GRAM-NEGATIVOS. No. 20100. Biomériux S.A. (de.). Francia. 24 pp. Giles M. (1995) “Estudio sobre las interacciones microbianas importantes para el incremento de proteína durante la fermentación del pozol”. Tesis de Licenciatura. Facultad de Química, UNAM. 73 pp.
