MODUL PRAKTIKUM
BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN
Disusun Oleh : Tim Dosen PS ITP - THP - FTP UB
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012
TIM PENYUSUN MODUL PRAKTIKUM BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN 1. Dr. Teti Estiasih, STP. MP. 2. Novita Wijayanti, STP. 3. Indria Purwantiningrum, STP. MSi. 4. Wenny Bekti S. STP. MFood.St. 5. Mochamad Nurcholis, STP.MP. 6. Feronika Heppy S, STP. MP. 7. Jaya Mahar Maligan, STP. MP. 8. Irma Sarita R, STP. MP. MSc.
1
PRAKTIKUM BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN A. DESKRIPSI Mata kuliah ini mencakup prinsip analisis kimia berbagai komponen bahan pangan seperti karbohidrat, lemak, protein, kadar air dan abu. Praktikum ini juga mencakup
prinsip
penggunaan
alat
instrumen
diantaranya
spektrofotometer,
elektroforesis dan kromatografi kolom. B. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM Setelah menyelesaikan praktikum Biokimia dan Analisis Pangan, mahasiswa mampu mengetahui masing-masing prinsip dasar analisis kimia berbagai komponen pangan. Selain itu, mahasiswa mampu menerapkan prinsip analisis untuk menentukan kandungan kimia bahan pangan hasil pertanian. C. MATERI PRAKTIKUM 1. Analisis kadar air (metode oven, oven vakum, distilasi) 2. Analisis kadar abu dan mineral (pengabuan kering, penentuan kadar kalsium, AAS) 3. Analisis karbohidrat (penentuan kadar total gula, kadar pati, kadar serat) 4. Ekstraksi dan uji aktivitas enzim amilase 5. Uji kualitatif dan kuantitatif karbohidrat (Molisch, Barfoed, Benedict, Yodium, hidrolisis pati non-enzimatis) 6. Analisis lemak (penentuan kadar lemak, asam lemak bebas dan bilangan peroksida) 7. Ekstraksi dan uji aktivitas enzim lipase 8. Kadar protein (penentuan kadar protein kasar, kadar protein Biuret, kadar N-amino, uji ninhidrin) 9. Uji aktivitas enzim proteolitik 10. Analisis kadar vitamin c 11. Kromatografi (kolom adsorpsi) 12. Elektroforesis D. PENILAIAN HASIL BELAJAR 1. Pre-lab 2. Aktivitas Praktikum 3. Laporan 4. Pre Test / Post Test 5. UAP
2
PERATURAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN 1. Mahasiswa yang boleh mengikuti praktikum Biokimia dan Analisis Pangan ialah mereka yang telah mengisi KRS untuk mata praktikum Biokimia dan Analisis Pangan. 2. Setiap peserta harus hadir tepat pada waktu yang telah ditentukan. Apabila peserta terlambat lebih dari 10 menit, maka tidak diperkenankan untuk mengikuti praktikum. 3. Sebelum
mengikuti
praktikum,
peserta
diharuskan
mengisi
pre-test
dan
mempersiapkan diagram alir dari prosedur analisis yang akan dikerjakan. 4. Selama mengikuti praktikum, peserta harus memakai jas praktikum. 5. Setiap kelompok praktikum diwajibkan mentabulasi data hasil pengamatan untuk dibahas oleh masing-masing peserta di dalam lembar kerja praktikum. 6. Setiap peserta praktikum harus mengembalikan alat-alat yang telah dipakai dalam keadaan bersih dan kering serta mengembalikan ke tempat semula. 7. Setiap peserta harus mengembalikan bahan-bahan kimia yang diambil ke tempat semula dengan tutup botol jangan sampai tertukar. 8. Setiap mahasiswa harus bertanggung jawab terhadap kebersihan laboratorium sesudah praktikum selesai. 9. Bagi mahasiswa yang memecahkan/merusak alat harus mengganti alat atau memperbaiki kerusakan tersebut.
3
BAB I ANALISIS KADAR AIR Pendahuluan Penentuan kadar air merupakan analisis penting selama pengolahan dan pengujian produk pangan. Kadar komponen dalam produk pangan berhubungan dengan kadar air dan kadar air tersebut mempengaruhi kualitas dan stabilitas produk selama penyimpanan. Sebagai contoh, kecepatan pencoklatan sayuran kering dan daya serap air tepung telur meningkat dengan meningkatnya kadar air. Penentuan kadar air penting dilakukan di industri pangan misal dalam penentuan kesetimbangan massa dan penyusutan.
Kadar air optimum untuk suatu proses
pengolahan seringkali harus diketahui seperti penepungan biji-bijian, pengulenan adonan sampai konsistensi optimum, dan produksi roti dengan tekstur dan remah yang baik. Kadar air dalam bahan pangan sangat bervariasi mulai dari susu yang mengandung air 87-91%, keju dengan kadar air 40-75%, sampai susu bubuk dengan kadar air 4%. Penentuan kadar air yang cepat dan akurat dalam bahan dan produk pangan yang bervariasi sifat fisik dan kimianya masih terus dikembangkan. penentuan kadar air telah tersedia.
Berbagai metode
Masing-masing metode tersebut mempunyai
kelebihan dan kekurangan. Penetapan metode yang sesuai untuk menentukan kadar air suatu bahan atau produk pangan harus mempertimbangkan sifat fisikokimia bahan atau produk pangan tersebut. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar analisis kadar air 2. Mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode 3. Dapat menentukan metode penentuan kadar air yang tepat sesuai sifat bahan 4. Mengetahui keuntungan dan kekurangan masing-masing metode A.
METODE OVEN
Pendahuluan Prosedur untuk menentukan kadar air dalam bahan pangan, biasanya dengan menggunakan metode pengeringan panas. Bahan dipanaskan pada kondisi tertentu dan kehilangan berat bahan diukur sebagai kadar air. Metode pengeringan ini sangat
4
sederhana relative cepat dan dapat digunakan untuk jumlah sampel yang banyak. Prosedur pengeringan yang ideal untuk menentukan kadar air yaitu kehilangan berat seharusnya merupakan hasil dari penguapan air secara cepat saja. Namun prakteknya, pemanasan zat organik juga menyebabkan penguapan zat lain dan gas yang terbentuk oleh dekomposisi panas dari zat organik Keakuratan penentuan kadar air dipengaruhi oleh suhu pemanasan, suhu dan kelembaban relatif cawan, kelembaban relatif dan pergerakan udara di dalam cawan, kevakuman dalam cawan, ketebalan dan ukuran sampel, konstruksi oven pengering dan posisi sampel di dalam oven. Permukaan bahan menjadi kering dan laju difusi uap air dalam zat yang dikeringkan juga mempengaruhi hasil analisa. Alat 1. Oven dengan kisaran suhu 100-102oC 2. Cawan (stainless steel, aluminium, nikel atau porselen). Gunakan cawan lengkap dengan tutupnya. Untuk bahan-bahan yang memberikan efek korosif, sebaiknya tidak menggunakan cawan logam. 3. Desikator yang berisi bahan pengering (fosfor pentoksida kering, kalsium klorida atau butiran halus silica gel). 4. Penjepit cawan 5. Timbangan analitik Prosedur Kerja 1. Timbang contoh yang telah berupa serbuk atau bahan yang telah dihaluskan sebanyak 1-2 g dalam botol timbang yang telah diketahui beratnya. 2. Kemudian keringkan dalam oven pada suhu 100-105(C selama 3-5 jam tergantung bahannya. Kemudian dalam eksikator dan ditimbang. Panaskan lagi dalam oven 30 menit, didinginkan dalam eksikator dan ditimbang, perlakuan ini diulangi sampai tercapai berat konstan (selisih penimbangan berturut-turut kurang dari 0.2 mg). 3. Pengurangan berat merupakan banyaknya air dalam bahan. B.
METODE OVEN VAKUM
Pendahuluan Penentuan kadar air dengan pengeringan dalam oven vakum akan menghasilkan kadar air yang lebih tepat. Biasanya air dapat dihilangkan dengan relatif mudah tetapi untuk menghilangkan 1 % yang terakhir sangat sulit. Sisa air tersebut dapat dihilangkan
5
dengan lebih mudah, lebih cepat dan perubahan minimal dari komponen organik dengan menggunakan pengeringan vakum daripada menggunakan metode lain. Selama pengeringan, tidak ada air yang di dalam oven vakum, karena tekanan uap air di dalam oven akan keluar dari oven, kecuali di dalam sampel yang kadar airnya tinggi. Efisiensi dari oven dibatasi oleh laju difusi air ke dalam pompa. Alat 1. Oven vakum lengkap dengan pompa vakum, gelas pengaman pompa, dan botol pengering udara yang berisi silika gel. 2. Cawan logam atau porselen 3. Desikator 4. Penjepit cawan 5. Timbangan analitik Prosedur Kerja 1. Keringkan cawan dan tutupnya dalam oven dengan suhu 105oC selama 30 menit, dinginkan dalam desikator dan timbang. 2. Timbang dengan cepat lebih kurang 5 gram sampel yang telah dihomogenkan dalam cawan 3. Letakkan cawan beserta isinya dan tutup cawan dalam oven vakum. Panaskan pada suhu 70oC dengan vakum dipertahankan sekitar 25 mmHg. Lakukan pengeringan selama 6 jam. Selama pengeringan berjalan biarkan udara mengalir melalui botol pengering gas yang berisi H2SO4 dengan kecepatan rendah (sekitar 2 gelembung per detik). 4. Tutup aliran vakum ke pompa (pompa jangan ditutup dulu sebelum tekanan vakum dalam gelas pengaman dihilangkan, untuk mencegah agar oli tidak terhisap ke dalam gelas) 5. Naikkan aliran udara kering yang melewati H2SO4 untuk menghilangkan tekanan vakum dalam oven. 6. Tutup cawan, dinginkan dalam desikator selama 15 menit dan timbang. 7. Lakukan pemanasan kembali sampai diperoleh berat yang tetap. Perhitungan
Berat sampel (gram) = W1 Berat sampel setelah dikeringkan (gram) = W2 Kehilangan berat (gram) = W3 Persen kadar air (dry basis) = W3 / W2 x 100 Persen kadar air (wet basis) = W3 / W1 x 100 Total padatan (%) = W2 / W1 x 100
6
C.
METODE DISTILASI
Pendahuluan Prinsip penentuan kadar air dengan distilasi adalah menguapkan air dengan menggunakan zat kimia yang mempunyai titik didih lebih tinggi sebagai pembawa, tidak dapat bercampur dengan air dan memiliki berat jenis lebih rendah daripada air. Zat kimia yang dapat digunakan antara lain: toluen, benzena dan xylene. Distilasi dengan memanaskan cairan sangat efektif dalam tranfer panas, penghilangan air lebih cepat, kerusakan oksidasi lebih rendah. Metode distilasi dapat meminimalkan dekomposisi zat organik daripada pengeringan biasa. Bahan 1. n-amil alkohol : silena = 1 : 2 2. Toluena 3. Silena Alat 1. Pemanas listrik 2. Tabung penerima Bidwell Sterling 3. Kondensor tipe cold finger 4. Labu didih Prosedur Kerja 1. Persiapan alat distilasi dan pereaksi 2. Persiapan labu didih atau erlenmeyer yang sudah dikeringkan lebih dulu dalam oven dengan suhu 105oC 3. Timbang sampel secukupnya sedemikian rupa, sehingga air yang terkandung di dalamnya sekitar 3-4 gram 4. Masukkan sampel ke dalam labu didih atau erlenmeyer yang telah dikeringkan dan tambahkan 60-100 ml pereaksi (toluena atau lainnya) 5. Panaskan campuran tersebut dengan pemanas listrik (jangan menggunakan api) dan refluks perlahan-lahan dengan suhu rendah, selama 45 menit, dan teruskan dalam keadaan panas yang tinggi selama 1-1.5 jam. 6. Baca volume air yang terdistilasi.
