LAPORAN AKHIR PENELITIAN DASAR EKSPLORASI FUNGI DEUTEROMYCETES (Aspergillus sp. DAN Penicillium sp. ) PENGHASIL SENYAWA ANTI KOLESTEROL LOVASTATIN OLEH I NYOMAN P. ARYANTHA,Ph.D SISKA WIDAYANTI, S.Si YUANITA,S.Si
DIBIAYAI OLEH PROYEK PENELITIAN ILMU PENGETAHUAN DASAR DIREKTORAT PEMBINAAN PENELITIAN DAN PENGABDIAN KEPADA MAYARAKAT DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN TINGGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2004
1
2
LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN LAPORAN AKHIR HASIL PENELITIAN DASAR 1. JUDUL PENELITIAN EKSPLORASI FUNGI DEUTEROMYCETES (Aspergillus sp. DAN Penicillium sp. ) PENGHASIL SENYAWA ANTI KOLESTEROL LOVASTATIN 2.KETUA PENELITI a. Nama Lengkap b. Jenis Kelamin c. Pangkat/Golongan/NIP d. Jabatan Fungsional e. Fakultas/Jurusan f. Universitas g. Pusat Penelitian
: I Nyoman P. Aryantha, Ph.D :L : 131875316 : Ketua KPP Ilmu Hayati - LPPM ITB : MIPA : Institut Teknologi Bandung : KPP Ilmu Hayati ITB
3. JUMLAH TIM PENELITI
: 2 orang
4. LOKASI PENELITIAN
: Lab Mikologi KPPIlmu Hayati ITB
5. KERJASAMA DENGAN INSTANSI LAIN a. Nama instansi :b. Alamat :6. MASA PENELITIAN
: 1 Tahun
7. BIAYA YANG DIPERLUKAN
: Rp. 15.000.000,-
Mengetahui, Ketua KPP Ilmu hayati - LPPM ITB
Ketua Peneliti
(I Nyoman P. Aryantha Ph.D) NIP. 131875316
(I Nyoman P. Aryantha Ph.D) NIP.131875316
Menyetujui , Ketua LPPM ITB (Dr. Ir. M. Syahril Badri Kusuma) Nip.131571038
3
RINGKASAN
Jamur dari genus Deuteromycetes (Aspergillus sp. dan Penicillium sp.) dilaporkan menghasilkan senyawa metabolit sekunder lovastatin yang berkhasiat sebagai anti hiperkolesterolemia (Chang dan Miles,1973). Dalam penelitian ini diperlihatkan bahwa diperoleh 5 (lima) isolat dari spesies Aspergillus sp. dan Penicillium sp. galur lokal positif memproduksi lovasatin. Produksi lovastatin diperoleh secara optimum oleh Aspergillus terreus dalam komposisi medium kentang dektrosa dengan sumber karbon [C] tapioka sebesar 15% dan nitrogen (N) kedelai 5%, pada suhu ruang, pengocokan 125 rpm dan inkubasi selama 10 hari. Dengan kondisi produksi dihasilkan lovastatin oleh Aspergillus terreus yaitu sebanyak 54,2 mg/L.
4
SUMMARY Fungi from the Deuteromycetes genus Aspergillus sp. and Penicillium sp. have been reported to potentially produce lovastatin, a secondary metabolite as an antihypercholesterolemia agent (Chang and Miles,1973). Through this research, 5 isolates from local strain of Aspergillus sp. and Penicillium sp. were confirmed to produce statin. Maximum production of lovastatin and biomass growth was achieved by Aspergillus terreus with a condition as follows : Potato Dextrose Broth supplied with organic carbon (cassava 15%) and nitrogen (soy bean 5%), incubated at room temperature and 125 rpm agitation over a period of 10 days. With these fermentation system a maximum lovasatatin concentration was acheved at 54.2 mg/L by A. terreus.
