Desenvolvimento Embrionário: das Células ao Coração. Ana Paula Alves 2011
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG Instituto de Ciências Exatas - ICEx Programa de Pós Graduação em Física
Desenvolvimento Embrionário: das Células ao Coração.
Ana Paula Alves
Orientador: Prof. Ubirajara Agero Batista Co-orientador: Prof. Oscar Nassif de Mesquita
Dissertação apresentada ao departamento de Física da Universidade Federal de Minas Gerais, para a obtenção de Título de Mestre em Física
Área de Concentração: Física Biologica .
2010
Quando uma criatura humana desperta para um grande sonho e sobre ele lança toda a força de sua alma, todo o universo conspira a seu favor. (Goethe)
Agradecimentos Quero agradecer ao meu orientador Professor Ubirajara Agero pelo compromisso com este trabalho, além do grande entusiasmo e compreensão. Ao Professor Oscar Nassif de Mesquita pela oportunidade de conhecer o trabalho do grupo e me encaminhar ao Bira. Aos colegas do laboratório de Física de Sistemas Biológicos da UFMG, Lívia, Ulisses, Paula, Pedro, Barbara e ao Edgar. Aos funcionários da o cina mecânica do departamento de física da UFMG, Sr. João e ao Thiago e ao funcionário da o cina elétrica, Rubens. Eles contribuiram bastante no desenvolmento da montagem experimental deste trabalho. À minha família, pelo apoio, especialmente minha mãe e minha irmã. Aos amigos do mestrado, pelos momentos de descontração e de bandejão, especialmente gostaria de agradecer ao clube da luluzinha pelas muitas risadas, e pelo grande apoio em todas as horas. Aos meus amigos de alguns anos, boa parte da turma de 2005 de física. Gostaria de agradecer também à agência nanciadora CAPES pela bolsa de mestrado no periodo de 2 anos.
iv
Resumo Usamos a Microscopia de Desfocalização (MD), técnica desenvolvida no laboratório de Física de Sistemas Biológicos para obter informações sobre Desenvolvimento Embrionário. Estudamos células extraídas de embriões de galinha nos primeiros estágios de desenvolvimento, o batimento cardíaco e o crescimento de vasos no embrião. Desenvolvemos um processo de extração e cultura de células mesenquimais somáticas no laboratório. As células mesenquimais somáticas vão dar origem aos tecidos e órgãos do embrião, nosso objetivo neste trabalho é caracterizar a dinâmica celular (membrana + citoesqueleto). Para tanto foram obtidas células aderidas, em cultura, as quais exibiam diversos formatos. Através das análises de correlação temporal do contraste obtemos os tempos de relaxação das utuações na membrana. Para uma mesma célula foram encontrados diferentes tempos de relaxação na membrana celular, diferentemente dos resultados obtidos com células de outros vertebrados analisados no laboratório. Neste trabalho conseguimos relacionar o tempo de relaxação encontrado na membrana com a direção do movimento da célula, resultados preliminares mostram que a célula se move na direção da região da membrana que apresenta menor tempo de relaxação. Além disso, foram feitas análises da freqüência de batimento cardíaco fazendo a transformada de Fourier do sinal do batimento cardíaco do embrião de galinha durante o desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos mostram que em estágios iniciais do desenvolvimento a freqüência de batimento é aleatória e similar à freqüência das células do coração em cultura, os cardiomiócitos, tornando-se de nida com o desenvolvimento do embrião. Outro grande interesse neste trabalho é conseguir acompanhar o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionário. Para tanto, conseguimos obter o embrião em estágios no qual não apresentava vasos, e em estágios posteriores já vascularizado. Assim temos um sistema poderoso para estudar como ocorre o crescimento de vasos no tempo, durante o desenvolvimento embrionário. Palavras-chave:células
mesenquimais somáticas, desenvolvimento embrionário, MD
I
Abstract We use the defocusing microscopy, technique developed at laboratory, Physics of Biological Systems, for information on Embryonic Development. We study cell extracted from chicken embryos in the early stages of development, heartbeat and vessel growth in the embryo. We developed an extraction and culture procedure to obtain somatic mesenchymal cells applied our laboratory. Somatic mesenchymal cells will give rise to tissues and organs in embryo, our goal in this work is to characterize the cellular (membrane + cytoskeleton). Adherent cells were obtained in culture, which exhibited a variety of formats. Through the analysis of temporal correlation of the contrast of gray level we obtain the relaxation times of the uctuations in the membrane. For the same cell were found dierent times in the cell membrane, unlike the results obtained with cells of other vertebrates analyzed in the laboratory. Relate the relaxation time found in the membrane with the movement of the cell, preliminary results show that the cell moves toward the membrane region of least time. Also, tests were made of the frequency of heart rate by doing the Fourier transform of the signal from the heartbeat of the chicken embryo during embryonic development. The results show that in the early stages of developing the beat frequency is similar to the random frequency of heart cells in culture, cardiomyocytes, making it set to the developing embryo. We also get the embryo stages in which had no pots, and in later stages as vascularized. So we have a powerful system for studying how growth occurs in the time of vessels during embryonic development. Keywords:
somatic mesenchymal cells, Embryonic Development, Defocusing Microscopic
II
Sumário Resumo
I
Abstract
II
Lista de Figuras
IV
1 Introdução
1
2 Desenvolvimento Embrionário
5
2.1 Introdução Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
2.2 Formação do Embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
Gastrulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
Formação e Regressão da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . .
9
Folhetos Embrionários . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Mesoderme Paraxial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Somitogênese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.3 Formação do Coração Durante o Desenvolvimento Embrionário . . . . . . . . 16 Batimento Cardíaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3 Microscopia de Desfocalização
20
3.1 Campo Elétrico da Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Espaço Real e espaço dos vetores de onda . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Propagação do campo elétrico através de um objeto de fase. . . . . . . 23 3.2 Propagação do Campo Elétrico através do microscópio desfocalizado . . . . . 25
4 Montagem Experimental
28 III
IV
SUMÁRIO
4.1 Extraindo Embriões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 Protocolo de Extração de Embriões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 4.2 Extraindo células dos somitos do embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Porta-Amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Meio de cultura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Cultura de Células Mesenquimais Somáticas. . . . . . . . . . . . . . . 35 4.3 Cultura de Embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5 Resultados e Discussões
41
5.1 Células Mesenquimais Extraídas dos Somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Caracterizando a membrana das células mesenquimais somáticas. . . . 43 5.2 Frequência de Batimento Cardíaco Durante o Desenvolvimento Embrionário. . 48 5.3 Crescimento de vasos em embrião de galinha
(Gallus gallus). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
6 Conclusões
1
A Programa para auto-correlação temporal.
3
Referências Bibliográ cas
6
Lista de Figuras 2.1 Estágios Embrionários . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
2.2 Formação da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
2.3 Grastulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2.4 Regressão da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.5 Divisões da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.6 Regiões da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediária e Paraxial com os respectivos derivados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.7 Somitos no embrião: estágio 10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.8 Somitogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.9 Corte transversal da região pericardial do embrião em vários estágios . . . . . 16 2.10 Coração corte ventral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.1 Sistema de Coordenadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.2 Esboço de um objeto de fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 3.3 Esquema óptico do microscópio com óptica corrigida no in nito . . . . . . . . 25 4.1 Esboço da montagem experimental para obtenção dos embriões . . . . . . . . 31 4.2 Embrião no estagio 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 4.3 Montagem experimental para extração de material dos somitos . . . . . . . . 34 4.4 Montagem esquemática do microoscopio usado para obter lmes das células . 37 4.5 Montagem da caixa de acrílico sobre a Lupa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 5.1 Tempo de aderencia das Células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 5.2 Células aderidas a partir do terceiro dia de cultura . . . . . . . . . . . . . . . 43 5.3 Diferentes regiões da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 V
VI
LISTA DE FIGURAS
5.4 Correlação temporal das região da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . 45 5.5 Células aderidas extraídas dos somitos inicialmente, 2 e 1 horas depois . . . . 46 5.6 Correlação temporal para diferentes regiões das células observadas em intervalos de tempo de 1 a 2 horas
