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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS

PROCEDIMIENTO BÁSICOS TABLA 3: PROCEDIMIENTOS BÁSICOS EN MICOLOGÍA Toma de muestras Examen directo (ED) Cultivo Identificación

TOMA DE MUESTRA Reviste una importancia primordial. El diagnóstico va a depender en buena medida de la calidad de la muestra que va a procesarse. No debemos olvidar, pues, algunos condicionantes básicos a la hora de la recogida de muestras en las dermatomicosis. a) Asegurarse de que no haya habido tratamiento antifúngico previo, sobre todo sistémico. En tal caso, demorar la toma de muestras hasta pasadas al menos dos semanas. b) Recoger una cantidad suficiente de material patológico. c) Utilizar el instrumental adecuado al tipo de muestra de que se trate. El instrumental para la toma de muestras comprende pequeños utensilios adecuados para practicar el raspado de las lesiones y obtener las escamas y fragmentos de pelo que van a estudiarse. A tal fin, pueden emplearse hojas de bisturí, curettes, plumillas metálicas o incluso los bordes de los portaobjetos. Nosotros adoptamos hace tiempo el uso de los vacinostilos, que ofrecen múltiples ventajas: son estériles, desechables, fáciles de obtener, de coste muy bajo, y su forma permite emplearlos tanto para raspar en superficie mediante su extremo plano, como para obtener material del lecho ungueal en las onicomicosis por medio de su extremo punzante. En las micosis ungueales, sin embargo, preferimos tomar la muestra con la pequeña cucharilla del “cuchillo de Le Cron”, un instrumento de uso habitual en odontología y fácil de encontrar en las tiendas o proveedores de instrumental médico (Fig. 1).

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS Comenzamos por limpiar bien la zona sospechosa con alcohol o lavado jabonoso, eliminando restos de pomadas, suciedad y restos epidérmicos. Nos aseguramos de que no ha existido tratamiento antifúngico en los últimos días, en caso afirmativo lo suspendemos y retrasamos la toma una o dos semanas. Diferenciamos una serie de detalles para la toma micológica según la realicemos, en una pitiriasis versicolor, una tiña, una candidosis o en micosis ungueales (Tabla 4).

TABLA 4: TOMA DE MUESTRAS 1. PITIRIASIS VERSICOLOR 2. TIÑAS Tiñas del pelo Tiñas de la piel lampiña 3. CANDIDOSIS Candidosis cutáneas Candidosis mucosas 4. MICOSIS UNGUEALES

PITIRIASIS VERSICOLOR Lo más sencillo, es el raspado de las escamas furfuráceas y finas de las lesiones con el borde de un portaobjeto, depositando el producto del raspado en otro portaobjeto que colocamos en posición horizontal bajo la lesión. Existen otros procedimientos entre los que destacamos la utilización de la cinta adhesiva (“cello”, cinta adhesiva), con la que presionamos fuertemente sobre la lesión y a continuación pegamos en un portaobjeto. La maniobra también puede llevarse a cabo con un portaobjeto en el que hemos depositado previamente unas gotas de cola de contacto de cianocrilato. Esperando unos segundos, la aplicamos sobre una plaquita de la enfermedad, al endurecerse la cola y retirar el portaobjeto arrancamos la superficie escamosa, lista para teñir (Figs. 2, 3).

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA

Fig. 2. Pitiriasis toma con fixo

Fig. 3. Pitiriasis toma con portaobjeto

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS TIÑAS Sin olvidar las premisas indicadas al principio, describiremos la toma según sea la tiña de piel lampiña o glabra (sin cabellos), de zonas pilosas o bien de uñas. Toma de muestra de piel lampiña (Tinea corporis, tinea faciei, tinea cruris, tinea manuum y tinea pedis). Raspamos en la periferia de la lesión, ya que la zona central de la misma, redondeada casi siempre, está escasamente parasitada. Lo realizamos con un bisturí, vacinoestilo, escalpelo o con el borde de un portaobjeto. Recogemos en otro portaobjeto las escamas, las guardamos entre dos portaobjetos e identificamos con sumo cuidado la toma. Si la lesión presenta vesículas (tinea pedis, tiñas inflamatorias) rompemos las mismas (Figs. 4-6).

Fig. 4. Tiña toma con portaobjeto

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Fig. 5. Tiña toma con portaobjeto

Fig. 6. Tiña toma vacionestilo

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS Toma de muestra de zonas pilosas (Tinea capitis, tinea barbae). Lo más sencillo es raspar enérgicamente el borde de la lesión con lo que obtenemos no sólo escamas sino también pelos parasitados. Es útil el uso de pinzas de depilación para obtener pelos parasitados, que no ofrecen resistencia a la tracción, y que nos permiten el examen directo del parasitismo piloso en el cultivo. En las tiñas inflamatorias de estas localizaciones o bien, obtenemos los pelos como hemos indicado, o simplemente tomamos el material purulento con un hisopo bacteriológico estéril. En ocasiones, se lleva a cabo con cepillos de plástico estériles o bien, con un fragmento cuadrado de moqueta estéril, con los que frotamos la zona sospechosa, y a continuación se inoculan directamente las placas de Petri con el medio. No hay que olvidar que los cabellos o pelos de la barba sanos (ofrecen resistencia a la tracción) obtenidos con pinzas no están parasitados y por tanto, no son útiles para el estudio. La luz de Wood puede ser útil en algunas tiñas causadas por Microsporum, al permitir encontrar más fácilmente los pelos parasitados por su fluorescencia verdosa (Figs. 7.1,7.2, 8).