5
I PENDAHULUAN
Sejalan dengan adanya perubahan gaya hidup dan kompleksitas kehidupan dewasa ini, muncul berbagai macam fenomena fisiologis tubuh termasuk yang menyebabkan gangguan penyakit dan perlu diantisipasi. Salah satunya adalah hiperkolesterolemia yang disebabkan oleh akumulasi kolesterol dan lipid pada dinding pembuluh darah. Fenomena ini merupakan faktor primer penyebab penyakit arterosklerosis, jantung koroner dan serangan jantung. Salah satu alternatif pilihan untuk penanggulangan hiperkolesterolemia adalah dengan agen inhibitor HMG-KoA (3-hidroksi-3-metilglutaril Koenzim A). Salah satu agen inhibitor HMG-KoA yaitu lovastatin. Lovastatin merupakan senyawa inhibitor kompetitif HMG-KoA reduktase yang mampu menurunkan kolesterol plasma dengan efek samping kecil yaitu tetap menjaga tekanan darah dalam ambang normal (Frick et al.,1987). Pengembangan produk lovastatin untuk telah mengalami kemajuan pesat baik secara alami maupun sintetis. Endo et al. (1976) menemukan bahwa secara alami kapang Monascus menghasilkan senyawa yang menghambat biosintesis kolesterol dan disebut lovastatin (mevanolin, monakolin K). Saimee (2003) berhasil melakukan screening terhadap berbagai fungi dari kelas Basidiomycetes dan Deuteromycetes yang mampu memproduksi lovastatin seperti Aspergillus, Penicillium, Pleurotus dan Trichoderma. Lovastatin yang dijual secara komersial di masyarakat umumnya merupakan lovastatin sintetis. Lovastatin sintetis dapat menyebabkan efek samping bagi kesehatan manusia seperti sakit kepala, mual, diare, ruam dan yang paling berbahaya adalah gagal
6
hati dan rabdomiolisis (Chang dan Buswell,1996). Disamping itu lovastatin juga diproduksi melalui metode kultur bawah permukaan berbagai jamur berfilamen. Namun, produksi lovastatin melalui metode tersebut relatif belum berkembang dengan baik (Saimee,2003). Berdasarkan uraian di atas, pada penelitian ini dilakukan isolasi, optimasi medium dan optimasi fermentasi senyawa lovastatin terhadap berbagai isolat jamur Aspergillus sp. dan
Penicillium sp.. Melalui metode ini diharapkan dapat
meningkatkan perolehan senyawa lovastatin tersebut sekaligus untuk melakukan diversifikasi produk dari kelas Deuteromycetes.
7
II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kelas Deuteromycetes Fungi Deuteromycetes adalah fungi imperfect atau tidak sempurna karena tidak memiliki fase seksual yang jelas. Morfologi khas dari kelas ini adalah struktur reproduksi berupa konidia (Gambar 1). Sebagian dari kelompok fungi ini adalah merupakan stadium anamorf dari kelas Ascomycetes atau Basidiomycetes. Fungi ini banyak terdapat di alam pada berbagai medium seperti makanan, tumbuhan, minuman, permukaan gelas bahkan juga logam. Deuteromycetes dapat tumbuh secara optimum pada suhu 29 – 32oC (Alexopoulos & Mims, 1979). Genera yang banyak dikenal bermanfaat bagi manusia dari fungi ini adalah Aspergillus sp. (Gambar 1A) dan Penicillium sp (Gambar 1B).
Gambar 1 Morfologi struktur reproduksi berupa konidia pada kelas Deuteromycetes : Aspergillus (kiri) dan Penicillium (kanan)
8
2.2
Lovastatin Lovastatin atau dikenal juga dengan nama mevinolin, merupakan senyawa
metabolit sekunder yang dihasilkan melalui jalur poliketida dan merupakan derivat dari asetat (Alberts, 1989). Lovastatin sebagai agen anti hiperkolesterolemia ditemukan pertama kali oleh Cimerman, et al pada tahun 1973. Lovastatin telah ditemukan pada Aspergillus terreus dan berbagai cendawan genus Pleurotus seperti P.sapidus, P.erynggi, P.cornucopial dan P.ostreatus. Lovastatin diperoleh antara lain melalui fermentasi bawah permukaan berbagai jamur berfilamen khususnya dari kelas Basidiomycetes atau melalui ekstraksi tubuh buah secara kimiawi (Saimee,2003).
2.2.1 Karakter Lovastatin Formula empiris
dari lovastatin adalah
C24H36O5 dengan berat molekul
404.55 g/mol. Lovastatin hadir dalam bentuk lakton non aktif dan asam hidroksi terbuka aktif (Gambar 2) , semi polar dan larut baik dalam etanol (Albert,1989). Bentuk aktif dari lovastatin adalah dalam bentuk asam hidroksi terbuka karena dapat berperan sebagai inhibitor kompetitif HMG KoA (Saimee,2003). Lovastatin tidak
larut dalam air, larut
sebagian dalam etanol, metanol,
asetonitril, etil asetat dan larut sempurna dalam kloroform. Lovastatin mempunyai titik leleh 174,5 oC, rotasi optik pada konsentrasi 0,5 gram dalam 100 ml asetonitril sebesar 325o. Lovastatin mempunyai serapan maksimum sinar ukltraviolet pada λ 235,238, dan 247 nm.
9
Gambar 2 Lovastatin (a) bentuk lakton non aktif (b) asam hidroksi terbuka
2.2.2 Peran Lovastatin Lovasatin digolongkan ke dalam kelompok obat statin (Albert,1989). Lovastatin sebagai agen hiperkolesterolemia mampu menurunkan kadar serum kolesterol, LDL, trigliserol dan VLDL dalam darah (Albert, 1989). Selain sebagai agen hiperkolesterolemia, lovastatin berpotensi sebagai inhibitor MAP kinase dan pengaktif p21 ras.