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.7 Sinal obtido da variação da interface do coração. . . . . . . . . . . . . . . . . 48 5.8 Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um cardiomiocito. . . . . 49 5.9 Espectro de potência pela freqüência em (Hz) para um embrião cultivado em vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 5.10 Freqüência do pico do espectro pela idade do embrião em: horas e número de somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 5.11 Embrião no estágio 10 em meio de cultura de Agar+Albumina. . . . . . . . . 52 5.12 Embrião no estágio 17 (60 horas), em meio de cultura de Agar+Albumina. . . 53 5.13 (a) Vasos do arco interno, na região da área pelucida em um embrião de 36 horas.(b) Vasos do arco interno em um embrião de 49 horas. . . . . . . . . . . 53 5.14 Embrião está no estágio 29, com o sistema vasculatório está bem avançado . . 54
Capítulo 1
Introdução
Nesta dissertação apresentaremos os primeiros trabalhos de uma nova linha de pesquisa em Desenvolvimento Embrionário que se inicia no Laboratório de Física de Sistemas Biológicos do Departamento de Física da UFMG. Essa linha no laboratório se iniciou a partir dos trabalhos do professor Ubirajara Agero na Universidade de Indiana EUA, com o professor James Glazier. Interessados em caracterizar as regiões que compõem embrião de galinha no estágio 10 através das propriedades elásticas. Eles aplicaram uma deformação na região de interesse e obtiveram diferentes valores para módulo de Young em cada região do embrião, a saber: área opaca, pelúcida, notocorda, somitos e tubo neural [1]. Atualmente temos realizado vários experimentos com embrião de galinha com o objetivo de extrair informações do comportamento celular, do batimento cardíaco e do crescimento de vasos durante o Desenvolvimento Embrionário. Interessados em analisar células extraídas dos embriões no estágio 10 (33-38) horas, desenvolvemos um protocolo de extração e cultura de células mesenquimais. As células mesenquimais possuem grande capacidade de diferenciação, são precursoras dos tecidos: conjuntivo, epitelial, ósseo, cartilaginoso e muscular, que são compostos de células já especializadas. 1
Capítulo 1.
Introdução
2
A MD é uma técnica ideal para estudar objetos de fase, células bem aderidas em uma lâmina são objetos de fase ideais para a aplicação da microscopia de desfocalização. Os objetos de fase são transparentes quando estão no foco, tornando-se visíveis quando desfocalizados por um microscópio óptico operando em campo claro. A desfocalização do objeto introduz uma diferença de fase entre a luz difratada e a luz não difratada que produz um contraste não nulo quando interferem no plano imagem. A Microscopia de Desfocalização agora com seus limites de validades bem de nidos é uma técnica ideal para extrair informações quantitativas da dinâmica que ocorre na membrana celular [2]. Usamos a Microscopia de Desfocalização (MD), para analisar a membrana das células extraídas dos embriões de galinha. O objetivo deste trabalho foi explorar as informações extraídas das células mesenquimais através da MD. Esta técnica já está bem estabelecida, e através dela conseguimos obter informações que caracteriza de forma e ciente a dinâmica que ocorre na membrana celular. Atualmente existem na literatura vários trabalhos que usam marcadores para identi car os tipos de células que se originam de células mesenquimais. Quando uma célula mesenquimal se diferencia em um broblasto, por exemplo, ocorre a produção de matriz extracelular que neste caso é o colágeno. Assim o marcador usado reage com uma proteína presente no colágeno mudando a coloração do meio. E para diferentes matrizes extracelulares produzidas existem diferentes marcadores com protocolos bem estabelecidos pela literatura, o que permite caracterizar de forma precisa os diferentes tipos de células originadas das células mesenquimais [3]. O próximo passo deste trabalho é veri car se através MD conseguimos caracterizar diferentes grupos de células mesenquimais. Para tanto precisaremos usar marcadores em nossa cultura, e assim para cada grupo separadamente seria estudado a dinâmica que ocorre na membrana celular. Resultados obtidos em [4][5] mostram que a MD é uma técnica muito robusta para caracterizar a dinâmica na membrana celular. No presente trabalho conseguimos através da MD e das análises de correlação temporal, do contraste em nivel de cinza, determinar o tempo de relaxação da membrana celular. Através deste tempo de relaxação podemos caracterizar as utuações na membrana como rápidas ou lentas. Para tanto, mapeamos a membrana das células mesenquimais e em cada região obtemos o tempo de relaxação temporal, o qual se mostrou bastante heterogêneo. Neste trabalho observamos que a heterogênedade do tempo de relaxação da membrana está
Capítulo 1.