Fig. 7.1. Tiña toma zona pilosa

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Fig. 7.2. Tiña toma zona pilosa

Fig. 8. Tiña barba, toma pelo

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS El material así obtenido en las diversas formas se puede depositar directamente en el portaobjetos para el examen directo, en una placa de Petri estéril o en un sobre estéril. Llamamos de nuevo la atención en el cuidado de la identificación correcta de la muestra. Para terminar, recordar que en las lesiones inflamatorias, las costras, secreciones y pelos, especialmente los centrales, no suelen contener hongos, por ello es necesario eliminarlos previamente. Y siempre es positivo realizar la toma en los bordes de la lesión. CANDIDOSIS Diferenciamos según la localización mucosa, cutánea o ungueal. En las mucosas (boca, genitales, ano) la recogida se puede realizar con hisopo bacteriológico de algodón estéril, o con esponjas de poliester humedecidas previamente en medios de cultivo líquido. En orofaringe, asimismo, podemos realizar enjuagues con suero fisiológico, que se siembra sobre una placa de Petri con medio sólido y permite hacer recuento del número de colonias. En las lesiones de piel la recogida la realizamos con el método descrito en las tiñas, pero señalando que es más aconsejable el fondo del pliegue para la toma. Si la lesión es húmeda utilizamos un hisopo estéril (Figs. 9,10).

Fig. 9. Candidosis, toma bucal

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Fig. 10. Candidosis, toma en pliegues

En la toma de las candidosis es preciso, no olvidar las condiciones previas pero, especialmente, tener en cuenta las condiciones de traslado al laboratorio, para evitar la desecación del material, ya que las candidas no sobreviven más de 24 horas en una toma seca. Por ello, es aconsejable utilizar hisopos con dispositivo de humedad, y siempre intentar que la muestra llegue inmediatamente al laboratorio. MICOSIS UNGUEALES Los resultados del estudio micológico van a depender en gran medida de la técnica utilizada para la obtención de muestras. En las uñas hay que extremar el cuidado, dado el alto porcentaje de falsos negativos. La técnica consiste en recortar con tijeras (alicates de podólogo para uñas de pies), procurando llegar hasta la frontera entre la invasión fúngica y la zona de uña sana, lugar donde los hongos son viables y por tanto cultivables. A continuación raspar con el extremo romo (cucharilla) del cuchillo de Le Cron. También se puede realizar con escarpelos, curetas o con el mismo ángulo del portaobjeto. Asimismo, puede utilizarse una fresa rotatoria (pequeño taladro) o incluso una biopsia “punch” ungueal. El material así obtenido se deposita entre dos portaobjetos, en una placa de Petri estéril o en un sobre estéril. Repartimos el material obtenido, para examen directo y para los diversos cultivos. Es aconsejable realizar, antes de la toma, un lavado enérgico y asegurarnos que no ha existido tratamiento antifúngico previo. Con estos cuidados hemos mejorado muy positivamente los porcentajes de falsos negativos (Figs. 11,12).

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Fig. 11. Toma ungueal. Primero recortar

Fig. 12. Toma ungueal. Segundo raspar

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EXAMEN DIRECTO (KOH) Se denomina Examen Directo (ED) a la técnica diagnóstica cuya finalidad estriba en detectar u observar el agente infeccioso directamente en la muestra patológica, con ayuda de unos reactivos o colorantes simples. A diferencia de la histopatología, la muestra destinada al examen directo no necesita fijación ni preparación previa, y la observación puede llevarse a cabo de forma inmediata. No participamos en la afirmación de facilidad o sencillez con que se refieren la mayoría de los autores al ED, porque necesita un aprendizaje detallado; pero si compartimos la idea de que es una técnica muy práctica para identificar con rapidez la presencia de dermatofitos, levaduras y mohos. La técnica es bien simple. Sobre el material que habíamos destinado a ello en un portaobjetos se deposita una gota del reactivo elegido, habitualmente una solución de potasa, y se cubre con un cubreobjetos. Es indispensable calentar ligeramente la preparación a la llama de un mechero, y presionar suave y repetidamente con el mango del asa sobre el cubre, hasta que la muestra aparezca completamente disociada, es decir, hasta que el material queratinoso se haya disuelto bajo la acción de la potasa. Acto seguido, se procede a la observación al microscopio, utilizando primero los aumentos bajos (10X) y acto seguido, los altos (20X y 40X). El objetivo de inmersión no suele ser necesario. El Examen Directo es una técnica sumamente rentable. La dificultad radica fundamentalmente en la aparición de una serie de artefactos, que luego citaremos, que se asemejan en gran medida las verdaderas hifas del micelio. La solución a esta dificultad radica en hacer una adecuada preparación, la utilización del disgregante-colorante más idóneo y la práctica diaria de la observación microscópica, o sea de la experiencia personal. Describimos la técnica detalladamente (Figs. 13.1-13.4,14).