2.2.3 Mekanisme kerja lovastatin sebagai agen hipokolesterolemia Prinsip kerja lovastatin terhadap HMG KoA reduktase sama dengan prinsip kerja inhibitor kompetitif enzim (Gambar 3). HMG KoA reduktase dilambangkan sebagai enzim utama (E), Lovastatin sebagai inhibitor kompetitif (I) dan HMG KoA sebagai substrat (S). HMG KoA reduktase adalah enzim utama yang mendukung sintesis kolesterol di organ hati dengan cara berikatan dengan mengubah HMG KoA menjadi mevalonat. Ketika lovastatin hadir dalam bentuk asam hidroksi terbuka dengan konsentrasi lebih dari konsentrasi substrat (HMG KoA) maka HMG KoA reduktase akan lebih cenderung berikatan dengan lovasatin sehingga jumlah dan frekuensi sintesis kolesterol tereduksi (Omura,1992).
10
Gambar 3.
2.3.
Prinsip kerja lovastatin sebagai enzim inhibitor kompetitif HMG KoA reduktase
Kolesterol Kolesterol adalah molekul biologis yang berperan sangat penting dalam
sintesis membran sel, prekusor sintesis hormon steroid, hormon korteks adrenal dan sintesis asam- asam empedu dan vitamin D.
2.3.1
Struktur kolesterol Kolesterol terdiri atas high density cholesterol (HDL), low density cholesterol
(LDL) dan trigliserida. HDL bertugas untuk membawa kolesterol dari aliran darah ke hati. LDL bertugas membawa kolesterol kembali ke aliran darah. Kolesterol dapat berasal dari dua sumber yaitu eksogen (makanan) atau endogen (disintesis dalam tubuh). Hiperkolesterolemia disebabkan kadar kolesterol melebihi 239 mg/mL dalam darah.
11
2.3.2 Biosintesis Kolesterol Biosintesis kolesterol terjadi pada sel-sel eukaryota. Sintesis kolesterol di mulai dari perpindahan asetil-KoA dari mitokondria ke sitosol, khususnya di peroksisom. Biosintesis kolesterol terjadi di 25 % di organ hati dan 10% di usus (Endo et.al.,1976). Terdapat lima tahapan utama dalam biosintesis kolesterol yaitu (1) konversi asetil-KoA menjadi 3-hidroksi-3-metilglutaril-KoA (HMG KoA), (2) konversi HMG KoA menjadi mevalonat, (3) konversi mevalonat menjadi suatu molekul isopren yaitu isopentil pirofosfat (IPP) bersamaan dengan hilangnya CO2, (4) konversi IPP menjadi squalene dan (5) konversi squalene menjadi kolesterol. Dalam biosintesis kolesterol dilibatkan sebanyak sepuluh macam enzim yaitu asetoasetil-KoA thiolase, HMG KoA sintase, HMG KoA reduktase, mevalonat kinase, fosfomevalonat
kinase,
fosfomevalonat
dekarboksilase,
isopentenil-pirofosfat
isomerase (IPP isomerase), farnesil-pirofosfat transferase (FPP transferase), squalene sintase dan squalene epoksidase. Mekanisme
penghambatan pembentukan kolesterol oleh lovastatin melalui
salah satu komponen dari struktur lovastatin yang mempunyai analog dengan HMGKoA dan akan diubah menjadi asam mevalonat dengan bantuan enzim HMG-KoA reduktase. Akibatnya, lovastatin mampu berkompetisi dengan HMG-KoA untuk berikatan dengan enzim HMG-KoA reduktase. Jika jumlah lovastatin cukup besar untuk berikatan dengan HMG-KoA reduktase maka asam mevalonat yang merupakan senyawa antara biosintesis kolesterol tidak akan terbentuk sehingga pembentukan kolesterol menjadi terhambat.
12
2.4.