7
7. Perhitungan Jumlah sampel (gram) = W Volume air yang terdistilasi (ml) = V Persen kadar air = V/W x 100
8
BAB II ANALISIS ABU DAN KADAR MINERAL A. ABU Pendahuluan Abu merupakan residu anorganik dari pembakaran zat organik. Jumlah dan komposisi abu dalam bahan pangan tergantung dari pembakaran bahan pangan dan metode pengabuan. Penentuan kadar abu dapat digunakan untuk tujuan: menentukan baik tidaknya suatu proses pengolahan, mengetahui jenis bahan yang digunakan dan sebagai parameter nilai gizi bahan pangan. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar analisis kadar abu 2. Mengetahui perbedaan prinsip masing-masing metode 3. Mengaplikasikan metode pengabuan berdasarkan sifat bahan Alat 1. Cawan pengabuan 2. Tanur pengabuan 3. Penjepit cawan 4. Timbangan analitik Prosedur Kerja 1.
Siapkan cawan pengabuan, kemudian bakar dalam tanur, dinginkan dalam desikator dan timbang.
2.
Sampel yang ada dalam cawan dibakar pada pembakar gas sampai asapnya habis.
3.
Timbang sebanyak 3-5 gram sampel dalam cawan tersebut, kemudian letakkan dalam tanur pengabuan, bakar sampai didapat abu berwarna abu-abu atau sampai beratnya tetap. Pengabuan dilakukan dalam dua tahap: pertama pada suhu sekitar 400oC dan kedua pada suhu 550oC.
4.
Dinginkanlah dalam desikator, kemudian timbang. Perhitungan : Berat abu (g) % Abu = _________________ x 100 Berat sampel (g)
9
B. PENGABUAN KERING Pendahuluan Penentuan kadar abu dengan mengoksidasi zat organik pada suhu tinggi yaitu sekitar 500-600oC dan kemudian melakukan penimbangan zat tertinggal setelah proses pembakaran tersebut. Pengabuan yang lama akan menghasilkan abu yang bebas karbon, residu yang lembab, dikeringkan dan dipanaskan kembali hingga menjadi abu yang putih keabuabuan. Bahan yang mempunyai kadar air tinggi sebelum pengabuan harus dikeringkan lebih dahulu. Bahan yang mempunyai kandungan zat yang mudah menguap dan berlemak banyak, pengabuan dilakukan pada suhu rendah sampai asam hilang dan kemudian suhunya ditingkatkan sesuai dengan yang dikehendaki. Bahan 1. HNO3 pekat 2. HCl encer (1+1) 3. Kertas saring Alat 1. Cawan 2. Timbangan analitik 3. Burner 4. Tanur 5. Gelas arloji 6. Waterbath 7. Labu takar 100 ml 8. Corong Prosedur kerja 1. Timbang sampel sebanyak yang dikehendaki di dalam cawan silika yang sudah diketahui beratnya dengan tepat. 2. Mula-mula panaskan sampel pada pembakar burner dengan api sedang untuk menguapkan sebanyak mungkin zat organik yang ada (sampai sampel tak berasap lagi). 3. Pindahkan cawan ke dalam tanur dan panaskan pada suhu 300oC sampai semua karbon berwarna keabuan, kemudian naikkan suhu sampai 420oC. Pada umumnya
10
pengabuan dilakukan pada 450oC, waktu yang dibutuhkan tergantung pada sifat bahan, biasanya 5-7 jam (apabila dikehendaki penggunaan suhu rendah misalnya 420oC dengan waktu semalam). 4. Jika diperkirakan belum semua karbon teroksidasi ambil cawan dari dalam tanur dan dinginkan. Tambahkan 1-2 ml HNO3 pekat, uapkan sampai kering dan masukkan lagi ke dalam tanur sampai pengabuan dianggap selesai. 5. Ambil cawan dari tanur, dinginkan dan jika diperlukan catat berat abu yang dihasilkan. 6. Tutup cawan dengan gelas arloji, perlahan-lahan tambahkan 40-50 ml HCl encer dengan pertolongan pipet. Gelas arloji berfungsi untuk mencegah cipratan campuran. 7. Panaskan cawan di atas waterbath selama 30 menit, angkat tutupnya dan bilas. Lanjutkan pemanasan selama 30 menit unyuk mendehidrasi silika. 8. Tambahkan 10 ml HCl dan air untuk melarutkan garam-garam. 9. Saring dengan menggunakan kertas saring, masukkan filtrat ke dalam labu takar 100 ml. 10. Bilas residu yang tertinggal dalam cawan 1-2 kali mengunakan HCl kemudian cuci residu yang tertinggal dalam kertas saring menggunakan HCl juga. 11. Encerkan sampai tanda tera dengan menggunakan akuades. 12. Kembalikan kertas saring ke dalam cawan, bakar dan abukan dalam tanur pada suhu 450oC selama 1 jam, kemudian dinginkan dan timbang. Perlakuan ini dapat memberi perkiraan kandungan silika di dalam sampel. C. PENENTUAN KADAR KALSIUM Pendahuluan Mineral yang terdapat pada bahan pangan ada dua macam yaitu garam organic dan anorganik. Selain kedua garam tersebut, mineral berbentuk senyawa komplek yang bersifat organic. Penentuan mineral dalam bentuk asli sangat sulit karena biasanya dilakukan dengan menentukan sisa-sisa pembakaran garam mineral yang diketahui sebagai pengabuan. Penentuan mineral dalam bahan pangan dapat dibedakan menjadi dua tahap yaitu pertama penetuan abu (larut dan tidak larut), kedua penentuan komponen mineral. Untuk tahap kedua, banyak cara yang dapat dipakai antara lain secara kimia dan secara spektrofotometri.
11
Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar penentuan kadar mineral kalsium Bahan 1. Amonium oksalat jenuh 2. Indikator merah metil larutkan 0.5 gram merah metil dalam 100 ml alkohol 95 %. 3. Asam asetat encer (1+4) 4. Asam sulfat encer (1+4), masukkan dengan perlahan asam sulfat pekat ke dalam air sambil diaduk, dinginkan dan encerkan hingga volume tertentu. 5. Amonium hidroksida encer (1+4). 6. KMnO4 0.1 N 7. KMnO4 0.1 N, encerkan 10 ml KMnO4 0.1 N sampai 100 ml dengan aquades (1 ml = 0.2 mg Ca) dan buat jika akan segera digunakan. 8. Akuades 9. Kertas saring Alat 1. Glass ware 2. Kompor listrik 3. Corong 4. Buret 5. pH-meter Prosedur Kerja 1. Pipet 20-100 ml larutan abu hasil pengabuan kering, masukkan ke dalam gelas piala 250 ml. Jika perlu tambahkan 25-50 ml akuades. 2. Tambahkan 10 ml larutan amonium oksalat jenuh dan 2 tetes indikator metil merah. 3. Buat larutan menjadi sedikit basa dengan menambah amonia encer kemudian buat larutan menjadi sedikit asam dengan manambah beberapa tetes asam asetat sampai warna larutan merah muda (pH 5.0) 4. Panaskan larutan sampai mendidih, kemudian diamkan selama minimum 4 jam atau semalam pada suhu kamar 5. Saring dengan menggunakan kertas saring dan bilas dengan akuades sampai filtrat bebas oksalat (jika digunakan HCl dalam pembuatan larutan abu, filtrat hasil saringan terakhir harus bebas Cl dengan mengujinya menggunakan AgNO3).
12
6. Lubangi ujung kertas saring menggunakan batang gelas. Bilas dan pindahkan endapan dengan H2SO4 encer panas ke dalam gelas piala bekas tempat mengendapkan kalsium. Kemudian bilas satu kali lagi dengan air panas. 7. Selagi panas (70-80oC) titrasi dengan larutan KMnO4 0.01 N sampai larutan berwarna merah jambu permanen yang pertama. 8. Masukkan kertas saring dan lanjutkan titrasi sampai tercapai warna merah jambu yang kedua. Perhitungan: hasil titrasi x 0.2 x total volume larutan abu x 100 mg Ca /100g sample = __________________________________________________ vol. lar. abu yang digunakan x berat sampel yang diabukan
Jika normalitas KMnO4 tidak sama dengan 0.01 N maka: hasil titrasi x N KMnO4 x 20 x total volume larutan abu x 100 mg Ca /100 g sampel = ____________________________________________________ vol. lar. abu yang digunakan x berat sampel yang diabukan
D. Penentuan Mineral dengan Spektroskopi Serapa Atom (AAS/Atomic Absorption Spectroscopy) Pendahuluan Spektrometri
merupakan
suatu
metode
analisis
kuantitatif
yang
pengukurannya berdasarkan banyaknya radiasi yang dihasilkan atau yang diserap oleh spesi atom atau molekul analit. Salah satu bagian dari spektrometri ialah Spektrometri Serapan Atom (SSA/AAS), merupakan metode analisis unsur secara kuantitatif yang pengukurannya berdasarkan penyerapan cahaya dengan panjang gelombang tertentu oleh atom logam dalam keadaan bebas. Apabila cahaya dengan panjang gelombang tertentu dilewatkan pada suatu sel yang mengandung atom-atom bebas yang bersangkutan maka sebagian cahaya tersebut akan diserap dan intensitas penyerapan akan berbanding lurus dengan banyaknya atom bebas logam yang berada dalam sel. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dan penggunaan pengabuan basah 2. Dapat melakukan analisis mineral dengan AAS
13
Alat 1. Labu ukur 2. Pipet ukur 3. Spektroskopi serapan atom Bahan 1. Larutan standar Ca 2. HNO3 3. H2SO4 Prosedur Kerja a. Pengabuan Basah 1.
Timbang sejumlah sampel yang mengandung 5-10 g padatan dan masukkan ke dalam labu Kjedahl
2.
Tambah 10 ml H2SO4 dan 10 ml (atau lebih) HNO3 dan beberapa buah batu didih
3.
Panaskan perlahan-lahan sampai larutan berwarna gelap, hindari pembentukan buih yang berlebihan
4.
Tambah 1-2 ml HNO3 dan pemanasan selama 5-10 menit sampai larutan tidak gelap lagi
5.
Lanjutkan penambahan HNO3 dan pemanasan selama 5-10 menit sampai larutan tidak gelap lagi (semua zat organik telah teroksidasi) kemudian dinginkan
6.
Tambahkan 10 ml akuades (larutan akan menjadi tidak berwarna atau menjadi kuning muda jika mengandung Fe) dan panaskan sampai berasap
7.
Diamkan larutan sampai dingin kembali kemudian tambahkan 5 ml akuades, didihkan sampai berasap
8.