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA 1. Preparación: Depositamos una porción del material obtenido (escamas, pelos, uñas) en un portaobjetos, añadimos unas gotas del disgregante-colorante, se mezcla, se fragmenta mecánicamente (con la ayuda de un punzón), se coloca un cubreobjetos y se flamea suavemente evitando la ebullición. Si la muestra se obtuvo mediante torunda o escobillón puede practicarse el examen directo frotando un poco del mismo en un portaobjeto. A continuación aplicamos: Disgregante-colorante: Sustancias que facilitan la observación de filamentos, produciendo una separación de las escamas y fragmentos de uñas. La más usada es el hidróxido de potasio (KOH) en agua destilada al 20-40%. La capacidad disgregante de la potasa, para cabellos y uñas, aumenta si le añadimos dimetilsulfósido. Si le agregamos glicerina, aumenta la duración de la preparación hasta 48 horas, ya que evita la formación de cristales de potasa. La observación se facilita añadiendo un colorante a la potasa. El más usado era la tinta azul negra Parker Superchrome. En la actualidad, se está utilizando la solución de SwartzLamkins, que da resultados similares a la antigua fórmula. Existen numerosos colorantes como el clorazol, lactofenol, técnicas de fluorescencia, pero no se utilizan de rutina en el laboratorio. 2. Observación: Se realiza mediante microscopio óptico, mejor con condensador de contraste de fase, ya que los elementos fúngicos son refringentes. Comenzamos con un pequeño aumento (x 10), para tener una visión panorámica de las escamas y buscar mejor la posible presencia de filamentos. Para confirmarlo, pasamos a un mayor aumento (x 40). 3. Interpretación: Comentaremos los dermatofitos, las levaduras, los mohos y terminaremos describiendo algunos artefactos. Los dermatofitos aparecen de forma diferente según estudiemos las escamas o el pelo. En el ED de las escamas se presentan como filamentos hialinos, de bordes nítidos y regulares, de paredes paralelas, septados (este hecho es muy importante) y con la presencia de ramificaciones, que toman color azul. No tienen relación con los bordes celulares, a los que atraviesan sin orden determinado. A menudo, estas hifas se muestran fragmentadas en artroconidias cuboidales. Este patrón diagnostíca genéricamente a los dermatofitos, pero no podemos precisar la especie (Figs. 15.1,15.2,16.1,16.2).

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Fig. 15.1. ED KOH x 100

Fig. 15.2. ED KOH x 400

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Fig. 16.1. ED KOH

Fig. 16.2. Examen directo. KOH – tinta Parker. X1000

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS Si estudiamos el pelo tenemos que precisar que la "utilización" de la queratina de los pelos por los dermatofitos curiosamente varía según sea "in vivo" o "in vitro". "In vivo" presenta dos patrones fundamentales, bien sea el parasitismo interior al pelo (endotrix) o exterior al mismo (ectotrix). Este proceder sí nos permite identificar la especie. El patrón endotrix tiene a su vez dos tipos: Uno, artrosporado, que es el genuino endotrix, que presenta todo el interior del pelo repleto de cadenas de conidios, artrosporados, de 3-4 nm de diámetro (T. tonsurans, T. violaceum). Otro tipo de endotrix es el fávico, dentro del pelo encontramos filamentos dispuestos a lo largo del mismo, ondulados unos, ramificados otros. Son típicas las burbujas de aire (T. schoenleinii) (Fig. 17).

Fig. 17. Examen directo de Tinea capitos. Parasitismo endotrix. KOH-tinta. X400

El patrón ectotrix presenta así mismo tres modelos: Uno, tipo en mosaico, en el que las esporas son pequeñas (2-3 nm diámetro), redondas, formando una densa y compacta vaina alrededor del pelo, que no se dispersa con la potasa. En el interior del pelo hay filamentos (M. canis, M. audouinii). Otro, tipo microide, presenta también pequeñas esporas (2-4 nm de diámetro), pero dispuestas de forma irregular en el exterior del pelo, ya que son fácilmente dispersables con la KOH, filamentos en el interior (T. mentagrophytes, T. rubrum, M. gypseum). Y un tercero, tipo megasporado, con esporas de mayor tamaño (4-6 nm), en el exterior del pelo, dispuestas en grumos o racimos y otras sueltas. Filamentos intrapilares (T. verrucosum) (Fig. 18).

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Fig. 18. Examen directo de Tinea capitis. Parasitismo ectotrix en mosaico. KOH-tinta.X400

TABLA 5: EL PARASITISMO PILOSO DE LOS DERMATOFITOS Artrosporado

T. violaceum T. tonsurans

Fávica

T. schoenleinii

En mosaico

M. canis M. audouinii

Microide

T. mentagrophytes M. gypseum

Megasporado

T. verrucosum

ENDOTRIX

ECTOTRIX

"In vitro" algunos dermatofitos atacan el pelo de una determinada forma, lo que constituye una prueba de diagnóstico diferencial, como es la producción de órganos perforantes, que se utiliza para diferenciar el T. mentagrophytes del T. rubrum, el primero produce órganos perforantes y el segundo no (Fig. 19).