Faktor – Faktor yang Mempengaruhi Produksi Lovastatin
Faktor utama yang mempengaruhi sintesis lovastatin adalah jenis (strain) fungi yang dipakai, metode fermentasi yang digunakan (fermentasi padat atau fermentasi cair), komposisi media (terutama pada fermentasi cair), suhu, kelembaban (terutama pada fermentasi padat), dan pH. Setiap strain fungi mempunyai struktur gen yang berbeda sehingga memiliki kemampuan dalam produksi lovastatin yang berbeda pula. Metoda fermentasi mempengaruhi kuantitas sekresi lovastatin oleh fungi. Pada fermentasi padat lovastatin lebih stabil dan lebih mudah disekresi ke medium daripada dalam fermentasi cair. Lovastatin terakumulasi di dalam miselium pada fermentasi cair. Komposisi media mempengaruhi metabolisme jamur. Sebagai contoh, saat jamur ditumbuhkan pada medium yang mengandung sumber nitrogen garam amonium akan menyebabkan jamur menghasilkan metabolit yang bersifat asam. Pada medium amonium nitrat, biasanya ion amonium digunakan terlebih dahulu sebagai sumber nitogen sehingga kondisi medium menjadi asam. Tetapi, saat amonia di dalam medium telah habis, jamur akan menggunakan asam nitrat sebagai sumber nitrogen dan akibatnya keasaman medium berkurang. Pada produksi lovastatin diperlukan sumber nitrogen yang dapat dipenuhi dari berbagai sumber seperti pasta tomat, kasein, jagung, ekstrak daging, asparagin, amonium sulfat, dan lain-lain. Pada proses ini sumber nitrogen yang dibutuhkan 0,2-6% dari berat medium. Suhu kultivasi merupakan salah satu faktor fisik yang mempengaruhi pertumbuhan, sintesis dan sekresi lovastatin. Suhu mempengaruhi laju pertumbuhan dan jumlah total pertumbuhan organisme. Semua proses pertumbuhan tergantung reaksi kimiawi dan suhu mempengaruhi laju reaksi-reaksi kimia. Enzim akan mengalami denaturasi pada suhu yang terlalu tinggi atau menjadi tidak aktif pada suhu terlalu
13
rendah. Hal ini akan menyebabkan perubahan laju reaksi kimia. Misalnya, pada kondisi tersebut terjadi peningkatan pengikatan represor atau inhibitor dari suatu reaksi kimia yang bisa menyebabkan menurunnya laju reaksi kimia tersebut dibandingkan dengan kondisi normal. Produksi lovastatin membutuhkan pH optimum dengan kisaran 5,5-6,0. Bila pergeseran pH terlalu besar akan menghambat pertumbuhan. Tetapi, pH awal dan pH akhir biasanya sama dengan kisaran 7-8.
14
III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1
Tujuan Penelitian •
Memperoleh sumber isolat unggul berasal dari fungi genus Aspergillus sp.dan Penicillium sp. galur lokal
penghasil senyawa metabolit sekunder anti-
hiperkolesterolemia berupa lovastatin. •
Meningkatkan produksi statin pada kultur isolat terpilih melalui optimasi komposisi medium sumber C dan N dalam medium pertumbuhan serta optimasi metode fermentasi.
3.2
Manfaat Penelitian Diharapkan luaran penelitian ini menghasilkan perolehan isolat unggulan baru
berasal dari genus Aspergillus sp. dan Penicillium sp. galur lokal yang berpotensi sebagai penghasil lovastain. Selain itu, diharapkan hasil yang diperoleh dalam optimasi komposisi medium serta metode fermentasi mampu memberikan data akurat bagi peningkatan produksi lovastatin agar pada akhirnya dapat diproduksi obat antihiperkolesterolemia yang aman, efektif dan ekonomis.
15
IV BAHAN DAN METODA
Penelitian ini terbagi menjadi 4 (empat) tahapan, yaitu (1) isolasi dan seleksi isolat-isolat fungi genus Aspergillus sp. dan Penicillium sp. galur lokal, (2) Optimasi komposisi medium sumber C dan N dalam medium pertumbuhan, (3) Optimasi metode fermentasi, dan (4) produksi statin skala laboratorium. penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikologi KPP Ilmu Hayati ITB.
4.1.
Pembuatan Medium AKD dan KKD Medium Agar Kentang Dekstrosa (AKD) sebanyak 1L dibuat dari rebusan
potongan kentang (1 x 1 cm) sebanyak 200g dalam 1L akuades selama 1 jam. Selagi dipanaskan, kaldu rebusan kentang ditambahkan akuades hingga volume 1L lalu ditambahkan 20g dekstrosa, dan 20g agar, diaduk hingga larut dan homogen. Diusahakan selama pemanasan, voume media tetap 1L. Medium disterilkan pada suhu 121oC, tekanan 15 lbs selama 20 menit. Medium steril kemudian dituang ke dalam cawan petri (20 mL/petri) di laminar UV dan didiamkan hingga padat. Pembuatan media Kaldu Kentang Dekstrosa (KKD) serupa dengan medium AKD tetapi bedanya tidak ditambahkan dengan agar.
4.2.
Analisis senyawa lovastatin dengan KLT Identifikasi senyawa lovastatin dalam sampel ekstrak miselium dilakukan
analisis kualitatif dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan pelat alumunium pralapis Silica Gel E.Merck 60 F254 berukuran 20 x 20 cm2 dengan ketebalan 0.2 mm.