Introdução
3
relacionada com o movimento da célula. Nossos experimentos con rmaram que as células sempre se movimentam na direção da membrana que possue menor tempo de relaxação temporal. Além disso, foram feitas análises da freqüência de batimento cardíaco e do crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionário. Resultados preliminares mostram que durante o desenvolvimento embrionário o coração do embrião de ne uma freqüência de batimento que tende a aumentar até atingir o valor do animal adulto. Inicialmente as contrações do coração são fracas e bastante aleátorias, com o desenvolvimento do embrião passam ser mais fortes e regulares. A vascularização do embrião inicia-se com a formação do coração, posteriormente de nem-se duas redes de vasos uma mais interna ao corpo do embrião, na região denominada por área pelúcida e a outra externa ao corpo, na região denominada por área opaca, na qual os vasos são mais visíveis. Conseguimos obter algumas fotos que mostram diferentes estágios do processo de vascularização. Nosso objetivo é conseguir acompanhar a criação de vasos no tempo. Conhecer a dinâmica do crescimento de vasos é muito interessante porque várias doenças são identi cadas pelo crescimento desordenado de vasos. E conhecendo este comportamento podemos fazer ensaios com possíveis inibidores à proliferação dos vasos. Nesta dissertação desenvolvemos vários protocolos de métodos experimentais para o estudo do embrião de galinha, e pretendemos que estes protocolos sejam utilizados no laboratório nos próximos anos. Esta dissertação está organizada da seguinte forma: Capítulo 1 é esta a introdução ao trabalho. No Capítulo 2 será apresentado o Desenvolvimento Embrionário, apresentando o desenvolvimento do embrião desde momento em que ele é formado ainda no oviducto (dentro da galinha) até nos estágios posteriores que nós estudamos. No Capítulo 3 será introduzida a técnica Microscopia de Desfocalização, mostrando suas aplicações e limites de validade. No Capítulo 4 será apresentado a montagem experimental e os protocolos de extração e cultura de células extraídas dos embriões, além do protocolo de cultura de embrião em vitro. No Capítulo 5 serão apresentados os resultados obtidos para utuações em células, batimento cardíaco, resultados preliminares da formação de vasos e a discussão dos resultados obtidos.
Capítulo 1.
Introdução
No Capítulo 6 serão apresentados as perspectivas e conclusões deste trabalho.
4
Capítulo 2
Desenvolvimento Embrionário
2.1
Introdução Geral
Neste capitulo faremos uma revisão básica dos termos envolvidos no desenvolvimento do embrião de galinha Gallus gallus. Não serão apresentadas discussões detalhadas sobre a biologia do desenvolvimento, pois o objetivo do presente capitulo é apenas abordar os fatos em ordem cronológica familiarizando o leitor com os termos que serão citados posteriormente. Descreveremos o desenvolvimento do embrião de galinha desde a fase inicial dos primeiros agregados celulares até a formação do coração. Os primeiros estágios do desenvolvimento de todos os vertebrados são muito parecidos, e os embriões de galinha em especial, devido à facilidade em obter, manipular e monitorar durante o desenvolvimento tem sido um modelo popular para estudos da formação embrionária ha muito tempo (mais de 2000 anos), desde Aristóteles, o qual estudou progressivamente os estágios da embriogênese abrindo ovos de galinha diariamente [6] [7] [8]. Na gura 2.1 estão apresentados todos os estágios de desenvolvimento do embrião de galinha [9]. Este é um trabalho pioneiro sendo um dos artigos da literatura de desenvolvimento 5
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
6
Figura 2.1: Estágios Embrionários. Retirado de [9].