Dinginkan dan encerkan sampai volume 100 ml
b. Pembuatan Kurva Standar 1. Larutan standar Ca 1000 ppm diambil 5 ml dan dimasukkan labu takar 50 ml 2. Tepatkan volume menjadi 50 ml dengan akuades, dan laruta ini menjadi larutan induk untuk larutan standar Ca 14
3. Ambil dari larutan yang sudah diencerkan sebanyak 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 ml, 4. Tepatkan volume masing-masing menjadi 100 ml c. Analisis Dengan Spektroskopi Serapan Atom 1. Buka kran gas ( Flame:Acetylene pressure=0.09 MPa; nitrous=0.35MPa. Furnace: Argon=0.35MPa) 2. Nyalakan kompresor (Auto Setting)(tidak digunakan pada Furnace) 3. Nyalakan auto sampler ASC6100 4. Nyalakan AA-6300 5. Nyalakan computer. Tunggu sampai tampilan Windows muncul 6. Klik dua kali pada icon wizard 7. Pilih Operation lalu double klik gambar AAS 8. Pada Wizard Selection, klik OK 9. Pada Element Selection, klik Select Element. 10. Isikan unsur yang akan di periksa. 11. Klik Flame/Furnace 12. Pada Lamp Mode pilih mode lampu sesuai dengan kebutuhan. 13. Klik OK 14. Klik Calibration Curve set up 15. Klik Conc., Unit dipilih sesuai satuan standar yang dibuat 16. Pada Number of lines masukkan jumlah deret standar 17. Masukkan konsentrasi standar pada tabel ( juga nomor posisi standar pada ASC). 18. Klik OK. 19. Klik Sample group setup 20. Isikan Actual Conc.Unit 22. Isikan jumlah sample ( juga nomor posisi ssampel pada ASC) 22. Pada Sample ID masukkan nama sampel 23. Masukkan angka 1 untuk Weight Factor, Volume Factor, Dilution Factor, dan Coefficien
Factor
kecuali
parameter
tersebut
dibutuhkan
dalam
perhitungan sampel 24. Klik OK 25. Klik Next 15
26. Klik Connect/send parameter 27. Tunggu sampai inisialisasi selesai (yang ditandai dengan semua parameter berwarna hijau) 28. Check list semua, kemudian klik OK 29. Klik Next 30. Klik pada Lamp On 31. Klik Line Search 32. Tunggu sampai Line Search/Beam Balance OK. 26. Klik Close 27. Klik Next 39. Klik Finish 42 Lalu tekan Ignite pada instrument sampai keluar api(untuk Flame saja)/untuk Furnace nyalakan Cooling Water 43. Pada tabel pengukuran, klik autozero untuk mengenolkan, klik blank untuk mengukur blangko, klik start untuk mengukur standar atau sampel. 44. Pengukuran akan berjalan otomatis untuk auto sampler (ASC) Menyimpan Data 1. KLik File 2. Klik Save As 3. Ketikkan nama file pada File Nama 4. Klik Save Mencetak Data 1. Klik File 2. Pilih Print Table Data 3. Klik lambang unsur pada Selection Schedule 4. Klik OK > OK Mematikan Alat 1. Klik Instrument 2. Klik Connect > OK (tanda check list hilang) 3. Klik Files 4. Klik Exit 16
BAB III ANALISIS KARBOHIDRAT A.
TOTAL GULA METODE ANTHRONE
Pendahuluan Karbohidrat dalam asam sulfat akan dihidrolisis menjadi monosakarida dan selanjutnya monosakarida mengalami dehidrasi oleh asam sulfat menjadi furfural atau hidroksil metil furfural. Selanjutnya senyawa furfural ini dengan anthrone (9, 10 dihidro9-oxoanthracene) membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar analisis total gula 2. Menentukan secara kuantitatif kadar gula dalam produk makanan Bahan 1. Pereaksi anthrone 0.1% dalam asam sulfat pekat. Dibuat hanya pada waktu hari akan digunakan, tidak stabil, hanya tahan 1 hari. 2. Larutan glukosa standar 0.2 mg/ml. Larutan 200 mg glukosa dalam 100 ml akuades. Ambil 10 ml encerkan menjadi 100 ml (1 ml = 0.2 mg glukosa) Alat 4. Pipet 1 ml, 5 ml. 5. Tabung reaksi 6. Kelereng/corong kecil 7. Waterbath 100oC 8. Spektrofotometer dan kuvet Persiapan Sampel Sampel cair 1. Timbang sampel sebanyak 29 gram dan dilarutkan dalam 500 ml akuades. 2. Pindahkan ke gelas beker, tambahkan 200-300 ml air dan 2 gram CaCO3, dididihkan selama 30 menit. Kemudian didinginkan. 3. Masukkan ke dalam labu takar 500 ml dan masukkan 3-5 ml Pb-asetat. Tambahkan akuades hingga tanda tera. 4. Saring dengan kertas saring whatman no.2
17
5. Tambahkan 1 gram Natrium oksalat untuk mengendapkan Pb-asetat, kemudian disaring lagi 6. Filtrat siap dipakai. Sampel padat 1. Timbang sampel sebanyak 20-30 gram, ditambahkan alkohol 80% dengan perbandingan 1:1 atau 1:2. 2. Hancurkan dengan waring blender 3. Pindahkan ke dalam gelas beker 4. Saring sampel dan cuci padatannya dengan alkohol 80%. 5. Ukur pH dan jika asam tambahkan CaCO3. Panaskan dalam penangas air 100oC selama 30 menit. 6. Sampel disaring lagi. 7. Filtrat dipanaskan suhu 85oC untuk menghilangkan alkohol. 8. Jika masih ada endapan, disaring lagi.Tambahkan Pb asetat dan kemudian Pb dihilangkan dengan penambahan Na-oksalat seperti persiapan sampel cair. 9. Filtrat siap digunakan Prosedur Kerja Pembuatan kurva standar 1. Pipet ke dalam tabung reaksi 0 (blanko), 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 dan 1.0 ml larutan glukosa standar. Tambahkan air sampai total volume masing-masing tabung reaksi 1.0 ml. 2. Tambahkan dengan cepat 5 ml pereaksi Anthron ke dalam masing-masing tabung reaksi. 3. Tutup tabung reaksi campur merata. 4. Tempatkan dalam waterbath 100oC selama 12 menit (rendam dalam air mendidih). 5. Dinginkan dengan cepat menggunakan air mengalir. 6. Pindahkan ke dalam kuvet, baca absorbansnya pada 630 nm. 7. Buat kurva hubungan antara absorbans dengan mg glukosa.
Penetapan sampel 1. Masukkan 1 ml sampel (dari persiapan sampel) ke dalam tabung reaksi 2. Selanjutnya lakukan seperti pada pembuatan kurva standar . 3. Tentukan konsentrasi total gula dalam sample.
18
B.
KADAR PATI METODE HIDROLISIS ASAM
Pendahuluan Metode ini digunakan untuk menetapkan kadar pati dalam bahan pangan yang diketahui hanya mengandung pati dan dekstrin.
Prinsipnya adalah pati dihidrolisis
dengan asam, kemudian gula hasil hidrolisis diukur. Dengan demikian kadar pati dalam sampel dapat diketahui. Bahan 1. Eter 2. Alkohol 10% dan 80% 3. HCl 25 % (berat jenis 1.125) 4. NaOH 45 % 5. Kertas saring 6. Akuades Alat 1. Timbangan analitik 2. Erlenmeyer 250 ml 3. Gelas piala 250 ml 4. Pendingin balik 5. Penangas air 6. Gelas ukur 50 ml 7. Pengaduk 8. Labu takar 500 ml 9. Corong 10. Blender Prosedur Kerja 1. Timbang 2-5 g contoh yang berupa bahan padat yang telah dihaluskan atau bahan cair dalam gelas piala 250 ml, tambahkan 50 ml etanol 80% dan aduk selama 1 jam. Suspensi disaring dengan kertas saring dan dicuci dengan aquades sampai volume filtrat 250 ml. Filtrat ini mengandung karbohidrat yang larut dan dibuang. 2. Untuk bahan yang mengandung lemak, maka pati yang terdapat sebagai residu pada kertas saring dicuci 5 kali dengan 10 ml eter, biarkan eter menguap dari residu, kemudian cuci lagi dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut.
19
3. Residu dipindahkan secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam erlenmeyer dengan pencucian 200 ml aquades dan tambahkan 20 ml HCl 25% (bj 1.125), tutup dengan pendingin balik dan panaskan di atas penangas air mendidih selama 2,5 jam. 4. Setelah dingin netralkan dengan larutan NaOH 45% dan encerkan sampai volume 500 ml, kemudian saring. Tentukan kadar gula yang dinyatakan sebagai glukosa dari filtrat yang diperoleh. Penentuan glukosa seperti pada penentuan total gula. Berat glukosa dikalikan 0.9 merupakan berat pati. C.
SERAT KASAR
Pendahuluan Serat kasar merupakan residu dari bahan makanan atau produk pertanian setelah diberi perlakuan asam dan alkali mendidih, yang terdiri dari selulosa dan sedikit lignin dan pentosan. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar analisis serat kasar 2. Menerapkan prosedur yang benar sesuai dengan sifat bahannya Bahan 1. Antifoam agent 2. Asbes 3. Larutan H2SO4 (1.25 g H2SO4 pekat / 100ml = 0.255N H2SO4) 4. NaOH (1.25 g NaOH/100ml = 0.313 N NaOH) 5. Larutan K2SO4 10% 6. Alkohol 95% Alat 1. Penggiling
9. Krus gooch
2. Timbang analitik
10. Kertas Lakmus
3. Soxhlet
11. Desikator
4. Erlenmeyer 600 ml 5. Pendingin balik 6. Kertas saring 7. Spatula 8. Oven 110oC
20
Prosedur Kerja 1. Haluskan bahan sehingga dapat melalui ayakan diameter 1 mm dan campurlah baikbaik. Kalau bahan tak dapat dihalusksan, hancurkan sebaik mungkin. 2. Timbang 2 g bahan kering dan ekstraksi lemaknya dengan soxhlet. Kalau bahan sedikit mengandung lemak, misalnya sayur-sayuran gunakan 10 g bahan; tidak perlu dikeringkan dan diekstraksi lemaknya, 3. Pindahkan bahan ke dalam erlenmeyer 600 ml. Kalau ada tambahkan 0,5 g asbes yang telah dipijarkan dan 3 tetes zat anti buih (antifoam agent). 4. Tambahkan 200 ml larutan H2SO4 mendidih (125 g H2SO4 pekat/100 ml = 0.255 N H2SO4) dan tutuplah dengan pendidngin balik, didihkan selama 30 menit dengan kadangkala digoyang-goyangkan. 5. Saring suspensi melalui kertas saring dan residu yang tertinggal dalam erlenmeyer dicuci dengan aquades mendidih. Cucilah residu dalam kertas saring sampai air cucian tidak bersifat asam lagi (uji dengan kertas lakmus). 6. Pindahkan secara kuantitatif residu dari kertas saring ke dalam erlenmeyer kembali dengan spatula dan sisanya dicuci dengan larutan NaOH mendidih (1.25g NaOH/100ml = 0,313 N NaOH) sebanyak 200 ml sampai semua residu masuk ke dalam erlenmeyer. Dididihkan dengan pendingin balik sambil kadangkala digoyanggoyangkan selama 30 menit. 7. Saringlah melalui kertas saring kering yang diketahui beratnya atau krus Gooch yang telah dipijarkan dan diketahui beratnya, sambil dicuci dengan larutan K2SO4 10%. Cuci lagi residu dengan aquades mendidih dan kemudian dengan lebih kurang 15 ml alkohol 95%. 8. Keringkan kertas saring atau krus dengan isinya pada 110C sampai berat konstant (1-2 jam), dinginkan dalam desikator dan timbang. Jangan lupa mengurangkan berat asbes, kalau digunakan. Berat residu = berat serat kasar
21
BAB IV EKSTRAKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE A. EKSTRAKSI ENZIM AMILASE Pendahuluan Amilase bekerja pada pati, glikogen dan turunan polisakarida dengan menghidrolisa ikatan - 1,4 – dan / - 1,6 - glikosidik . Enzim amilase dapat diisolasi dari jaringan tanaman, hewan dan sel mikrobia. Enzim amilase banyak terdapat pada kecambah biji gandum, sorgum, kedele, kacang hijau, beras dan biji-bijian yang lain. Enzim amilase dalam kecambah termasuk enzim endoselluler sehingga untuk mengekstraksi terlebih dahulu harus menghancurkan biji kecambah. Amilase dikelompokkan menjadi 3 golongan enzim yaitu: 1. - Amilase yang memecah pati secara acak dari tengah atau dari bagian dalam molekul, karena itu disebut endoamilase. 2. - Amilase, yang menghidrolisa unit-unit glukosa dari ujung molekul pati, karenanya disebut eksoamilase. 3. Glukoamilase, yang dapat memisahkan glukosa dari terminal gula non-pereduksi substrat pati. Alfa Amilase ( -1,4 glukan glukanohidrolase, E.C. 3.2.1.1) Alfa - Amilase terdapat pada jaringan tanaman, hewan mamalia dan mikrobia. Alfa Amilase murni dapat diperoleh dari berbagai sumber misalnya malt (barley), ludah manusia dan pancreas. Dapat juga diisolasi dari Aspergillus oryzae dan Basillus subtilis. Pemecahan oleh - amilase pada amilosa terdiri atas 2 tahap: a.