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA Las levaduras suelen presentarse bajo el aspecto de blastoconidias en gemación y pseudomicelio. Su observación puede plantear mayores dificultades que la de los dermatofitos. En el caso de la pitiriasis versicolor, la imagen es patognomónica, estando constituida por una mezcla de blastosporos singulares provistos de un nítido collarete de gemación y pseudomicelio corto y grueso. Todos estos elementos se tiñen con gran rapidez mediante la tinta Parker azul permanente o el colorante de Swartz-Lamkins (Fig. 20).

Fig. 20. Examen directo de queilitis candidiasica. Blastoconidias y pseudomicelio. KOH-tinta X1000

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA Las gotas de grasa pueden tomarse por células de levadura, aunque su esfericidad, su distinta tonalidad y su variado tamaño ayudan a distinguirlas. La imagen conocida como “hongo en mosaico” (“mosaic fungi”) puede resultar muy engañosa, ya que estas estructuras, constituidas por cristales de colesterol y de otras substancias, se parecen mucho a las artroconidias de los dermatofitos, de las que pueden diferenciarse por su disposición a lo largo del borde de las células epidérmicas y por su forma irregular. Finalmente, de modo ocasional, pueden observarse en los exámenes directos macroconidias, que en ningún caso corresponden a dermatofitos, siendo la mayoría de las veces, testimonio de la presencia de un moho contaminante u oportunista. Para terminar, haremos unos breves comentarios: el examen directo es interesante, rápido, aproximativo, pero repetimos, no permite distinguir las diversas especies de dermatofitos. Es fácil cuando es positivo, es difícil cuando es negativo. El examen directo no excluye el cultivo, que es imprescindible para el diagnóstico de las diferentes especies de dermatofitos. SIEMBRA/CULTIVO El Examen Directo puede permitirnos detectar la presencia del agente causal en la muestra patológica, pero nada o casi nada nos dice de la identidad de ese agente, salvo muy limitadas excepciones (Malassezia globosa en la pitiriasis versicolor y Scopulariopsis brevicaulis en ciertas onicomicosis). El diagnóstico definitivo de una micosis requiere un segundo paso: el aislamiento e identificación del hongo responsable de la misma, mediante cultivo. El cultivo se lleva a cabo depositando una cantidad de la muestra patológica en la superficie de uno o varios medios de cultivo, dispuestos en recipientes que pueden ser de dos tipos: tubos y placas. Nosotros preferimos las placas de Petri, de 9-10 cm de diámetro, porque permiten una mejor disposición del inóculo y facilitan la observación y el estudio de las colonias. Tienen la desventaja de ofrecer más riesgo a la contaminación, pero este problema puede limitarse con la adición de ciertos antibióticos y practicando las siembras cuidadosamente (trabajando siempre junto a la llama del mechero) (Figs. 22.1-22.3, 23.1, 23.2, 24.1, 24.2).

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA Las placas o tubos, una vez inoculados, se incuban a temperatura ambiente o, mejor, en estufa a 25ºC. Esta es la temperatura ideal para el desarrollo de la mayoría de los agentes causantes de dermatomicosis, aunque algunos de ellos, como T. verrucosum o las levaduras del género Candida crecen con mayor rapidez a 37ºC. El cultivo de las levaduras lipofílicas del género Malassezia, que requieren temperaturas de 30ºC a 32ºC, no se lleva a cabo de forma rutinaria, por no ser indispensables para el diagnóstico de la pitiriasis versicolor, pero constituye un prometedor campo de investigación en otras dermatosis y es posible que se generalice en el futuro. Cuando la incubación se realiza en estufa, a temperaturas por encima de los 30ºC, o cuando se prolonga más allá de las dos semanas, es aconsejable disponer las placas en bolsas de plástico cerradas, para evitar la desecación del medio. IDENTIFICACIÓN Los cultivos deben examinarse periódicamente a lo largo del tiempo de incubación, y no deben desecharse como negativos hasta transcurridas tres semanas a partir de su siembra. Debe vigilarse la aparición de cualquier tipo de colonia, levaduriforme o filamentosa, teniendo en cuenta que los hongos contaminantes que pudieran estar presentes en el material patológico, o introducirse en el medio al practicar las siembras o durante la incubación, crecen con más rapidez que los patógenos, pudiendo fácilmente cubrirlos o ahogarlos en pocos días, impidiéndonos su aislamiento (Fig. 25). Las colonias sospechosas, una vez detectadas, deben replicarse en medios frescos si se observa contaminación. Una vez se estima alcanzada la madurez de la colonia, se procede a anotar sus características macromorfológicas, esto es su color, textura (granulosa, pulverulenta, anteada, vellosa, algodonosa o glabra), superficie (plana, elevada, plegada, crateriforme) y color del reverso. Con la práctica, el aspecto macroscópico de las colonias a menudo basta para orientar la identificación de la especie, al menos en los hongos filamentosos, de modo similar a lo que ocurre con las plantas. Esta observación debe completarse siempre con el estudio de los caracteres micromorfológicos, lo que llevaremos a cabo tomando una muestra de la superficie de la colonia por medio de un papel adhesivo transparente. Éste, se coloca acto seguido sobre un portaobjeto en el que previamente habremos depositado una gota de la solución colorante, habitualmente azul de lactofenol. La observación se realiza al microscopio, generalmente, con aumentos bajos (de x 100 a x 400) y debe centrarse en la morfología de las estructuras reproductoras, en especial, los distintos tipos de conidias. En aquellos casos en que la micromorfología no permita alcanzar una identificación definitiva de la especie aislada, se recurre a ciertas técnicas auxiliares (tests fisiológicos o bioquímicos) que se detallan en los capítulos correspondientes. Esto reza sobre todo para las levaduras, cuya morfología es mucho más pobre que la de los hongos filamentosos.