embrionário mais citados, pois apresenta um mapeamento completo do desenvolvimento do embrião de galinha, desde o momento em que o ovo é eclodido, nasce da galinha, até o nascimento do embrião. A grande vantagem de trabalhar com embriões de galinha, é que o desenvolvimento embrionário em galinha é um processo bastante rápido. Nas primeiras 48 horas de incubação, o embrião se transforma de um disco de células para uma estrutura trilaminar, contendo três folhetos germinativos que vão dar origem às estruturas embrionárias [10]. Através da gura 2.1 conseguimos acompanhar de forma simpli cada a formação do embrião: entre os estágios H-H (1-3') o embrião é um disco com espessamento celular na futura região caudal, posteriormente o espessamento celular se alonga formando uma linha entre estágios H-H (3-4), e o disco passa a ter um formato oval. E entre estágios H-H (5-7) a linha regressa. Ao longo deste processo estruturas vão se formando e o embrião sofre uma torssão entre os estágios H-H (13-14), passando de uma estrutura em 2D para o espaço 3D. No estágio H-H 35 o feto estará completamente formado.
Capítulo 2.
2.2
Desenvolvimento Embrionário
7
Formação do Embrião
Nesta secção inicialmenete será introduzida uma de nição dos conceitos básicos da embriologia em galinha. Vamos apresentar o processo de formação do embrião de galinha Gallus
gallus a partir dos primeiros agregados celulares até a formação de estruturas mais complexas.
Oviducto: canal que inicia no ovário da galinha e segue até a cloaca, anus da galinha. Ovo: é uma célula, formada pela fecundação do óvulo da galinha pelo espermatozóide do galo. Durante e copula os espermatozóides do galo penetra pelo oviducto da galinha e fecunda o óvulo. O ovo galado, óvulo fecundado, ao descer pelo oviducto é revestido pela albumina, formando uma parede de revestimento, a clara, que vai proteger ovo de impactos mecânicos.
Vitelo: reserva de nutrientes do ovo, a gema propriamente dita. Clivagem: é um processo de sucessivas divisões da ciclatrícula, região ativa do ovo, esta região contém o citoplasma ativo do ovo recém ovulado ver gura 2.2.
Blastoderme: uma camada unidimensional de células. Formada pelo processo de sucessivas clivagens que ocorre na ciclatrícula. Esta região será de grande importância na formação do embrião. A blastoderme está localizada logo acima do vitelo.
Blastômeros: células lhas resultante de sucessivas divisões da ciclatura por mitose.
Figura 2.2: Formação da Blastoderme: (A) primeira clivagem. (B) Segunda e terceira clivagem. (C) Quarta segmentação formando os primeiros blastômeros. (D) O número de blastômeros aumentam rapidamente na região central, a ciclatrícula cresce e a passa a se chamar blastoderme. Retirado de [11]. A região da ciclatrícula cresce ocupando parte do vitelo e passa a se chamar blastoderme
Capítulo 2.
8
Desenvolvimento Embrionário
ou blastodisco. No momento que a blastoderme contém de 32 a 64 células inicia-se o processo de separação dos blastômeros centrais, que não tem contato com o vitelo, dos blastômeros periféricos, que tem contato com o vitelo, por uma fenda chamada de cavidade subgerminal, esta cavidade esta mostrada na gura 2.5 (A). O número das células na região central aumentam muito mais rápido e são menores que as células marginais. Assim a massa celular central e constituída por várias camadas de pequenas células acima da cavidade subgerminal. Na região periférica ocorrem clivagens horizontais que separam as células em camadas superiores, mas as células inferiores desta região ainda continuam em contato com o vitelo. Nesta fase é possível distinguir a blastoderme em duas regiões como mostra a gura 2.2.
Área pelúcida: formada pelos blastômeros centrais, encontra-se sobre a cavidade subgerminal. Como não há aderência desta área ao vitelo ela se apresenta transparente [11].