Tahap degradasi cepat yang menghasilkan maltotriosa dan maltosa Pemecahan tahap pertama ini ditandai dengan penurunan viskositas yang cepat dan hilangnya kemampuan pewarnaan iodin terhadap amilosa
b.
Tahap degradasi lambat terhadap oligosakarida menghasilkan glukosa dan maltosa Pemecahan
oleh - amilase terhadap amilopektin akan menghasilkan
dekstrin BM (berat molekul) rendah dan maltosa dan oligosakarida yang lebih besar. Setiap molekul -amilase mengandung satu ion Ca++ yang perannya tidak langsung untuk pembentukan enzim substrat, tetapi mendukung molekul enzim membentuk keadaan optimum guna aktivitas dan stabilitasnya.
22
Beta– Amilase (- 1,4- glukan malto hidrolase, EC. 3.2.1.2) Enzim amilase bekerja pada substrat dari gugus terminal non-reduktif, pada ikatan glikosidis kedua dari ujung tersebut. Pada substrat amilosa, bila aktivitasnya tinggi dapat menghidrolisis sempurna menghasilkan maltosa. Pada substrat amilopektin akan menghasilkan maltosa dan sisa dekstrin BM- tinggi. Glukoamilase Memecah pati dari luar dengan mengeluarkan unit-unit glukosa dari ujung non reduksi polimer pati. Hasil reaksinya hanya glukosa, sehingga dapat dibedakan dengan dan amilase. Secara komersial diproduksi dari Aspergillus, Rhizopus. Glukoamilase dapat memecah ikatan -1,3 dan - 1,4. Dengan pengaruh enzim glukoamilase posisi glukosa dapat diubah menjadi , pH optimum 4-5 suhu 5060C. Tujuan 1. Mengisolasi enzim amilase dari kecambah kacang hijau. Bahan: 1.
biji kering
2.
biji direndam semalam ( 12 jam)
3.
biji dikecambahkan (12 jam)
4.
biji dikecambahkan 24 jam
5.
biji dikecambahkan 48 jam
6.
buffer asetat (0.1-0.5 M) pH 5.5
7.
pati 4 %
8.
pati 1 %
9.
iodin 1 %
10. glukosa anhidrat 11. reagen nelson 12. reagen arsenomolibdat Alat: 1.
Mortar
2.
Kertas saring
3.
sentrifuse
4.
Karet hisap
23
5.
Pipet volume 1 ml
6.
Tabung reaksi
7.
Rak tabung reaksi
8.
waterbath
9.
Spektrofotometer
10. kuvet 11. beker glass 250 ml Prosedur Kerja: a. Hancurkan 5 g kecambah biji, kemudian tambahkan 50 ml buffer asetat (0.1 – 0.5 M) pH 5.5; biarkan selama 30 menit sambil kadangkala diaduk b. Saring dengan kertas saring Whatman, filtratnya merupakan larutan enzim kasar. Sentrifugasi 1500 rpm selama 30 menit. Ambil supernatannya untuk uji aktivitas. B. PENGUJIAN KUALITATIF ENZIM AMILASE Pendahuluan Parameter umum yang digunakan untuk mempelajari aktivitas hidrolitik enzim amilase terhadap substrat pati diantaranya : 1. Penurunan viskositas 2. Kehilangan kemampuan untuk memberikan warna biru dengan iodin Ketiga tipe enzim amilase dapat dibedakan satu dengan lainnya berdasarkan 2 atau lebih kriteria ini. Kriteria
Laju relatif -amilase
Pembentukan gugus pereduksi
- amilase
glukoamilase
Sama atau hampir sama
Kehilangan viskositas
Cepat
Lambat
lambat
Kehilangan warna biru dgn iodin
Cepat
Lambat
Lambat
Produksi maltosa
Lambat
Cepat
Tidak ada
Produksi glukosa
Tidak ada
Tidak ada
Cepat
Tujuan Mengukur aktivitas enzim amilase yang diisolasi dari kecambah kacang hijau
24
Bahan 1. Pati 4% (DE=15-20) sebagai substrat 2. Buffer asetat sebagai pelarut substrat 3. Larutan iodin 1% sebagai indikator reaksi 4. Ekstrak kasar amilase Alat 1. Tabung reaksi 2. Pipet mikro Prosedur Kerja a. Substrat yang digunakan larutan pati 4% (DE= 15-20) dengan pelarutnya buffer asetat pH 5.5. b. Sebanyak 1 ml substrat ditambah larutan iodin 1% selanjutnya tambahkan dengan 0.5 ml larutan enzim. Pengamatan aktivitas amilase didasarkan terjadinya perubahan warna biru dari pati setelah ditambah larutan iodin 1%. Inkubasi pada suhu kamar dengan pengamatan setiap 10 menit, selama 60 menit. Waktu (menit) 0
Sampel
10
20
30
40
50
60
Biji kering Biji direndam Kecambah umur 12 jam Kecambah umur 24 jam Kecambah umur 36 jam
Notasi : (-)
bila belum terjadi perubahan warna
(+)
bila terjadi perubahan warna
(++)
perubahan warna lebih jelas
(+++)
warna merah coklat
(++++)
warna lebih terang
25
BAB V UJI KUALITATIF DAN KUANTITATIF KARBOHIDRAT Pendahuluan Pada tanaman, karbohidrat dibentuk dari reaksi CO2 dan H2O dengan bantuan sinar matahari melalui proses fotosintesis dalam sel tanaman berklorofil. Berdasarkan strukturnya karbohidrat didefinisikan sebagai polihidroksi aldehid dan polihidroksi keton. Pada
umumnya
karbohidrat
dapat
dikelompokkan
menjadi
monosakarida,
oligosakarida, dan polisakarida. Monosakarida merupakan suatu molekul yang terdiri dari lima atau enam atom C, oligosakarida merupakan polimer dari 2 – 10 monosakarida, sedangkan polisakarida merupakan polimer lebih dari 10 monomer monosakarida. Molekul-molekul polisakarida sangat besar, oleh karena itu daya larutnya sangat kecil. Pati merupakan polisakarida yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan, sedangkan glikogen merupakan polisakarida hewan / manusia. Pati atau glikogen apabila dihidrolisis akan menghasilkan unit-unit glukosa. Karbohidrat ada yang bersifat pereduksi dan non pereduksi. Sifat pereduksi ini disebabkan adanya gugus aldehid dan gugus keton yang bebas, sehingga dapat mereduksi ion-ion logam seperti tembaga (Cu) dan perak (Ag) dalam larutan basa. Dalam larutan benedict yang terbuat dari campuran CuSO4, NaOH, dan Na-sitrat, gula tersebut akan mereduksi Cu yang berupa Cu(OH)2 menjadi Cu2O yang tidak larut. Tujuan 1.
Mengenalkan jenis-jenis karbohidrat (monosakarida, disakarida, polisakarida, gula pereduksi dan gula non pereduksi) dengan uji kualitatif.
2.
Mengenalkan jenis-jenis dan prinsip uji kualitatif
3.
Mempraktikkan uji kualitatif karbohidrat
4.
Mengenalkan tahapan dan tingkat hidrolisis pati secara non enzimatis melalui analisis gula reduksi dengan perlakuan suhu dan waktu pemanasan yang sama.
A. UJI MOLISCH Bahan :
1. 1 ml glukosa 5%, 2. 1 ml sukrosa 5%, 3. 1 ml pati 1% 26
4. Reagen Molish Alat :
1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Pipet ukur 1 ml 4. Labu hisap 5. Pipet tetes Prosedur kerja :
1. Masukkan ke dalam tabung reaksi 1 ml sample 2. Tambahkan 2 tetes reagen Molish dan dikocok. 3. Tambahkan 1 ml H2SO4 . 4. Amati hasilnya B. UJI BENEDICT Bahan : 1. 2 tetes glukosa 5%, 2. 2 tetes galaktosa 5%, 3. 2 tetes fruktosa 5% 4. Reagen benedict Alat : 1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Pipet ukur 1 ml 4. Labu hisap 5. Pipet tetes 6. Beker glass 250 ml 7. Penangas air Prosedur Kerja : 1. Masukkan ke dalam tabung reaksi 2 tetes sample 2. Tambahkan 1 ml Benedict. 3. Panaskan dalam penangas air.
27
4. Amati hasilnya C. UJI BARFOED Bahan : 1. 5 tetes glukosa 5%, 2. 5 tetes laktosa 5%, 3. 5 tetes maltosa 5% 4. Reagen barfoed Alat : 1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Pipet ukur 1 ml 4. Labu hisap 5. Pipet tetes 6. Beker glass 250 ml 7. Penangas air Prosedur Kerja : 1. Masukkan 5 tetes larutan sample ke dalam tabung reaksi. 2. Tambahkan 1 ml reagen Barfoed. 3. Panaskan dalam penangas air. 4. Amati hasilnya. D. UJI YODIUM Reaksi dengan Yodium, pati akan menghasilkan warna biru bila direaksikan dengan yodium, glikogen berwarna coklat, sedang monosakarida dan disakarida tidak berwarna. Bahan : 1. Larutan Yodium 5% 2. Glikogen 3. Maltosa 4. Glukosa 5. Pati
28
Alat: 1. Pipet tetes 2. Druppel plate Prosedur Kerja: 1. Teteskan 1 tetes sample di atas druppel plate. 2. Tambahkan 1 tetes larutan yodium. 3. Amati warna yang terjadi.
D. UJI KUANTITATIF HIDROLISIS PATI NON-ENZIMATIS Bahan: 1. larutan pati 4% 2. NaOH 2% 3. aquades 4. HCl 2 N 5. Indikator pp 1% 6. Reagen arsenomolibdat 7. reagen nelson Alat : 1. Water bath 2. Pipet volume 1 ml 3. Tabung reaksi 4. Gelas ukur 50 ml 5. Labu ukur 100 ml 6. Pipet tetes 7. Spektrofotometer Prosedur Kerja : a. Hidrolisis Pati Non - enzimatis 1. Pipet 50 ml larutan pati 4%. 2. Tambahkan 15 ml larutan HCl 2 N 3. Masukkan dalam labu ukur 100 ml. 4. Inkubasi dalam penangas air mendidih selama 120 menit.
29
5. Pada saat hidrolisis berjalan 115-118 menit, tambahkan 3 tetes indikator pp ke dalam labu ukur. 6. Setelah 120 menit labu diangkat dan tambahkan NaOH 2% sampai netral 7. Dinginkan pada suhu kamar dalam air mengalir. 8. Setelah dingin tambahkan aquades sampai tepat 100 ml. 9. Ambil 1 ml untuk dianalisis gula reduksinya (prosedur b no. 4 – 9) dengan menggunakan spektrofotometer. Catatan: Lakukan pengenceran apabila konsentrasi larutan sampel terlalu pekat (catat tingkat pengenceran). Pengenceran dilakukan sebelum ditambah reagenreagen. b. Pembuatan Larutan glukosa Standart 1.