16
Pelat terlebih dahulu dikeringkan pada suhu 30oC selama 10 menit untuk mengaktifkan silika gel. Masing-masing sampel dilarutkan dalam 1 mL asetonitril. Setelah pelat KLT diaktifkan, sampel dan standar ditotolkan sebanyak 5µL dan dikembangkan dalam suatu bejana yang telah dijenuhkan berisikan larutan pengembang campuran diklorometan dan etil asetat dengan perbandingan 7 : 3 (Saimee, 2003). Penotolan dilakukan pada jarak 1.5 cm dari bawah, pinggir kiri dan pinggir kanan dengan jarak antar totolan 1.5 cm. Setelah larutan pengembang berhenti bergerak, diangkat dari bejana lalu dikeringkan di udara terbuka selama 15 menit. Hasil KLT siap dilihat di bawah sinar ultra violet dengan panjang gelombang 254 nm. Harga Rf dari noda-noda yang muncul pada kromatogram ditentukan dengan cara menghitung perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh suatu noda dengan yang ditempuh oleh larutan pengembang, diukur dari titik penotolan (Gritter dan Bobbit,1985). Untuk penentuan kadar secara kuantitatif, plat KLT dibaca dengan alat TLC-scanner yang dapat mengukur kekuatan pendaran noda berdsarkan nilai absorbansinya yang berbanding lurus dengan kadarnya. Untuk menghitung kadar lovastatin, sebelumnya dibuat kurva standar hubungan antara kadar lovastatin dengan nilai absorbansi.
4.3.
Analisis Lovastatin dengan metode KCKT Keberadaan lovastatin dalam penelitian ini juga dikonfirmasi dengan metode
KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). Pelarut yang digunakan untuk mengekstrak lovastatin adalah asetonitril. Sampel sebanyak 1 g ditambah 2 mL asetonitril dan 0,1 mL asam fosfat 0,1 %, kemudian diinkubasi selama 30 menit. Lalu larutan disentrifuga dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan disuntikkan ke
17
dalam kolom KCKT sebanyak 1 µg/ml.
Kondisi KCKT yang digunakan ialah
menggunakan kolom C-18 (250 cm x 46 cm), pelarut asetonitril dan asam fosfat (60:40, v/v), kecepatan alir sebesar 1,5 mL/menit, menggunakan detektor ultraviolet (UV) pada panjang gelombang 235 nm, suhu kolom 30 oC (Saimee, 2003).
4.6
Isolasi dan seleksi fungi Aspergillus sp. dan Penicillium sp. penghasil lovastatin Kultur Tabung •
Aktivasi selama 24 jam
•
Inokulasi ke medium AKD
•
Inkubasi selama 4 hari, 30oC
Kultur Petri
Pemotongan [2 x 0.5 cm]
Inokulasi 10% ke 250 Medium KKD
Inkubasi pada suhu ruang, 125 rpm, 4 hari
Kultur Cair
Miselium
Filtrasi dengan kertas saring
Filtrat
Pengukuran Lovastatin Pengaturan pH 3 Ekstraksi dengan EtOAc [1/3 vol filtrat] Sentrifugasi 1000rpm,10 menit
Sampel
Negatif (Nilai Rf tidak sama / Tak ada noda)
Uji KLT
Positif (Nilai Rf sama / Ada noda)
18
Hasil tahap ini berupa galur lokal yang positif menghasilkan metabolit sekunder berupa lovastatin digunakan dalam tahap berikut yaitu optimasi komposisi medium.
4.5.
Optimasi Komposisi Medium Isolat penghasil lovastatin Inokulasi ke medium AKD Inkubasi selama 4 hari, 30oC
Kultur Petri Pemotongan [2 x 0.5 cm] Inokulasi 10% ke 250 ml medium KKD dengan rasio CN berbeda a.
Medium KKD + C
b.
Medium KKD (kontrol)
c.
Medium KKD + N
Inkubasi pada suhu ruang, 125 rpm, 10 hari
Pelet miselium Pengeringan Pengukuran biomassa kering
Berat kering miselium
Hasil tahap ini berupa komposisi medium yang paling menunjang pertumbuhan biomassa misleium fungi serta galur dengan pertumbuhan paling baik akan digunakan dalam optimasi metode fermentasi.
19
4.6
Optimasi Waktu Fermentasi
Kultur Tabung Isolat terpilih
Inokulasikan ke medium AKD
Inkubasi selama 4 hari; 30oC
Pemotongan [2 x 0.5 cm]
Inokulasi 10% ke 250 ml medium KKD + C tapioka 15%
Kultur Petri
dan N kedelai 5%
Inkubasi [suhu ruang, 125 rpm dengan variasi waktu pengocokan [2,4,6,8,10 dan 12 hari]
Pelet miselium
Produk Fermentasi
Pengukuran kadar lovastatin pada tiap perlakuan
Konfirmasi uji KCKT
Kadar Lovastatin
20
V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1.