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA Examen macroscópico En primer lugar observaremos si la colonia tiene aspecto levaduriforme (como gota de queso fundido) (Fig. 25 A) o filamentoso (vulgarmente moho). En el segundo supuesto anotar si el crecimiento es muy rápido (mohos) (Fig. 25 C) o lento (dermatofitos) (Fig. 25 B). En general, para los dermatofitos, es solo orientativo, pero con experiencia podremos sospechar las especies mas frecuentes en nuestro medio: E. floccosum, M. canis, M. gypseum, T. mentagrophytes, T. rubrum, T. violaceum, T. verrucosum... Realizamos la observación con el siguiente orden: 1. Color: Tanto del anverso (micelio aéreo): blanco, crema, amarillo, anaranjado, rojo, violeta...; como del reverso (micelio vegetativo): amarillento casi siempre, puede ser rojo, marrón, violeta o sin color. 2. Superficie: Pulverulenta, vellosa, aterciopelada, algodonosa... 3. Relieve: Plano, crateriforme, elevado cupuliforme, radiado... 4. Borde: Neto, con vellosidades... 5. Velocidad de crecimiento: Similar para casi todos (+/- 10 mm/semana), lento (1 mm/semana): T. verrucosum, T. violaceum.

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS Debemos tener en cuenta que los caracteres morfológicos de los dermatofitos varían según las condiciones del cultivo, tipo de medios, temperatura y en especial para el color, la luz que reciba la colonia. Por esto, la experiencia personal para las cepas del propio laboratorio es tan valiosa. Algunos medios naturales (harina de maíz, patata, etc.) estimulan la producción de pigmentos y otros medios artificiales como el DTM, específico para los dermatofitos, colorean el medio. Examen microscópico Se lleva a cabo de una manera sencilla obteniendo un fragmento del cultivo, con espátula o con un trozo de cinta adhesiva, de la zona central de la colonia y montándolo entre porta y cubre, con unas gotas de azul de lactofenol, permite observar al microscopio óptico (x 100, x 400) los caracteres microscópicos del micelio fúngico. 1. Micelio tabicado, hifas septadas, ramificadas, formando una maraña. Observamos la periferia de la misma para encontrar conidias (macro y microconidias) o bien algunas estructuras morfológicamante interesantes para el diagnóstico micológico. 2. Conidias: Microconidias, son unicelulares, pequeñas, redondas, ovales o piriformes. Presentan dos tipos de disposición: a lo largo de la hifa (tipo acladium) en forma de racimos (cruz de Lorena). Unas veces son sesiles, otras nacen sobre cortos esterigmas. Las macroconidias, son multicelulares, grandes, con tabiques transversales. Existen diversos tipos: fusiformes, en raquetas y en lápiz o maza. A su vez pueden tener las paredes gruesas o finas, ser lisas o rugosas, aisladas o en racimos. 3. Estructuras morfológicas especiales: Casi todas variantes de tamaño y forma de las hifas septadas: Espirales: hifa fina enrollada en espiral. Hifa en raqueta: ensanchamiento oval de una porción media o terminal de una hifa. Cuerpos nodulares: filamentos engrosados formando nudos sobre si mismo. Candelabro fávico: división terminal de una hifa en dos o tres puntas engrosadas. Hifa peptinada: pequeñas prolongaciones en un solo lado de la hifa, que adopta así forma de peine. Hifa retrógrada: hifa que nace en sentido contrario, en ángulo agudo, al resto de las ramificaciones.

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ESTRATEGIA DE LABORATORIO Recordemos que la estrategia consiste en dividir el desarrollo del aprendizaje en tres niveles. El primer nivel va destinado a todos los dermatólogos, aunque no tengan conocimientos de laboratorio ni de micología. El segundo nivel, está dirigido a aquellos dermatólogos que poseen algunos medios, conocimientos y el interés científico de investigar los hongos. El tercer nivel, va destinado a aquellos investigadores que trabajan con los hongos como protagonistas.