Buat larutan glukosa standart ( 10 mg glukosa anhidrat/ 100 ml).
2.
Buat 5 pengenceran dengan konsentrasi 2,4,6,8,10 mg/100 ml.
3.
Siapkan 6 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 1 ml larutan glukosa standard di atas. Kemudian satu tabung reaksi dengan 1 ml aquades sebagai blangko.
4.
Tambahkan 1 ml reagen Nelson dan panaskan tabung reaksi.
5.
Dinginkan dalam beker glas yang berisi air dingin .
6.
Tambah 1 ml reagen arsenomolibdat.
7.
Gojog sampai endapan larut kembali.
8.
Tambah 7 ml aquades.
9.
Baca dengan spektro pada panjang gelombang 540 nm.
10. Buat kurva standard yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi gula dengan absorbansinya.
30
BAB VI ANALISIS LEMAK
A. KADAR LEMAK METODE SOXHLET Pendahuluan Prinsip analisis kadar lemak adalah lemak diekstrak dengan pelarut lemak seperti petroleum eter, petroleum benzena, dietil eter, dll.
Lemak yang ada dalam pelarut
dipisahkan dengan cara menguapkan pelarut, sehingga berat lemak dapat diketahui. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar analisis lemak dengan menggunakan metode soxhlet 2. Membandingkan kadar lemak dari berbagai produk olahan ayam Bahan 1. Dietil eter, petroleum eter, heksan atau pelarut lemak lainnya 2. Sampel Alat 1. Alat ekstraksi soxhlet lengkap dengan kondenser dan labu lemak 2. Alat pemanas listrik atau penangas uap 3. Oven 4. Timbangan analitik 5. Desikator 6. Kapas wool 7. Kertas saring Prosedur Kerja 1. Sediakan labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ekstraksi Soxhlet yang akan digunakan, keringkan dalam oven, dinginkan dalam desikator dan timbang. 2. Timbang 5 gram sampel dalam bentuk tepung langsung dalam saringan timbel, yang sesuai ukurannya, kemudian tutup dengan kapas wool yang bebas lemak 3. Letakkan timbel atau kertas saring yang berisi sampel tersebut dalam alat ekstraksi soxhlet, kemudian pasang alat kondensor di atasnya dan labu lemak di bawahnya. 4. Tuang pelarut dietil eter atau petroleum eter ke dalam labu lemak secukupnya, sesuai dengan ukuran soxhlet yang digunakan.
31
5. Lakukan refluks selama minimum 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. 6. Distilasi pelarut yang ada di dalam labu lemak, tampung pelarutnya. Selanjutnya labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC. 7. Setelah dikeringkan sampai berat tetap dan dinginkan dalam desikator, timbang labu beserta lemaknya tersebut. Berat lemak dapat dihitung. 8. Perhitungan: Berat lemak (g) % lemak = _______________ x 100 Berat sampel
B. BILANGAN PEROKSIDA Pendahuluan Penentuan bilangan peroksida dilakukan dengan pengukuran sejumlah iod yang dibebaskan dari kalium iodida (KI). Iod dilepaskan dari KI akibat reaksi oksidasi oleh peroksida yang ada dalam sampel di dalam medium asam asetat-kloroform. Bahan
1. Pelarut, terdiri dari 60% asam asetat glasial dan 40% kloroform. 2. Kalium iodida jenuh. 3. Larutan pati 1% 4. Natrium tiosulfat 0,1 N 5. Akuades 6. Sampel Peralatan
1. Neraca analitik 2. Buret 3. Erlenmeyer 250 ml 4. Stirer/shaker 5. Pipet Cara kerja
1. Timbang 5 g contoh minyak ke dalam erlenmeyer 250 ml. 2. Tambahkan 30 ml pelarut, kocok sampai semua minyak larut. 32
3. Tambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh, kocok selama 2 menit. 4. Tambahkan 30 ml akuades. 5. Lakukan titrasi dengan Na-tiosulfat 0,1 N atau 0,01 N. 6. Titrasi berakhir sampai warna biru mulai menghilang. 7. Dengan cara yang sama buat blanko. 8. Angka peroksida dinyatakan sebagai miliekuivalen peroksida dari setiap 1000 g sampel. Perhitungan Bilangan peroksida (mek/kg) =
ml Na-tiosulfat X Normalitas X1000 ______________________________ Berat contoh (g)
C. KADAR ASAM LEMAK BEBAS Pendahuluan Asam lemak bebas merupakan hasil hidrolisis minyak. Kadar asam lemak bebas menunjukkan jumlah asam lemak bebas dalam sampel dan merupakan parameter mutu minyak/lemak atau produk pangan yang mengandung lemak/minyak. Karena bersifat asam, kadar asam lemak bebas ditetapkan berdasarkan prinsip titrasi asam-basa dalam medium etanol. Indikator yang digunakan untuk menunjukkan titik akhir titrasi adalah fenolftalein. Bahan
1. Etanol 2. Larutan NaOH 0,1 N 3. Indikator fenolftalein (PP) 4. Sampel Peralatan
1. Neraca analitik 2. Erlenmeyer 250 ml 3. Buret
33
Cara kerja
1. Timbang sampel sebanyak 28,2±0,2 g. Masukkan dalam erlenmeyer. 2. Tambahkan 50 ml alkohol dan 2 ml larutan indikator PP. 3. Lakukan titrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah jambu yang permanen selama 30 detik. Perhitungan ml NaOH x Normalitas x BM asam lemak Kadar asam lemak bebas (%) = __________________________________ berat sampel x 1000
Berat molekul asam lemak dominan untuk jenis minyak dapat dilihat pada tabel berikut: Jenis Minyak
Asam Lemak Dominan
Berat Molekul
Palmitat
256
Minyak inti sawit, kelapa
Laurat
200
Susu, kacang tanah
Oleat
282
Linoleat
278
Susu, minyak sawit
Jagung, kedelai
34
BAB VII EKSTRAKSI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM LIPASE A. EKSTRAKSI ENZIM LIPASE Pendahuluan Lipase
(triacyl glycerol acylhydrolase, EC. 3.1.1.3) adalah enzim yang
menghidrolisis triasilgliserol menjadi asam lemak bebas dan gliserol dan mempunyai aktivitas maksimum pada daerah interface minyak dan air (Brockerhoff dan Jensen, 1974). Produk hasil hidrolisis yang lain adalah monogliserida dan digliserida. Jenis produk
tersebut sangat ditentukan oleh enzim lipase yang digunakan. Lipase
mempunyai sifat yang berbeda antara lain sifat spesifik terhadap posisi dan jenis asam lemak. Saat ini penggunaan enzim lipase antara lain pankreas, susu, tanaman yang menghasilkan trigliserida (seperti kacang, kedelai), kapang dan bakteri. Berat Molekul lipase berkisar 20.000-60.000. Sumber lipase akan berpengaruh terhadap spesifisitas asam lemak, pH optimum dan thermostabilitas. Stabilitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu dan waktu. Reaksi hidrolisis minyak dengan lipase harus mempertimbangkan suhu dan lama waktu reaksi agar aktivitas enzim lipase dapat dipertahankan. Berdasarkan sifat spesifisitasnya Macrae (1983) membagi enzim lipase yang diisolasi dari mikrobia menjadi 3 kelompok : 1.
Lipase yang menghidrolisis asam lemak secara acak terhadap posisi asam lemak, contoh : Corynebacterium acne, Staphylococcus aureus.
2.
Lipase yang menghidrolisis asam lemak pada posisi sn-1, dan sn-2. Contoh : Lipase dari Aspergillus niger. Mucor miehei. Rhizopus arrhizus
3.
Lipase yang menghidrolisis secara spesifik asam lemak tertentu. Contoh : Geotrichum candidum,
memiliki spectrum terhadap asam
lemak rantai
panjang.
35
Reaksi kimia hidrolisis sempurna trigliserida sebagai berikut :
H2C – OH
R – COOH + H2 O
R´- COOH
+ HC - OH
R” - COOH H2C - OH Trigliserida
air
asam lemak bebas
gliserol
Tujuan Mempraktikkan cara membuat ekstrak kasar enzim lipase Bahan 1. dedak padi
5. alkohol
2. susu sapi segar
6. indikator PP
3. dietil eter
7. NaOH 0.1 N
4. buffer phospat pH 7.5
Alat 1. corong
9. pipet volume 10 ml
2. kertas saring
10. bola hisap
3. magnetik stirer
11. gelas ukur 50 ml
4. sentrifuse
12. gelas beker
5. mortar
13. buret
6. Water bath
14. pengaduk
7. erlenmeyer 100 ml
15. pipet tetes
8. neraca analitik
Prosedur Kerja 1. Dedak padi sebanyak 10 gram ditambah 50 ml dietileter, aduk-aduk dan gojog untuk melarutkan lemak. 2. Saring dengan kertas saring, filtratnya berisi lemak dan turunannya yang larut dalam dietil eter. Ampas yang diperoleh ditambah dengan 40 ml 50 mM bufer phosphat pH 7 atau 40 ml 10 mM Tris HCL Bufer pH 7,5 3. Campuran tersebut dimagnetik stirer selama 30 menit.
36
4. Selanjutnya saring dengan kain saring dua lapis. 5. Filtratnya disentrifugasi, supernatan merupakan ekstrak enzim kasar yang terlarut dalam buffer. 6. Lakukan uji aktivitas enzim sesuai dengan prosedur. Tentukan aktivitas enzim lipase tersebut sesuai dengan rumus aktivitas lipase. Aktivitas dinyatakan dalam Unit / ml B. UJI AKTIVITAS ENZIM LIPASE Pendahuluan Reaksi hidrolisis minyak secara enzimatis dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya suhu, pH, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, aktivator dan inhibitor. 1.Suhu Setiap enzim mempunyai suhu tertentu untuk aktivitas. Whitaker (1994) parameter yang dipengaruhi oleh perubahan suhu antara lain : stabilitas enzim, perubahan kelarutan gas, pH, buffer, affinitas enzim terhadap enzim terhadap substrat
dan
kecepatan perubahan subtrat menjadi produk. Kenaikan suhu akan mempunyai 2 macam pengaruh yaitu : 1. Menunjukkan kecepatan reaksi 2. Menunjukkan kecepatan inaktivasi enzim Perubahan suhu reaksi hidrolisis trigliserida selain mempertimbangkan
suhu
optimum enzim juga dipengaruhi oleh sifat substrat pada suhu kamar, ketahanan substrat dan produknya terhadap suhu dan penggunaan pelarut organik. 2. pH Enzim adalah protein yang mempunyai gugus yang dapat terionisasi gugus amino. Gugus amino ini sangta dipengaruhi oleh perubahan pH, oleh karena itu enzim mempunyai pH optimum untuk aktivitasnya. 3.
Konsentrasi Substrat. Selama reaksi enzimatis enzim dan substrat akan berikatan membentuk kompleks.
Pada konsentrasi substrat rendah semua substrat akan berikatan dengan enzim, jika konsentrasi substrat naik maka akan lebih banyak lagi enzim yang berikatan dengan substrat sehingga konsentrasi substrat yang tinggi semua molekul enzim akan terikat substrat.
Selanjutnya semakin tinggi konsentrasi substrat tidak akan meningkatkan
kecepatan reaksi. Pada saat ini kecepatan reaksi sudah mencapai maksimum. 4. Konsentrasi Enzim Jumlah enzim yang dighunakan untuk menghidrolisis terrgantung pada tingkat hidrolisis dan waktu reaksi yang diinginkan. Tingkat hidrolisis yang tinggi dapat dicapai
37
dengan memperlama waktu reaksi dengan konsentrasi enzim yang rendah atau meningkatkan konsentrasi enzim untuk waktu reaksi yang pendek. Faktor –faktor yang mempengaruhi kondisi interface Reaksi hidrolisis enzimatis berlangsung pada daerah interface minyak dan air. Daerah interface ini merupakan faktor pembatas
kontak antara enzim dan substrat.