Penumbuhan isolat hasil isolasi Pertumbuhan isolat-isolat galur Aspergillus sp. dan Penicillium sp. di dalam
medium Agar Kentang Dekstrosa (AKD) memperlihatkan pertumbuhan yang baik (Gambar 4). Medium AKD mengandung karbohidrat kompleks yang kaya akan sumber karbon dan nitrogen yang dibutuhkan oleh fungi untuk melangsungkan metabolisme primer dan sekunder. Selain itu medium ini mengandung berbagai senyawa anorganik, vitamin dan faktor pertumbuhan (Ingold,1975).
1
4
2
3
5
6
Gambar 4. Beberapa koloni fungi kelompok Aspergillus (1, 2, 4) dan Penicillium (3, 5, 6) yang tumbuh dengan baik dalam medium PDA
5.2.
Kultivasi bawah permukaan Aspergillus sp. dan Penicillium sp. Pembentukkan pelet dari miselium didukung oleh perlakuan agitasi pada
kecepatan 180 rpm. Pada hari ke-2 agitasi miselium, warna pada medium KKD mulai berubah dari warna coklat transparan menjadi coklat keruh. Menurut Griffin (1994), agitasi pelet miselium pada kecepatan 125 rpm dalam waktu cukup lama
21
dapat menyebabkan dinding sel jamur lisis sehingga organel dan metabolit sekunder tereksitasi dari sel.
5.3. Seleksi galur Aspergillus sp. dan Penicillium sp. penghasil lovastatin Pada tahap isolasi fungi Deuteromycetes berhasil dikumpulkan sebanyak 15 jenis galur lokal dari dua marga yaitu Aspergillus sp. dan Penicillium sp. Pada tabel 1, dapat dilihat jenisnya. Isolat tersebut diisolasi dari berbagai jenis makanan olahan kadaluwarsa, buah-buahan, sayur-sayuran dan tanah di Laboratorium Mikologi - KPP Ilmu Hayati ITB.
Tabel 1. Galur Aspergillus sp. dan Penicillium sp. penghasil Lovastatin No
Galur
Kode
Hasil
Jenis Statin
1
Aspergilllus niger
A
-
2
Aspergillus terreus
B
+
Lovastain
3
Aspergillus flavus
C
+
Lovastain
4
Aspergillus sp.1
D
-
5
Aspergillus sp.2
E
-
6
Aspergillus sp 3
F
-
7
Aspergillus sp. 4
G
+
8
Aspergillus sp.5
H
-
9
Penicillium requefortii
I
+
10
Penicillium sp.1
J
-
11
Penicillium sp.2
K
-
12
Penicillium sp.3
L
-
13
Penicillium sp.4
M
-
14
Penicillium citrinum
N
+
15
Penicillium sp.5
O
-
Lovastain Pravastain
Pravastatin
22
5.4. Optimasi komposisi medium Produksi lovastatin pada genus Aspergillus sp dan Penicillium sp. dipengaruhi oleh rasio C dan N pada komposisi medium. Dalam penelitian ini, tambahan sumber C dan N adalah senyawa organik. Sumber C tambahan berupa sukrosa (10% w/v) dan tepung tapioka (15-20%,w/v).