TABLA 6: ESTRATEGIA EN PITIRIASIS VERSICOLOR PRIMER NIVEL Examen con luz de Wood SEGUNDO NIVEL Examen directo con cinta adhesiva TERCER NIVEL Identificación especies Malassezia

ESTRATEGIA DE LABORATORIO DE LA PITIRIASIS VERSICOLOR PRIMER NIVEL Objetivo: Confirmar el diagnóstico clínico de pitiriasis versicolor. Método: Aplicación de luz de Wood. Observamos una fluorescencia amarilla, verde amarillenta. Aconsejamos oscuridad absoluta en la habitación de exploración, cerciorándose de que no existe tratamiento previo de la lesión con cremas o ungüentos porque imposibilitan la fluorescencia. Podemos observar lesiones no perceptibles a simple vista. Lo único que necesitamos es una lámpara de Wood, de fácil adquisición en la actualidad. Este proceder, aunque no sea propiamente de laboratorio, lo incluimos por su simplicidad y para complementar el signo clínico de la uñada de Besnier. Es útil tanto para confirmar el diagnóstico como para valorar la eficacia del tratamiento (Figs. 26.1, 26.2).

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Fig. 26.1. Pitiriasis 1º nivel luz de Wood

Fig. 26.2. Pitiriasis 1º nivel luz de Wood 2

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS SEGUNDO NIVEL Objetivo: Demostrar la presencia de Malassezia en unas lesiones clínicas sospechosas de pitiriasis versicolor. Método: Examen directo de las escamas cutáneas obtenidas con cinta adhesiva. Presionamos con un fragmento de cinta adhesiva sobre una lesión típica, lo separamos de la piel y lo pegamos sobre un portaobjeto. Depositamos una gota de KOH al 20-30% (con tinta azul Parker o bien la solución de Swartz-Lamkins) en un cubreobjeto y observamos al microscopio. Encontraremos racimos de células levaduriformes, redondeadas, de 4-8 micras, con gemaciones y junto a estos racimos, podemos hallar filamentos cortos, tabicados e incluso ramificados. Esta imagen es patognomónica. Sólo necesitamos cinta adhesiva, un portaobjeto y cubreobjetos, una gota de potasa y un sencillo microscopio (Figs. 27,28).

Fig. 27. Pitiriasis 2º nivel ED X400

Fig. 28. Pitiriasis 2º nivel ED X1000

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ESTRATEGIA DE LABORATORIO DE LAS TIÑAS O DERMATOFICIAS TABLA 7: ESTRATEGIA EN LAS TIÑAS PRIMER NIVEL Cultivo en medio DTM/DTA SEGUNDO NIVEL Identificación genérica de dermatofitos TERCER NIVEL Identificación de las especies de dermatofitos frecuentes

PRIMER NIVEL Objetivo: Demostrar si en una lesión dermatológica sospechosa, existen o no dermatofitos, con una finalidad epidemiológica y fundamentalmente, terapéutica. Método: Siembra en medio DTM/DTA. Ya se ha comentado la toma de muestras para las tiñas, repasemos ahora la siembra: el material que hemos obtenido, (escamas, pelos, fragmentos de uñas) lo depositamos, con la ayuda de un asa de platino estéril, en la superficie del medio (tanto en tubo, como en placas de Petri) en varios puntos. La siembra en este primer nivel la realizamos en medio DTM o DTA y, a la semana, el medio (que es de color amarillo miel) cambia el color a rojizo, sólo y exclusivamente si el hongo que crece es un dermatofito. Sin embargo, el medio no cambia de color si el hongo que crece no es un dermatofito. No necesitamos microscopio, sólo como indicamos en la siembra: un mechero de alcohol, un asa de platino y un tubo/placa con el medio DTM o DTA (Fig. 31).

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Fig. 31.Tiñas 1º nivel cultivo en DTM

SEGUNDO NIVEL Objetivo: Identificación genérica y rápida de dermatofitos. Método: La realizamos mediante el examen directo y el parasitismo piloso. Incluimos en este nivel el Examen Directo, y no lo hicimos en el primer nivel porque necesita microscopio y, además, porque, después de muchos años realizándolo, seguimos pensando que representa cierta dificultad y precisa cierto aprendizaje y "oficio" de laboratorio. Con el examen directo incluimos el estudio del parasitismo piloso. Ambos representan algo muy interesante y rápido en el diagnóstico de los dermatofitos como origen fúngico de una dermatosis. Examen directo (ED) Recordamos y resumimos que los dermatofitos aparecen de forma diferente según estudiemos las escamas o el pelo. En el ED de las escamas se presentan como filamentos hialinos, de bordes nítidos y regulares, de paredes paralelas, tabicados (este hecho es muy importante) y con la presencia de ramificaciones, que toman color azul. No tienen relación con los bordes celulares, a los que atraviesan sin orden determinado. Este patrón diagnostíca genéricamente a los dermatofitos, pero no podemos precisar la especie (Fig. 15.1, 15.2, 16.1).

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Fig. 32. E. floccosum colonia

Fig. 33. E. floccosum micro

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA Punta fina: M. canis (Figs. 34, 35). Presentan macroconidias grandes, de gruesas paredes, fusiformes, espinulosas, con sus extremos puntiagudos, en ocasiones el distal en forma curva. Normalmente, son muy numerosas. Tienen escasas microconidias, a veces abundantes. Las colonias son de color amarillo anaranjado, más acentuado en la periferia, de aspecto plumoso. Es un hongo zoofílico.