Beberapa peneliti mencoba memperluas interface dengan menambahkan pelarut organik. Penambahan pelarut organik yang befungsi untuk melarutkan lemak agar dalam suhu kamar
berada dalam bentuk cair.
Faktor –faktor yang harus
dipertimbangkan dalam penggunaan pelarut organik adalah jenis pelarut organik dan volume. Pelarut yang sering dipergunakan adalah pelarut yang bersifat nonpolar antara lain heksan, heptan dan isooktan. Unit Aktivitas Enzim Jumlah enzim yang digunakan untuk suatu reaksi atau proses sangat sulit jika dinyatakan
hanya dalam satuan gram atau ml. Karena enzim mempunyai tingkat
kemurnian yang berbeda-beda dan bisa kemungkinan enzim tersebut sudah tidak aktif lagi. Sehingga perlu parameter lain untuk menyatakan aktivitasnya. Enzim-enzim yang dipasarkan biasanya dinyatakan dalam satuan aktivitas
tidak dengan satuan berat.
Aktivitas enzim dapat dinyatakan dengan 2 macam cara yaitu : 1. satuan unit ( U ) yang didfinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat mengkatalisis perubahan 1 mol substrat per menit pada kondisi tertentu. Satuan 1 Unit Enzim (UE) : mol per menit 2. Sistem SI; dengan satuan KATAL yang didefinisikan sebagai : jumlah enzim yang dapat mengkatalisis perubahan 1 mol substrat per detik ( 1 KAT = 60 x 10 6 Unit) atau 1 Unit = 16.67 nanokatal . Sistem ini belum banyak diterima secara luas Aktivitas spesifik : jml mol substrat yg dikonversi per satuan wkt per unit berat enzim (mmol mg-1 mnt-1 atau mmol mg-1 mnt -1 ). Sistem SI = katal kg-1 Kadang-kadang aktivitas enzim dinyatakan dengan cara lain (tidak standar) misalnya : 1. Papain aktivitasnya dinyatakan dengan TU (tyrosine unit), MCU ( milk clot unit) 2. Bromelin di nyatakan dengan BTU (bromelin tyrosine unit), MCU (milk clot unit), CDU (casein digestion unit), GDU (gelatin digestion Unit) Aktivitas enzim perlu diukur untuk mengetahui berapa jumlah enzim yang dibutuhkan untuk mengkatalisis suatu reaksi dengan waktu tertentu. Contoh : 1 gram laktase hasil pengujian menunjukkan 1000 FCC laktase Unit per gram yang dapat mengkonversi hampir 99% laktose dalam 1 liter susu pada suhu tertentu dalam jangka
38
waktu 24 jam. Laktase dengan aktivitas 10.000 FCC unit per gram hanya membutuhkan 0.1 gram enzim untuk melakukan aktivitas yang sama. Enzim merupakan protein, isolasi enzim dari sumbernya diharapkan meghasilkan enzim 100% murni protein (misal enzim untuk keperluan analisis). Tetapi beberapa enzim tidak harus mempunyai kemurnian yang tinggi (misal enzim untuk proses industri). Sehingga pada berat yang sama aktivitas enzim dengan tingkat kemurniannya tinggi akan lebih tinggi dibanding enzim yang kemuniannya rendah. Dalam hal ini Aktivitas enzim bisa dinyatakan dengan aktivitas spesifik. Aktivitas spesifik adalah jumlah mol substrat yang dikonversi per satuan waktu per unit berat enzim. Jika aktivitas spesifik enzim murni diketahui maka suatu sampel enzim yang belum dimurnikan akan mempunyai aktivitas spesifik yang lebih rendah karena mengandng bahan non enzim (impuritis), rumus perhitungan : Tujuan 1. Mempraktikkan cara menguji aktivitas lipase dari kacang tanah dan dedak padi 2. Menghitung aktivitas enzim Bahan 1. susu sapi segar 2. kacang tanah 3. alkohol 4. buffer phospat pH 6.5 5. indikator PP 6. NaOH 0.1 N Alat 1. corong 2. kertas saring 3. sentrifuse 4. mortar 5. Water bath 6. erlenmeyer 100 ml 7. neraca analitik 8. pipet volume 10 ml 9. bola hisap 10. gelas ukur 50 ml
39
11. gelas beker 250 ml 12. buret 13. pengaduk 14. pipet tetes
Prosedur Kerja 1. Hancurkan 5 gram kacang tanah 2. Tambahkan 50 ml 0,1 N NaCl atau 0,1 M buffer phospat pH 6,5 biarkan 30 menit pada suhu kamar. 3. Saring dengan kertas saring kasar. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak enzim lipase kasar. 4. Substrat (susu sapi segar) dipanaskan suhu 80oC selama 10 menit. 5. Sebanyak 8 ml substrat (susu sapi pasteurisasi) dimasukkan dalam labu Erlenmeyer 100 ml dan seimbangkan suhunya dalam penangas air 370C. 6. Tambahkan 2 ml ekstrak enzim lipase kasar. 7. Inkubasikan pada suhu tersebut selama 10 menit, 370C. Setelah inkubasi tambahkan 40 ml alkohol. 8. Sebagai blanko adalah susu sebanyak 8 ml ditambah 2 ml larutan pengekstrak enzim (Larutan NaCl atau Buffer phosphat) 40 ml alkohol tanpa dilakukan inkubasi. 9. Tambahkan 5 tetes indikator pp pada msing-masing sampel dan blanko, kemudian titrasi dengan 0,1 N NaOH sehingga berubah menjadi mencapai warna pink . Aktivitas enzim dinyatakan dalam mol / menit ml enzim atau Unit/ml Aktivitas lipase = ( ts- tb ) NaOH x M NaOH x1000 Volume enzim x menit Satuan aktivitas lipase Dengan :
= μmol/ ml enz mnt
ts = titrasi sample tb = titrasi blanko waktu inkkubasi = 10 menit M NaOH = Molaritas NaOH 1000 berasal dari konversi mmol = 1000 μmol
% kemurnian = 100% x aktivitas spesifik sampel enzim aktivitas spesifik enzim murni
40
BAB VIII ANALISIS PROTEIN A.
KADAR PROTEIN KASAR METODE KJEDAHL
Pendahuluan Protein merupakan senyawa makromolekul kompleks yang terdiri dari unsur C, H, O, N, S, dan dalam bentuk kompleks mengandung unsur P. Penetapan kadar protein dengan metode Kjedahl merupakan metode empiris (secara tidak langsung) yaitu melalui penetapan kadar N dalam bahan.
Dengan metode ini senyawa-senyawa
bernitrogen yang lain selain protein juga terukur sebagai protein sehingga metode ini sering disebut penentapan protein kasar.
Tahapan analisis protein dengan metode
Kjedahl meliputi destruksi, destilasi, dan titrasi. Destruksi bertujuan melepaslan unsur N dari protein yang diubah menjadi amonium sulfat. Pada tahap destilasi amonium sulfat diubah menjadi amoniak yang ditangkap oleh larutan asam standar berlebih. Sisa asam yang tidak bereaksi dengan amoniak dititrasi, sehingga dapat diketahui jumlah amoniak dari N protein sampel. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar analisis protein dari masing-masing metode 2. Menerapkan metode analisis protein sesuai dengan sifat bahannya. Bahan 1. Asam sulfat pekat, berat jenis 1.84 2. Air raksa oksida 3. Kalium sulfat 4. Larutan natrium hidroksida-natrium tiosulfat (larutkan 60 gram NaOH dan 5 gram NaS2O2.5H2O dalam air dan encerkan sampai 100 ml) 5. Larutan asam borat jenuh 6. Larutan asam klorida 0.02 N 7. Sampel Alat 1. Pemanas Kjedahl lengkap yang dihubungkan dengan penghisap uap melalui aspirator. 2. Labu kjedahl berukuran 30 ml/50 ml.
41
3. Alat distilasi lengkap dengan erlenmeyer berpenampung berukuran 125 ml 4. Buret 25 ml/50 ml 5. Erlenmeyer 6. Statif 7. Gelas beker 8. Pipet tetes Prosedur Kerja 1. Timbang 1 gram bahan yang telah dihaluskan dan masukkan ke dalam labu kjeldahl. Kalau kandungan protein bahan tinggi, gunakan bahan kurang dari 1 gram. Kemudian tambahkan 7.5 g K2S2O4 dan 0.35 g HgO (Awas: zat ini beracun) dan akhirnya tambahkan 15 ml H2SO4 pekat. 2. Panaskan semua bahan dalam labu kjeldahl dalam almari asam sampai berhenti berasap. Teruskan pemanasan dengan api besar sampai mendidih dan cairan menjadi jernih. Teruskan pemanasan tambahan lebih kurang satu jam. Matikan api pemanas dan biarkan bahan menjadi dingin. 3. Kemudian tambahkan 100 ml aquades dalam labu kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, juga tambahkan 15 ml larutan K2SO4% (dalam air) dan akhirnya tambahkan perlahan-lahan larutan NaOH 50% sebanyak 50 ml yang sudah didinginkan dalam lemari es. Pasanglah labu kjeldahl dengan segera pada alat distilasi. 4. Panaskan labu kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapisan cairan tercampur kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih. 5. Distilat ini ditampung dalam erlenmeyer yang telah diisi dengan 50 ml larutan standar HCl (0.1 N) dan 5 tetes indikator metil merah. Lakukan distilasi sampai distilat yang tertampung sebanyak 75 ml. 6. Titrasilah distilat yang diperoleh dengan standar NaOH (0.1 N) (lampiran) sampai warna kuning. Buatlah juga larutan blanko dengan mengganti bahan dengan aquades, lakukan destruksi, distilasi dan titrasi seperti seperti pada bahan contoh. Perhitungan: %N = (ml NaOH blanko – ml NaOH contoh) x N HCl x 100 x 14.008 g sampel x 1000 % protein = %N x faktor konversi (tergantung jenis sampel)
42
B.
KADAR PROTEIN METODE BIURET
Pendahuluan Metode ini merupakan cara terbaik untuk menentukan kadar protein sampel. Prinsip penetapan protein metode Biuret adalah pada kondisi basa, Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida (-CO-NH-) suatu protein menghasilkan warna ungu, sehingga kadar protein sampel dapat ditetapkan dengan spektrofotometer. Bahan 1. Sampel (seperti analisis protein dengan metode kjedahl) 2. Pereaksi biuret Larutkan 3 gram CuCO4.5H2O dan 9 gram Na-K-Tartrat dalam 500 ml NaOH 0.2 N. Tambahkan 5 gram KI kemudian encerkan sampai 1000 ml dengan menggunakan NaOH 0.2 N. 3. Larutan protein standar Larutan bovine serum albumin atau kasein 5 mg/ml Alat 1. Spektrofotometer 2. Sentrifuse 3. Waring blender 4. Tabung reaksi Prosedur Kerja Pembuatan kurva standar
1. Buat larutan standar BSA atau kasein dalam air dengan konsentrasi 5 mg/ml. 2. Masukkan ke dalam tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8. dan 1.0 ml larutan protein standar. Tambahkan air sampai volume total masing-masing 4 ml.
3. Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dalam masing-masing tabung reaksi. Campur rata.
4. Simpan tabung pada suhu 37C selama 10 menit atau pada suhu kamar selama 30 menit sampai terbentuk warna ungu yang sempurna.
5. Ukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm.
43
Persiapan sampel 1. Timbang sampel padat. blender.