Sumber N tambahan berupa NPK (2-3%,w/v) dan
tepung kedelai (5-10%,w/v). Menurut hasil penelitian Lopez (2002), pertumbuhan biomassa miselium seiring dengan pertambahan konsentrasi lovastatin dalam miselium. Oleh karena itu, pada tahap penelitian ini, dilakukan pengukuran pertumbuhan miselium melalui berat kering sel dari pelet miselium yang terbentuk. Dari percobaan terhadap sumber Karbon (C) dan Nitrogen (N) secara bertahap (Gambar 5-12) diperoleh hasil yang lebih baik untuk pertumbuhan biomassa adalah sebagai berikut : sumber C adalah tapioka dengan konsentrasi 15% sementara sumber N kedelai dengan kadar 5% lebih baik dibandingkan NPK. Atas dasar data ini selanjutnya dilakukan pemilihan isolat terbaik dalam
menghasilkan
biomasa
tertinggi
dengan
medium
pertumbuhan
yang
mengnadung sumber C (tapioka 15%) dan N (kedeleai 5%). Dari pemilihan sumber karbon (Gambar 5-8), dapat dilihat bahwa setelah inkubasi selama 10 hari tampak isolat B dan I memberikan pertumbuhan biomasa terbaik sebesar 1219,7 mg/L dan 601,8 mg/L yang masing-masing dicapai pada hari ke-9 dan hari ke10 (Gambar 5). Dalam pemilihan sumber N (Gambar 9-12), isolat B masih tetap memberikan data pertumbuhan tertinggi yang dicapai pada hari ke-8 (615,9 mg/L) sementara isolat G menempati urutan kedua dengan berat biomasa 562,3 mg/L yang dicapai pada hari ke-10 (Gambar 9). Antara penambahan sumber C dan sumber N ternyata penambahan sumber C (tapioka 15%) memberikan nilai pertumbuhan yang lebih baik secara keseluruhan
23
seperti tampak dalam Gambar 5. Menurut Lopez (2002), sumber C organik sangat menunjang pertumbuhan miselium karena dapat diurai secara langsung dalam jalur poliketida oleh beberapa fungi dari kelas Basidiomycetes dan Deuteromycetes. Dari percobaan pemilihan sumber N ini, meskipun isolat G memberikan data pertumbuhan lebih baik (562,3 mg/L) dari isolat I (438,6 mg/L), namun dari percobaan penambahan sumber C isolat I memberikan data pertumbuhan yang lebih tinggi yakni sebesar 601,8 mg/L. Oleh karena itu, pemilihan isolat untuk optimasi selanjutnya didasarkan atas data penambahan sumber C (tapioka 15%). Atas pertimbangan ini, 2 isolat yang dipilih untuk uji selanjutnya adalah isolat B (Aspergillus terreus) dan isolat I (Penicillium requefortii).
600 500 400 300 200 100 0
2
4
B
C
6
8
G
10
I
N
Gambar 5. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + C (tapioka) 15%
24
Berat kering biomasa (mg/L)
1200 1000 800 600 400 200 0
2
4
6
8
10
Waktu inkubasi (hari) B
C
G
I
N
Gambar 6. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + C (tapioka) 20%
Berat kering biomasa (mg/L)
600 500 400 300 200 100 0
2
4
B
C
6
8
G
10
I
N
Gambar 7. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + C (sukrosa)15%
25
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
2
4
6
B
8
10
I
N
Keterangan : Data isolat C dan G tidak teramati karena terkontaminasi Gambar 8. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + C (sukrosa)20%
700
Berat kering biomasa (mg/L)
600 500 400 300 200 100 0
2
4
6
8
10
Waktu inkubasi (hari) B
C
G
I
N
Gambar 9. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + N (kedelai) 5%
26
Berat kering biomasa (mg/L)
350 300 250 200 150 100 50 0
2
4
6
8
10
Waktu inkubasi (hari) B
C
G
I
N
Gambar 10. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + N (kedelai) 10%
Berat kering biomasa (mg/L)
140 120 100 80 60 40 20 0
2
B
4
6
Waktu inkubasi (hari) C
G
8
10
I
N
Gambar 11. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + N (NPK) 5%
27
Berat kering biomasa (mg/L)
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
2
B
4
6
8
10
Waktu inkubasi (hari) C
G
I
N
Gambar 12. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + N (NPK) 10%
Pada tahap penentuan komposisi medium, dapat disimpulkan bahwa medium yang menunjang pertumbuhan adalah medium KD + C (tapioka 15%) dan medium KD + N (kedelai 5%). Juga dari tahap ini diperoleh isolat dengan pertumbuhan biomassa yang paling baik yaitu Aspergillus terreus (isolat B) dan Penicillium requerfortii (isolat I) . Oleh karena itu, kedua isolat ini digunakan dalam optiumasi waktu fermentasi.
5.5.
Optimasi waktu fermentasi Pada tahap optimasi waktu fermentasi ini dilakukan pada suhu ruang dengan
variasi rentang waktu 12 hari dan agitasi (pengocokan) 125 rpm. Sementara komposisi medium yang digunakan adalah medium KD dengan kombinasi penambahan tapioka 15% dan kedelai 5%. Dapat dilihat pada Tabel 4 bahwa perolehan kadar lovasatatin tertinggi terdapat pada galur Aspergillus terreus.