Área opaca: formada pelos blastômeros periféricos. Como esta área não se separa do vitelo em profundidade, tem um aspecto mais denso e se apresenta mais turva (ou opaca) [11]. Para se ter uma idéia dos tempos envolvidos no desenvolvimento da galinha, apresentaremos resumidamente o seu ciclo de vida. A galinha (Gallus gallus) vive em torno de sete anos. O desenvolvimento embrionário começa com as clivagens ainda no oviducto da galinha, formando a blastoderme que contém duas regiões bem de nidas, a área opaca e a área pelúcida. Posteriormente após ser eclodido e incubado inicia-se a Gastrulação, que vai dar origem a linha primitiva, no estágio H-H 14 começa a formação dos órgãos no embrião e após 21 dias de incubação o embrião está pronto para nascer.
Gastrulação Para prosseguir o desenvolvimento embrionário fora da galinha, o ovo deve ser incubado a 37, 500 C e mantido a uma umidade relativa de 50%. Nas primeiras horas de incubação inicia-
se o processo da gastrulação. No nal deste processo o germe do embrião estará formado pelos três folhetos germinativos, ectoderme, mesoderme e endoderme.
A gastrulação
consiste na migração das células do Epiblasto para o espaço entre o Epiblasto e Hipoblasto, como mostra a gura 2.3. Esta migração ocorrerá através da linha primitiva e da fosseta primitiva do nó de Hensen, que serão de nidas a seguir.
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
9
Figura 2.3: Gastrulação: consiste no deslocamento do nodulo de Hensen da região ventral para a região dorsal. Retirado de [11].
Formação e Regressão da Linha Primitiva Formação da linha primitiva: a maior característica da gastrulação em aves, anfíbios e mamíferos é a formação da linha primitiva. Nota-se um espessamento celular na região caudal que se alonga para a futura região da cabeça do embrião como mostra a gura 2.1 entre os estágios H-H (1-3'). A linha primitiva termina em uma zona mais brilhante, conhecida por nó de Hensen. Durante a formação da linha primitiva a blastoderme perde sua forma circular e alonga-se. A linha primitiva de ne o eixo do embrião e se estende da região posterior à anterior do embrião. As células migram entrando do lado dorsal, ao longo da futura região da coluna vertebral, e movem para o lado ventral, separando assim a porção esquerda da direita do embrião. As células convergem para formar a linha primitiva, e formam uma depressão dentro da linha. Esta depressão é chamada de sulco primitivo, através da qual células migram passando para parte interna da blastocole, cavidade entre o hipoblasto e epiblasto. Na região anterior da linha primitiva surge uma região com espessamento de células chamado de Nó de Hensen. No centro deste nó aparece uma depressão em forma de funil na qual as células podem passar para parte interna da blastocole.
Regresão da linha primitiva: agora começa uma nova fase da gastrulação, com a regressão da linha primitiva mostrado na gura 2.1 entre os estágios H-H (5-7). O nó de
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
10
Hensen desloca da futura região do célebro, na área pelúcida, para a posição mais posterior, futura região anal, veja a gura 2.4(A). Ao mover o nó de Hensen em direção posterior, o notocorda passa a cobrir a parte anterior começando no nível da futura região média do célebro, como mostra em 2.4(B). Pode-se observar a regressão da linha primitiva na gura 2.4(B), sinalizada pela linha grossa em vermelho, enquanto a linha preta na representa o aumento do notocorda. A gura 2.4(C) mostra o nó de Hensen, na extremidades da linha primitiva marcado com carbono, regredindo para a região posterior do embrião e simultaneamente observa-se a formação das estruturas que vão dar origem ao embrião.