Hancuran
didekantasi
untuk
Hancurkan sampel padat dengan menggunakan waring
yang diperoleh dipergunakan
disaring lalu
selanjutnya
disentrifugasi. Supernatan
(protein
yang
terdapat
dalam
supernatan adalah soluble protein). 2. Sampel cair yang berupa protein konsentrat, isolat yang tidak keruh, maka persiapan sampel cukup dengan pengenceran saja. Jika cairannya keruh atau mengandung bahan-bahan yang menganggu seperti glukosa maka harus dilakukan perlakuan sebagai berikut:
Timbang ekstrak.
Ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi seperti pada
waktu penetapan standar, kemudian tambahkan air sampai volume total masingmasing 1 ml.
Tambahkan 1 ml TCA (Tri Chloroacetic Acid) 10% pada masing-masing tabung reaksi sehingga protein akan terdenaturasi.
Sentrifusa pada 3000 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap, supernatan dibuang dengan cara dekantasi.
Ke dalam endapan tambahkan 2 ml etil eter, campur merata lalu sentrifusa kembali untuk menghilangkan residu TCA. Biarkan mengering pada suhu kamar.
Ke dalam endapan kering ditambahkan air 4 ml, campur merata.
Tambahkan 6 ml pereaksi biuret, alkali dalam pereaksi ini akan melarutkan endapan yang tersisa.
Penetapan sampel 0.1-1.0 ml sampel (dipipet tepat) dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diperlakukan seperti penetapan standar C.
KADAR N-AMINO (CARA TITRASI FORMOL)
Pendahuluan Prinsip analisis ini adalah larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH), kemudian penambahan formalin akan membentuk dimethilol. Pembentukan dimethilol ini menunjukkan gugus amino sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam (gugus karboksil asam amino) dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein dan akhir titrasi ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang selama 30 detik. Titrasi formol hanya tepat untuk menunjukkan proses hidrolisis protein dan kurang tepat untuk menentukan kadar protein.
44
Bahan 1. K-oksalat 2. Fenolftalein 1% 3. NaOH 4. Rosanilin klorida 5. Formaldehid 40 % 6. Akuades 7. Sampel seperti analisis protein metode Kjeldahl Alat 1. Erlenmeyer 250 ml 2. Pipet volume 1 ml dan 10 ml 3. Buret 4. Statif Prosedur Kerja 1. Pindahkan 10 ml susu atau larutan protein ke dalam erlenmeyer 125 ml dan tambahkan 20 ml aquades dan 0.4 ml larutan Kalium oksalat jenuh (kalium oksalat : air = 1:3) dan 1 ml phenolphtalein 1%. Diamkan selama 2 menit. 2. Titrasilah larutan contoh dengan 0.1 N NaOH sampai mencapai warna seperti warna standar di bawah ini atau sampai warna merah jambu. 3. Warna standar : 10 ml susu + 10 ml aquades + 0.4 ml K-oksalat jenuh + 1 tetes 0.01% indikator rosanilin-chlorida. 4. Setelah warna tercapai, tambahkan 2 ml larutan formaldehid 40% dan titrasilah kembali dengan larutan NaOH sampai warna seperti warna standar tercapai lagi. Catatlah titrasi kedua ini. 5. Buatlah titrasi blanko yang terdiri dari : 20 ml aquades + 0,4 ml larutan K-oksalat jenuh + 1 ml indikator phenolphtalein + 2 ml larutan formaldehid dan titrasi dengan larutan NaOH. 6. Titrasi terkoreksi yaitu titrasi yang kedua dikurangi titrasi blanko merupakan titrasi formol. titrasi formol % N = ____________ x N NaOH x 14.008 g bahan x 10
45
D. UJI NINHIDRIN Pendahuluan Reaksi antara asam alfa amino dan ninhidrin akan terbentuk warna, melibatkan reaksi : Asam Alfa amino + ninhidrin -- ninhidrin tereduksi + asam alfa amino + H2O Asam alfa amino + H2O - asam alfa keto + NH3 Asam Alfa keto + NH3 - aldehid + CO2 Reaksi lengkap : Asam alfa amino + 2 ninhidrin - CO2 + aldehid + kompleks warna biru + 3 H2O Secara
singkat
ninhidrin
mengalami
deaminasi
oksidatif
dan
asam
amino
dekarboksilasi menjadi CO2, NH3 dan aldehid. Kemudian Ninhidrin yang tereduksi akan bereaksi dengan amonia dan dengan molekul ninhidrin lain sehingga terbentuk senyawa kompleks berwarna ungu ( ungu Ruhemann). Ninhidrin hanya akan bereaksi dengan asam alfa amino bebas NH2-C-COOH, gugus ini terdapat pada semua asam amino, peptida dan protein. Sedangkan dekarboksilasi hanya terjadi pada asam amino bebas saja
tidak terjadi pada peptida dan protein.
Sehingga hanya asam amino bebas saja yang akan membentuk kompleks warna biru. Metode ini bisa digunakan untuk penentuan kadar asam amino secara kualitatif dan kuantitatif. Protein atau peptida yang mempunyai gugus asam amino bebas (pada satu sisi rantainya) juga bereaksi positif dengan ninhidrin. Bahan: 1. reagen ninhidrin 2. larutan susu skim (10%), 3. gelatin (5%), 4. putih telur, 5. enzim, 6. keju, 7. pemanis sintetik diasweet, 8. MSG (5%), 9. akuades sebagai (kontrol)
46
Alat: 1. Tabung reaksi 2. Rak tabung reaksi 3. Kertas label 4. Karet hisap 5. Pipet volume 10 ml 6. Beker glas 500 ml Prosedur kerja: 1. Siapkan sejumlah tabung reaksi yang telah diberi label sesuai dengan sampel yang akan diuji. 2. Ambil sampel sebanyak 2 ml kemudian tambahkan 2 ml larutan ninhidrin. 3. Masukkan tabung reaksi tersebut pada air mendidih selama 15- 20 detik. 4. Amati warna larutannya. Catat hasil pengamatan dan tulislah hasilnya pada hasil pengamatan. Tulis + jika hasil test positif (berwaarna ungu, berarti sampel mengandung gugus amina bebas), tulis – jika hasil test negatif. 5. Warna ungu menunjukkan sampel mengandung asam amino (uji +) . Jika terbentuk warna lain seperti (kuning, orange dan merah) maka uji negatif. Catatan: sampel yang mengandung prolin, hydroxyproline, dan 2-, 3-, and 4-asam aminobenzoat hasil uji yang positif tidak akan memberikan biru tapi kuning. Garam Ammonium memberikan hasil positif.Beberapa amina seperti anilin dengan uji ninhidrin memberikan warna orange hingga merah (uji negatif).
47
BAB IX UJI AKTIVITAS ENZIM PROTEOLITIK
Pendahuluan Enzim proteolitik merupakan kelompok enzim yang memegang peranan penting dalam industri. Enzim proteolitik tergolong dalam enzim hidrolitik (peptida hidrolase). Enzim ini dipakai dalam produksi keju, bir, pelunakan daging, dan modifikasi sifat-sifat protein sereal dalam pembuatan roti dan produk sereal lain. Reaksi umum yang dikatalisis oleh enzim proteolitik adalah hidrolisis ikatan peptida pada protein sebagai berikut: H X
C
R1 H
O
N
C
H2O X-NH-CHR1-COOH + H2N-CHR2-C-Y
N
C
H
O
C R2
Y H
Setiap enzim memiliki spesifisitas substrat yang berbeda-beda. Spesifisitas substrat untuk enzim proteolitik diantaranya adalah: A. Sifat R1 dan R2 Kebutuhan spesifik terhadap sifat R1 dan/ atau R2
dapat digunakan untuk
membedakan enzim proteolitik. Misalnya -kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida dengan cepat hanya jika R1 merupakan rantai sisi berupa residu tirosil, fenilalanil, atau triptofanil. Sedangkan pepsin dan karboksipetidase mempunyai spesifisitas dihubungkan dengan sifat rantai sisi R2. Kedua enzim ini menghidrolisis ikatan peptida dengan kecepatan maksimum jika R2 merupakan rantai sisi berupa residu fenilalanil. Untuk karboksilase, konstituen Y harus gugus OH. B. Konfigurasi Asam Amino Spesifisitas enzim proteolitik juga harus dikontribusi oleh kongfigurasi asam amino, yaitu dalam konfigurasi-L. Kadang-kadang residu asam amino-D berikatan pada sisi aktif , tetapi ikatan peptida tidak terhidrolisis.
48
C. Ukuran Senyawa Ukuran senyawa untuk beberapa enzim proteolitik merupakan faktor yang sangat penting, khususnya untuk protease aspartat, sedangkan untuk beberapa enzim lain ukuran senyawa bukan merupakan faktor penting. D. Sifat X dan Y Kebutuhan enzim terhadap X dan Y sebagai gugus hidrogen dan hidroksil atau sebagai bentuk terderivatisasi dapat dipakai untuk menentukan sifat enzim sebagai endopeptidase atau eksopeptidase. Pada endopeptidase, yang menghidrolisis ikatan peptida secara acak pada sisi dalam protein, aktivitas maksimum dicapai jika X dan Y terderivatisasi. X berupa gugus asil (asetil, benzoil, benziloksikarbonil) dan Y berupa gugus amida atau ester. E. Kebutuhan terhadap Ikatan Peptida Kebanyakan enzim proteolitik juga menghidrolisis ikatan lain selain ikatan peptida. Ikatan peptida dapat digantikan dengan gugus amida (-NH2), ester (-COOR), tiolester (-COSR), atau hidroksamat (-CONHOH). Bahan : 1.
enzim papain
2.
susu skim
3.
formaldehid
4.
aquades
5.
indikator pp
6.
NaOH 0,1 N
Alat : 1.
Water bath
2.
Buret
3.
neraca analitik
4.
erlenmeyer
5.
gelas ukur 50 ml
6.
pipet volume 10 ml
7.
gelas beker 250 ml
8.
pengaduk
9.
pipet tetes
49
Prosedur Kerja: 1. Buat larutan susu skim 5%. 2. Buat larutan enzim konsentrasi 20, 30 dan 40% 3. Siapkan 4 erlenmeyer, isi masing-masing dengan 40 ml larutan susu skim, masukkan 3 erlenmeyer dalam waterbath suhu 37 C(kira-kira 10 menit). Erlenmeyer yang satu tidak perlu dimasukkan dalam water bath (untuk perlakuan kontrol/blangko) 4. Masukkan masing masing ke dalam erlenmeyer 10 ml larutan enzim dengan konsentrasi yang berbeda. Untuk perlakuan kontrol/blangko tidak ditambah enzim tetapi di tambah 10 ml akuades ( dan tidak perlu di inkubasi). 5. Ketiga erlenmeyer diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 jam. 6. Sesudah itu ambil 10 ml sampel tambah dengan 2 ml formaldehid , tambah indikator pp 3 tetes, lalu titrasi dengan 0,1 N NaOH
% N = (ts-tb) ml x N NaOH x 14,008 x FP x100% berat sampel (g) x 1000
ts = titrasi sampel tb = titrasi blanko berat sampel = berat susu skim dalam gram FP = Faktor pengenceran , jika sesuai dengan prosedur maka FP = 50/10= 5
50
BAB X ANALISIS KADAR VITAMIN A.