Fig. 34. M. canis colonia

Fig. 35. M. canis micro

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS Punta redondeada: M. gypseum (Figs. 36, 37). Presenta conidias grandes, gruesas paredes, espinuladas, muy parecidas hasta aquí a las del M. canis, pero las puntas son redondeadas, menos agudas; asimismo, son menos numerosas. Puede haber microconidias en racimos. La colonia es muy típica, granulosa, de color canela, que la diferencia a simple vista de la de M. canis. M. gypseum es un dermatofito geofílico.

Fig. 36. M. gypseum colonia

Fig. 37. M. gypseum micro

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Fig. 39. T. mentagrophytes micro

La presencia de hifas espirales es casi exclusiva de esta especie. Si lo unimos a los caracteres de la colonia: blanco ocre, pulverulento para la variedad mentagrophytes (zoofílico) y blanco algodonoso para la variedad interdigitale (antropofílico), y a la presencia de numerosas microconidias, redondeadas dispuestas en racimos, no tendremos dudas en el diagnóstico. En caso de duda sembramos en medio Agar-Urea, en el que T. mentagrophytes cambia el color del medio (vira a rosa intenso/rojizo), mientras que T. rubrum no. Otra prueba diferencial sería la formación de órganos perforantes, que es positivo para T. mentagrophytes y negativa para T. rubrum. Si no existen hifas espirales: Siembra en medio “potato dextrosa agar” (PDA): - Positivo (Colonia roja): T. rubrum (Figs. 40, 41).

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Fig. 40. T. rubrum. Colonia: izquierda en MGS, derecha en PDA

Fig. 41. T. rubrum micro

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS Las colonias de T. rubrum presentan en este medio una coloración rojiza, vinosa, especialmente en el reverso. Sus típicas microconidias en lágrimas, están dispersas o dispuestas a ambos lados de las hifas (según el tipo "acladium"). Hay escasas macroconidias en forma de lápiz, finas, lisas y multiseptadas, muy semejantes a las que produce T. mentagrophytes. Repasamos los caracteres diferenciales de T. rubrum, que en cierto modo ya han aparecido: No hay formas espirales. Ureasa negativo. Formación de órganos perforantes negativa y especialmente positiva en medio potato dextrosa agar (PDA), con colonias de intenso y notorio color rojo-vino, especialmente en el anverso. Es un dermatofito antropofílico, con preferencia por la invasión de las uñas. - Negativo (colonia blanca): T. tonsurans (Figs. 42, 43).

Fig. 42. T. tonsurans colonia

Fig. 43. T. tonsurans. Microconidias. X400

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA Visto así, el diagnóstico deT. tonsurans es por exclusión y con dificultades. Nos ayuda en su diagnóstico el hecho de conocer que la toma micológica procede de una tiña de la cabeza, de tipo “puntos negros”. No presenta hifas espirales. Las colonias son blancas en medio PDA y forman microconidias redondeadas, que nacen con una base aplanada, muchas veces en forma de clavo. También, es típica la presencia de clamidosporos terminales e intercalares. Es un hongo antropofílico y en la actualidad en España, apenas se aísla. De todas formas, dadas estas dificultades, es necesario en ocasiones recurrir al crecimiento en medios agar-trichophyton, especialmente los números 1, 2, 3 y 4, donde crece abundantemente en los nº 3 y 4, pero no en los dos primeros (no tienen tiamina), mientras que T. mentagrophytes y T. rubrum crecen bien en los cuatro medios. SI NO EXISTEN NI MACRO NI MICROCONIDIAS Tres especies pertenecientes al género Trichophyton, todas de crecimiento lento, no producen conidias normalmente, sólo observamos hifas y algunos elementos que describimos a continuación. Colonia violácea: T. violaceum (Figs. 44, 45). Presenta colonias de crecimiento muy lento, pequeñas, de consistencia cérea, con un color violeta oscuro (vino tinto), aterciopeladas, en el reverso se ve muy bien su coloración. El crecimiento mejora en medios con tiamina (Agar trichophyton nº 3 y 4). No produce conidias. Sólo se observa una maraña de hifas de color violeta, con algunos engrosamientos intercalados, a veces en cadenas. Es un dermatofito antropofílico. Hifas toruloides: T. verrucosum (Figs. 46, 47). Lo que primero llama la atención es el lento crecimiento de la colonia (30 días), crecimiento que mejora si se incuba a 37ºC y en medios con tiamina (Agar trichophyton 3 y 4). También ciertos caracteres microscópico de la colonia: como ser crateriforme, de color ocre-amarillento a grisáceo, superficie lisa y plegada, y suele penetrar en el agar. Microscópicamente sólo aparecen hifas, no conidias. En las hifas se intercalan cadenas de clamidosporos, de diferentes tamaños, dando lugar a las típicas hifas toruloides. Es un hongo zoofílico.