Figura 2.4: Regressão da Linha Primitiva adaptação de [11]. (A) Crescimento da linha primitiva, alongando a região da aréa pelúcida e posteriormente a regressão da linha. (B) Regressão da linha primitiva e crescimento do notocorda, linha primitiva sinalizada pela linha grossa e a linha na representa o crescimento do notocorda. (C) Regressão da linha primitiva e o surgimento da prega cefálica e somitos durante este processo. O ponto marcado na extremidade da linha primitiva, o nódulo de Hensen, que regressa para a região posterior do embrião. Como conseqüência da seqüência pelo qual são formados a região da cabeça e notocorda, os embriões de aves e vertebrados em geral exibem um gradiente de desenvolvimento ânteroposterior que é atenuado em estágios de maior maturidade. Enquanto as células da porção
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
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posterior do embrião participam da gastrulação, as células no m da porção anterior estão começando a formar os órgãos. Tudo isso ocorre paralelamente a somitogênese, formação de blocos compactados de células, os somitos. Assim nos próximos dias de incubação o m anterior do embrião exibirá um desenvolvimento maior que o m posterior.
Folhetos Embrionários Grande parte das células centrais da blastoderme formaram o Epiblasto gura 2.5 (A). Outra parte destas células migraram para a cavidade subgerminal, formando arquipélagos celulares contendo de 5 a 20 células. Esse conjunto de vários arquipélagos celulares forma o hipoblasto primário, gura 2.5 (B). Na região posterior do embrião localiza-se o crescente de Koller, as células desse crescente migraram da região anterior para posterior ligando os conjuntos de células formando assim o hipoblasto secundário gura 2.5 (C).
Figura 2.5: (A)Formação do Epiblasto. (B)Formação do hipoblasto primário. (C)Formação do hipoblasto secundário. Retirado de [11]. O embrião forma-se inteiramente a partir do epiblasto, do qual se origina os três folhetos germinativos: ectoderme (ecto=externo), mesoderme (meso=meio), endoderme (endo=interno), aminion e mesoderme extra-embrionária. Enquanto o Hipoblasto dá origem ao saco vitelino. Posteriormente da Ectoderme se originam a pele, sistema nervoso e a crista neural. Da
Mesoderme se originam a notocorda, músculo rins e sangue. E da Endoderme se originam tubo digestivo, faringe e tubo respiratório.
Capítulo 2.
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A endoderme é formada pelas primeiras células a migrarem através do nó de Hensen, estas células estão marcadas em amarelo na gura 2.3. Dentro da bastocole as células do hipoblasto, em verde na 2.3, migram con nando as células da endoderme entre as células do epiblasto. As próximas células a entrarem na blastocole, através do nó de Hesen, assumem uma posição entre o endoderme e o epiblasto formando a mesoderme, células marcadas em rosa na gura 2.3. Enquanto as células presuntivas da mesoderme e endoderme estão movendo internamente, as percussoras da ectoderme proliferam no epiblasto. Além disso, as células da ectoderme migram ao redor da gema pelo epiblasto. A gema é cercada pelo ectoderme. A gastrulação em aves traça um fechamento, a ectoderma cerca a gema, a endoderme substituiu o Hipoblasto, e a mesoderme se posiciona entre estas duas regiões.
Mesoderme Paraxial. Nesta subsecção vamos apresentar a mesoderme Paraxial. O Ectoderme no estágio da neurulação do embrião pode ser dividida em cinco regiões, mesoderme intermediária, cordamesoderme, mesoderme paraxial, mesoderme lateral e tubo neural mostrado na gura 2.6.
Figura 2.6: Regiões da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediária e Paraxial com os respectivos derivados. Retirado de [11]. A mesoderme paraxial, é uma região que vai dar origem aos somitos, blocos de células do mesoderme em ambos os lados do tubo neural. As células da região que irão formar a cabeça e os somitos, que produzirão tecidos conectivos, a saber: osséo; músculo; cartilagem
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
13
e derme. A mesoderme intermediária, forma o sistema urogenital. A corda-mesoderme contém material que dará origem ao notocorda. A placa da mesoderme lateral dará origem ao coração, veias sanguíneas, células do sangue e sistema circulatório, bem como a linhagem da cavidade do corpo, além disso, formará membranas extra-embrionárias, importantes para transportar nutrientes no embrião. Uma das tarefas da gastrulação é criar a camada da mesoderme entre a endoderme e a ectoderme. A formação da mesoderme e órgãos da endoderme ocorrem simultaneamente à formação do tubo neural. O notocorda estende debaixo do tubo neural da base da cabeça até a cauda. Com a regressão da linha primitiva, as pregas neurais começam a se juntar ao centro embrião, a mesoderme paraxial se separa em blocos de células chamado somitos. Embora os somitos sejam estruturas transientes, elas são extremamente importantes na organização do padrão segmental dos embriões de vertebrados. Os somitos determinam o caminho de migração das células da crista neural e o eixo do nervo espinhal.