Penentuan Kadar Vitamin C
Pendahuluan Vitamin C adalah vitamin yang tergolong vitamin yang larut dalam air. Sumber Vitamin C sebagian besar tergolong dari sayur-sayuran dan buah-buahan terutama buah-buahan segar. Asupan gizi rata-rata sehari sekitar 30 sampai 100 mg vitamin C yang dianjurkan untuk orang dewasa. Namun, terdapat variasi kebutuhan dalam individu yang berbeda. Vitamin C atau asam askorabat mempunyai berat molekul 178 dengan rumus molekul C6H8O6. Dalam bentuk Kristal tidak berwarna, Vitamin C memiliki titik cair 190-192oC, bersifat larut dalam air dan sedikit larut dalam aseton atau alkohol yang mempunyai berat molekul rendah. Akan tetapi vitamin C sukar larut dalam pelarut organic yang pada umumnya dapat melarutkan lemak. Hal yang pertama kali dilakukan dalam analisa kuantitatif vitamin C adalah standardisasi larutan I2 0,01 N, proses ini dilakukan dengan menggunakan larutan Natrium Tiosulfat (Na2S2O3), larutan natrium tiosulfat juga sebelumnya telah distandardisasi dengan menggunakan KIO3 sebagai baku primer. Titrasi iodimetri dilakukan dengan menggunakan amilum sebagai indikator. Prinsip dari titrasi iodimetri adalah reduksi analat oleh I2 menjadi I-. Penentuan kadar vitamin C dengan metode titrasi iodimetri ini didasarkan pada prinsip tereduksinya analat oleh I2 menjadi ion I-. Iod merupakan oksidator yang tidak terlalu kuat, sehingga hanya zat-zat yang merupakan reduktor yang cukup kuat yang dapat dititrasi. Sehingga penerapannya tidak terlalu luas, salah satu penerapan titrasi dengan metode iodimetri adalah pada penentuan bilangan iod minyak dan lemak juga vitamin C. Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah mempelajari penerapan metode titrimetri dalam analisis vitamin C, melakukan analisis vitamin C pada berbagai bahan pangan dengan metoda titrasi, dan melatih keterampilan dalam melakukan analisis secara titrimetri. Bahan 1. Sampel 2. Aquadest 3. Amilum 1% 4. Larutan I2 0,01 N
51
Alat 1. Spatula 2. Beaker glass 250 mL 3. Neraca analitik 4. Labu ukur 100 mL 5. Corong gelas 6. Batang pengaduk 7. Pipet tetes 8. Botol semprot 9. Pipet ukur 10 mL 10. Erlenmeyer 250 mL 11. Gelas ukur 25 mL 12. Buret coklat 25 mL PROSEDUR 1. Menimbang 10 g sampel 2. Memasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan mengencerkannya dengan aquadest sampai tanda batas. 3. Memipet 10 mL filtrat kemudian memasukkannya ke dalam Erlenmeyer 250 mL. 4. Menambahkan 2 mL larutan amilum 1% dan bila perlu menambahkan 20 mL aquadest. 5. Menitrasi dengan larutan I2 0,01 N sampai larutan berwarna biru. Perhitungan : 1 mg 0,01 N Iodium = 0,88 mg Asam askorbat Mg Asam askorbat = 0,88 x V titrasi sampel Kadar Vitamin C (%) = 100 x mg asam askorbat x fp mg sampel fp= faktor pengenceran
52
BAB XII KROMATOGRAFI KOLOM B.
Penentuan Kadar Beta Karoten dengan Kromatografi Kolom Adsorpsi
Pendahuluan Ada empat jenis kromatografi yang dikategorikan kromatografi kolom, yaitu kromatografi
adsorbsi,
kromatografi filtrasi gel.
kromatografi
partisi,
kromatografi
pertukaran
ion,
dan
Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan
secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. Nama lain kromatografi adsorbsi adalah Solid Liquid Adsorption Chromatography, karena pada kromatograsi ini digunakan zat padat sebagai adsorben yang berperan sebagai fase stasioner dan zat cair yang berperan sebagai fase mobil. Permukaan partikel padat biasanya lebih aktif dibandingkan bagian dalamnya sehingga sering disebut mempunyai aktivitas permukaan (surface activity). Bila partikel dimasukkan ke dalam suatu larutan, permukaan partikel tersebut mempunyai daya tarik baik pada zat terlarut (solut) maupun pada pelarutnya (solven). Partikel padat yang mempunyai aktivitas permukaan dalam kromatografi disebut adsorben. Adsorben harus mempunyai permukaan yang luas dan mempunyai aktivitas kimia. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar kromatografi kolom 2. Menentukan kadar betakaroten Bahan 1. Larutan standar: beta karoten ditimbang sebanyak 10 mg lalu dilarutkan dalam 10 ml petroleum eter-aston (10:1). Ambil masing-masing 0.1 ml, 0.2 ml, 0.3 ml, 0.4 ml dan 0.5 ml lalu diencerkan dalam petroleum eter-aseton (10:1) hingga 25 ml 2. Petroleum eter-aseton (1:1) 3. Na2SO4 4. Minyak sawit (Kelas A)
53
Alat 1. Kolom kromatografi ukuran 16 mm x 150 mm 2. Bagian bawah kolom diisi kapas absorben dengan tinggi 15 mm, diatasnya dimasukkan alumina setinggi 100 mm, kemudian dimasukkan Na2SO4 setinggi 20 mm dan bagian atas kolom diisi kapas setinggi 15 mm. 3. Timbangan analitik 4. Mixer magnet 5. labu ukur 100 ml 6. Kertas saring 7. Corong pemisah Prosedur Kerja Kromatografi Kolom Adsorbsi (Cagampang, B.G. and Rodriques, F.M. 1980. Methods of Analysis for Screening Crops of Appropriate Qualities. Institute of Plant Breeding University of the Philipines, Los Banos) 1. Sampel ditimbang sebanyak 5 gram dalam erlenmeyer lalu ditambahkan 35 ml petroleum eter-aseton (1:1) 2. Erlenmeyer ditutup dan diaduk dengan mixer magnet selama 10 menit 3. Residu dibiarkan sampai mengendap lalu dituangkan ke dalam labu ukur 100 ml melalui kertas saring 4. Kertas saring dicuci dengan petroleum eter-aseton (1:1) 5. Ekstraksi diulangi 6. Filtrat yang diperoleh diencerkan hingga 100 ml dengan petroleum eter-aseton (1:1) kemudian digojog 7. Larutan diambil 25 ml lalu dimasukkan dalam corong pemisah 8. 25 ml aquades dimasukkan corong pemisah kemudian dikocok 9. Dibiarkan hingga terjadi pemisahan lalu lapisan bawah (air-aseton) dialirkan keluar dari corong pemisah dan dibuang. 10. Pencucian diulang dua kali 11. Fase eter yang diperoleh ditambahkan Na2SO4 sebanyak 5 gram untuk tiap 100 ml fase eter 12. Fase eter dimasukkan dalam kolom kromatografi 13. Larutan petroleum eter-aseton (10:1) dielusikan ke dalam kolom 14. Beta karoten yang diperoleh diencerkan dengan petroleum eter-aseton (10:1) lalu absorbansinya diukur pada panjang gelombang 450 nm 15. Buat kurva standard an carai persamaan regresinya 16. Hitung kadar beta karoten (mg/100 g atau mg/100 ml)
54
BAB XII ELEKTROFORESIS Pendahuluan Elektroforesis adalah suatu metode untuk memisahkan makromolekul seperti asam nukleat dan protein berdasarkan ukuran, muatan listrik dan ciri fsik. Protein mempunyai muatan positif dan muatan negatif yang merupakan gabungan muatan asam amino-asam amino yang terkandung di dalamnya. Karena muatan listrik tersebut protein akan bergerak ke elektroda melewati gel poliakrilamid yang bertindak sebagai penyaring yang akan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan bentuk molekul, kekuatan medan listrik, sifat hidrofobik reatif sampel dan kekuatan ionik. Tujuan 1. Mengetahui prinsip dasar pemisahan protein dengan metode elektroforesis 2. Menentukan berat molekul kasein Bahan 1. Sampel: kasein 0,1% (b/v), soy 0,1 % (b/v) 2. Sampel buffer: 0.5 M larutan Tris, 2 % SDS, 0.05% merkaptoetanol, HCl 0,5 M, pH 6,8 3. Buffer Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 4. Larutan stock akrilamid 30%: 29.2 gram akrilamid ditambah 0.8 gram N’N’-bismethylene acrylamid dalam 100 ml aquades. 5. Larutan SDS 10 % 6. Amonium persulfat 10% (di buat setiap akan digunakan) 7. TEMED
8. Larutan pewarna : 0.1 % commasie blue dalam larutan metanol : air : asam asetat (5:5:2) 9. Larutan pembilas terdiri dari metanol : air : asam asetat (5:5:2) 10. Aquades Alat 1. Seperangkat alat elektroforesis (Gamabar 3.) 2. Mikropipet 3. Tip 4. Beker glass 100 ml
55
5. Beker glas 50 ml 6. Eppendorf 7. Shaker
Gambar 1. Seperangkat alat elektroforesis Prosedur Kerja Elektroforesis Pembuatan gel 1. Pasanglah alat gelas untuk mencetak gel ke tempat yang disediakan (seperti gambar 4.) 2. Untuk membuat 20 ml gel 20% campurkan 13.3 ml larutan stok akrilamid 30%, 5 ml buffer Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8, 0.2 ml SDS 10%, 1.5 ml aquades. 3. Tambahkan segera 100 µl APS 10% dan TEMED 10 µl 4. Aduk hingga tercampur merata
5. Tuangkan ke dalam cetakan gel dengan menggunakan mikropipet hingga tinggi yang dikehendaki. Beri sisa tempat untuk stacking gel di bawah area peletakan gigi sisir. 6. Biarkan gel terpolimerisasi selama 15-30 menit dalam suhu ruang. 7. Tuangkan aquades dengan mikropipet ke permukaan gel pemisah dan kemudian buang aquades tersebut dengan menyerapkan tisu 8. Sementara itu buat lagi gel untuk membuat 4 ml stacking gel 4% dengan mencampur 1.2 ml larutan stok akrilamid 30%, 0.5 ml buffer Tris-HCl 6.8, 40 µl SDS 10%, 2.26 ml aquades. 9. Tambahkan segera 20 µl 10% APS dan 5 µl TEMED. 10. Tuangkan larutan ke atas gel pemisah
56
11. Sisipkan gigi sisir pada stacking gel dengan perlahan, jangan sampai terbentuk gelembung. 12. Biarkan gel terpolimerisasi selama 15-30 menit dalam suhu ruang 13. Ambillah sisir secara perlahan dari gel. 14. Pindahkan gel secara perlahan ke dalam tank elektroforesis (seperti gambar 5.) 15. Masukkan buffer tank ke dalam tank elektroforesis
57
Gambar 2. Manual prosedur pemasangan alat elektroforasis Persiapan sampel 1. Larutkan 0.1 gram kasein ke dalam 4.9 gram sampel buffer 2. Panaskan pada suhu 90oC selama 5 menit.
Pemisahan protein dengan elektroforesis 1. Masukkan sampel ke dalam sumuran sebanyak 5 µl 2. Pasanglah elektrode sesuai dengan warnanya. 3. Gel dijalankan pada tegangan 200 V selama 45 menit atau hingga sampel telah mencapai bagian dasar.
58
Gambar 3. Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul Pewarnaan gel 1. Hentikan listrik, pindahkan gel dari tank 2. Pindahkan glass plate dari gel kedua sisi 3. Tuangkan larutan pewarna pada gel dalam wadah 4. Tutup dengan plastik dan letakkan di atas shaker selama 15-30 menit 5. Pindahkan larutan pewarna dari gel. Simpan untuk digunakan kembali. 6. Bilas gel dengan aquades 7. Tuangkan larutan pembilas selama dan masukkan potongan kertas saring, biarkan selama 10-15 menit di atas shaker 8. Ganti larutan pembilas dengan yang baru hingga yang terlihat pada gel adalah pitapita protein. Pengamatan Amati pita-pita yang terbentuk pada gel elektroforesis. Cari dalam literatur berat molekul masing-masing komponen penyusun kasein dan tentukan letak komponen tersebut pada pita gel elektroforesis.
59