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Fig. 44. T. violaceum colonia

Fig. 45. T. violaceum micro

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Fig. 46. T. verrucosum colonia

Fig. 47. T. verrucosum micro

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ESTRATEGIA EN EL LABORATORIO DE LAS CANDIDOSIS TABLA 10: ESTRATEGIA EN LAS CANDIDOSIS PRIMER NIVEL Diagnóstico del género Candida SEGUNDO NIVEL Diagnósitico de la especie C. albicans TERCER NIVEL Diagnóstico de todas las especies de género Candida

PRIMER NIVEL Objetivo: Diagnóstico del género Candida. Demostrar si en una afectación cutánea, mucosa o ungueal, si existen o no levaduras pertenecientes al género Candida, con finalidad terapéutica. Método: Siembra en medio glucosado de Sabouraud (MGS). Recordamos las precauciones que deben tenerse en cuenta al realizar la toma micológica. Se efectúa con hisopo (torunda) bacteriológico estéril en lesiones mucosas y lesiones cutáneas húmedas, y en piel y uñas, como indicamos en el capítulo de toma micológica. Hay que prestar atención a la escasa supervivencia de las candidas en la muestra por lo que es aconsejable la siembra inmediata. La siembra la realizamos en medio glucosado de Sabouraud (MGS) con cloramfenicol, mediante el hisopo que utilizamos en la toma o con un asa de platino. Incubamos a temperatura ambiente y a las 48 horas obtenemos unas colonias blancas o blanco-marfil, cremosas, brillantes, como gotas de queso fundido. Son colonias tan típicas, que son diagnósticas por si mismas. Lo único que necesitamos es un hisopo estéril, un mechero de alcohol y un tubo o placa con medio glucosado de Sabouraud. En 24-48 horas podemos hacer el diagnóstico con una simple visualización del tubo o placa (Fig. 48). SEGUNDO NIVEL Objetivo: Identificación de la especie C. albicans, imputada como causa de la mayoría de las candidosis. Método: Partimos de la colonia que nos ha crecido en el primer nivel, sobre medio de Sabouraud y realizamos una resiembra en un medio específico.

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Fig. 48 Candida, primer nivel, colonia blanca en MGS

Para simplificar esta identificación se han propuesto numerosos medios, que tienen en común una rápida identificación de C. albicans, basándose en el aspecto macroscópico y color que adquieren sus colonias. Usamos el medio ChromAgar Candida, en el que la colonia de C. albicans se tiñe de color verdoso, facilitando el diagnóstico rápido y fácil. Sólo necesitamos un asa de platino, un mechero de alcohol y una placa de medio CROMAgar candida (Fig. 49).

Fig. 49 Candida, segundo nivel, colonia verde a la izquierda (C. albicans) en medio ChromAgar

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PATRONES DE DIAGNÓSTICO DE LOS HONGOS MÁS FRECUENTES: DERMATOFITOS (FIGS. 54-73)

Fig. 54. E. floccosum. SGA. 2 semanas

Fig. 55. E. floccosum. Macroconidias. ALFX 1000

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Fig. 56. M. canis. SGA. Colonias de 2 semanas

Fig. 57. M. canis. Macroconidias (detalle). ALF X1000

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Fig. 58. M. gypseum. SGA. Colonias de 10 días

Fig. 59. M. gypseum. Macroconidias. ALF X1000

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Fig. 60. T. mentagrophytes var. mentagrophytes. SGA. Colonias de 3 semanas

Fig. 61. T. mentagrophytes var. interdigitale. SGA. Colonias de 3 semanas

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Fig. 62. T. mentagrophytes var. mentagrophytes. Macro y microconidias. ALF X400

Fig. 63 T. mentagrophytes var. mentagrophytes. Microconidias y espirales. ALF X400

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Fig. 64. T. rubrum. SGA. Colonias de 3 semanas

Fig. 65. T. rubrum. PDA. Colonias de 3 semanas

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Fig. 66. T. rubrum. Microconidias. ALF X400

Fig. 67. T. rubrum var raubistchekii. Macro y microconidias. ALF X1000

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Fig. 68. T. tonsurans var sulphureum. SGA. 3 semanas

Fig. 69.T. tonsurans. Microconidias. ALF X40

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Fig. 70 T. violaceum. SGA. 3 semanas

Fig. 71. T. violaceum. ALF X1000

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Fig. 72. T. verrucosum. SGA. 3 semanas

Fig. 73. T. verrucosum. Hifas toruloides. ALF X1000

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS LEVADURAS (FIGS. 74-79)

Fig. 74. Candida albicans. SGA

Fig. 75. Candida albicans. Clamidosporos. CMA X200

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Fig. 76. Candida parapsilosis. SGA

Fig. 77. Candida parapsilosis. CMA X100

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Fig. 78. Malassezia globosa. mDixon

Fig. 79. Malassezia globosa en cultivo. ALF X1000

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA MOHOS (FIGS. 80-91)

Fig. 80. Scopulariopsis brevicaulis. SGA

Fig. 81. S. brevicaulis. ALF X1000

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Fig. 82. Alternaria alternata. SGA

Fig. 83. Alternaria alternata. Dyctiosporos. ALF X1000

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Fig. 86. A. flavus. SGA

Fig. 87. A. flavus-oryzae. ALF X1000

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Fig. 88 A. terreus. SGA

Fig. 89. A. terreus. ALF X1000

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Fig. 90. Fusarium sp. SGA

Fig. 91. Fusarium sp. Macro y microconidias. ALF X1000

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ATLAS MICO TOMO IIIdefi.qxp:MaquetaciÛn 1

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