28
Tabel 2 Produksi lovastatin dalam medium KD + C (tapioka 15%) dan N (kedelai 5%) Hari 2
Lovastatin (mg/L) 8.7
Lovastatin (mg/L) 2.7
4
20.2
8.4
6
35.4
19.3
8
40.3
27.5
10
54.2
28.2
12
51.3
27.7
Dapat dilihat diantara hari ke-8 sampai hari ke-10 walau terdapat penurunan biomassa miselium Aspergillus terreus, terjadi peningkatan kadar lovastatin yang cukup signifikan. Sedangkan pada Penicillium requefortii baik pertumbuhan biomassa dan produksi lovastatiun masih beriringan namun tidak mengalami peningkatan yang signifikan. Menurut Lopez (2002), produksi lovastatin terjadi secara optimum pada kondisi medium dengan C berlebih dan sumber N yang berkurang dan menjadi faktor penghambat pertumbuhan miselium. Pada kondisi seperti ini, fungi akan cenderung memanfaatkan sumber C sampingan ke dalam metabolisme sekunder dan menghasilkan lovastatin yang mengandung unsur C, H dan O. Hal ini dapat dilihat pada fenomena hari ke-10 dimana walau biomassa A.terreus mengalami penurunan, produksi lovastatin tetap mengalami peningkatan yang signifikan yaitu sebesar 54.2 mg/L. Senyawa lovastatin pertama kali ditemukan dalam Monascus rubber (Endo, et al, 1976). Lovastatin juga ditemukan dalam filtrat fermentasi miselium Aspergillus terreus oleh Lopez (2002). Saimee (2003) menunjukkan bahwa terdapat lovastatin
29
dalam filtrat fermentasi miselium A. terreus, A. parasiticus, A. fischery, A. flavus, A. umbrosus , P. funiculosum, P. citrinum dan Trichoderma viridae. Lovastatin juga terdapat pada beberapa jenis jamur dari kelas Basidiomycetes seperti Pleurotus ostreatus (Widayanti, 2003).
30
VI KESIMPULAN DAN SARAN
1. Diperoleh 15 isolat lokal yang terdiri atas 8 isolat dari genus Aspergillus dan 7 isolat dari genus Penicillium. 2. Dari 15 isolat tersebut, 5 (lima) isolat terbukti positif menghasilkan statin yaitu A. terreus, A. flavus, Aspergillus sp., P.requefortii dan P.citrinum. 3. Komposisi medium yang paling optimum dalam menunjang pertumbuhan biomassa adalah komposisi medium KD+C (tapioka 15%). Pertumbuhan biomassa miselium tertinggi selama 10 hari dalam medium KD+C (tapioka 15%) dicapai oleh A. terreus (isolat B) sebesar 1219,7 mg/L dan P. requefortii (isolat I) sebesar 601,8 mg/L. 4. Produksi lovastatin tertinggi dicapai isolat B (A. terreus) dengan kadar 54,2 mg/L dalam waktu 10 hari pada medium KD+C (tapioka 15%) dan N (kedelai 5%), suhu ruang dan pengocokan 125 rpm.
Sebagai saran, untuk penelitian terkait disarankan untuk dilakukan dalam skala yang lebih besar sehingga dapat dilakukan suatu analisis ekonomi sebagai persiapan aspek komersialisasi.
31
VII DAFTAR PUSTAKA Alexopoulus C.J. & Mims C.W. 1979.”Introductory Micology”. New York: John Wiley & Son’s. Alberts, A.W. 1989. Lovastatin. Cardiovascular Drug Reviews VII. Hal.89 – 109. Chang, S.T., Buswell, J.A.,1996. Mushroom Nutriceuticals.World Journal of Microbiology and Biotechnology 12:473 Cimerman, N., Cimerman, A., Fiedrich, J. 1973. Screening Fungi for the Production of Mevinolin. FEMS Microbiology . Lett.111:203 -206. Endo, A.,Kuroda, M. dan Tsujita, Y. 1976. New Inhibitors of Cholesterogenesis Produced by Penicillum. Journal of Antibiotics. Tokyo Griffin, D. H.1994. Fungal Physiology.2nd Edition. Wiley Liss Inc. San Fransisco, AS Gritter, R. J., Bobbit, J. M. 1985. Introduction to Chromatography. Holden Day Inc. San Fransisco AS Ingold, C.T.1975. The Biology Of Fungy. Hutchinson Co Publisher. London Kyslika, R., Kren, V. 1993. Determination of lovastatin (mevinolin) and mevalonic acid in fermentation liquids. J. Chromatography 630 : 415-417. Lopez, J.L.Casas.S. 2002. Production of lovastatin by Aspergillus terreus. Elsevier Inc. AS Novak, N. Gerdin, S. Berovic, M. 1997. Increased lovastatin formation by Aspergillus terreus . Biotechnology Lett. 19:947-949. Omura, S. 1992. The Search for Bioactive Compounds from Microorganisms. SpringerVerlag Inc. New York, AS Saimee, S.M.2003. Screening of lovastatin production by filamentous fungi. Biomed Journal 7(1):29-33. Shindia, A. A. 1997. Mevinolin production by some fungi. Folia Microbiology 42:4777-480. Widayanti, S. (2003). Keberadaan senyawa lovastatin dalam kultur bawah permukaan Pleurotus ostreatus, Skripsi Sarjana Biologi, FMIPA-ITB. Witzum, J. L. 1996. Drugs used in the treatment of hyperlipoproteinemias. McGraw Hill. AS. hal . 885-887
32