Somitogênese A somitogênese é o processo de formação dos somitos, massas celulares compactadas en leiradas imediatamente na lateral da dobra neural gura 2.7. Os somitos darão origem as células que formarão as vértebras e costelas, a derme da pele dorsal, o músculo esquelético das costas e os músculos esqueléticos da parede do corpo e membros. Primeira estrutura organizada metamericamente que aparece no embrião de galinha são os somitos. Estes se originam da divisão do mesoderme dorsal para formar blocos de massas celulares. A adição regular dos somitos durante o crescimento do embrião em idade faz com que o número de somitos seja um critério con ável para analisar o estagio de desenvolvimento. Embriões que tenham sido incubados por um dado número de horas encontram-se em estágios bastante diferentes, enquanto embriões com o mesmo número de somitos variam muito pouco entre si. Assim normalmente designamos o estágio do embrião com base no número de pares de somitos que ele tem formado. A palavra par usualmente é omitida, mas entendemos que um embrião de 6 somitos é um embrião de 6 pares de somitos [12]. Até agora tratamos do estágio de desenvolvimento do embrião em horas, porque ainda não tinha sido introduzido a somitogênese e sua importância para designar o estágio do embrião.
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
14
Figura 2.7: Em (A) está apresentado o embrião indenti cando a região dos somitos. Em (B) está mostrando um zoom dos somitos, massas celulares compactadas.
Componentes importantes da somitogenese são: periodicidade, epitelização, especi cação e diferenciação. Os primeiros somitos aparecem na porção anterior do tronco, e os novos somitos brotam do nal da mesoderme paraxial em intervalos regulares. A partir das 25 horas começam a se formar os primeiros pares de somitos e a cada 90 minutos surge um novo par e assim sucessivamente até o embrião estiver completamente desenvolvido com 52-somitos. Existe na literatura muitos trabalhos sobre os mecanismos que controlam a periodicidade na formação dos somitos, um agente chave é a expressão gênica [6] [13]. Apresentaremos um modelo para ilustrar como ocorre à divisão da mesoderme. É expresso na parte mais caudal da mesoderme não segmentada uma onda cíclica a cada 90 minutos metamerizando-a, como se fosse uma onda na praia que vai deixando conchas na areia como mostra a gura 2.8 [6]. A associação do processo de segmentação foi primeiramente reconhecido em embriões de galinha como ondas cíclicas expressas nas células da
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
15
mesoderme que estão relacionadas aos fatores de transcrição do gene c-hairy1[13]. Este gene é fortemente expressado na mesoderme pre-somática, onde mRNAs exibem ondas cíclicas de expressão as quais correspondem a periodicidade de formação de um somito a cada (90 min). O movimento aparente destas ondas é devido aos pulsos coordenados da expressão c-hairy1, não esta ligada ao deslocamento de células ao longo do eixo ântero-posterior tampouco com a propagação de um sinal. A expressão rítmica do c-hairy1 é uma propriedade autônoma da mesoderme paraxial funciona como um relógio oscilador. Este oscilador foi denominado de relógio de segmentação, pois controla a transcrição periódica de um grupo de genes, chamados genes cíclicos. Estes genes cíclicos, ativam e desativam a transcrição do c-hairy1 dentro de um processo auto- recursivo [6] [13]. Além disso, a expressão gênica está relacionada com a posição na qual o somito se separará da mesoderme não segmentada. O processo de diferenciação das células somáticas em estruturas mais complexas também envolve fatores de expressão gênica [13] [14].
Figura 2.8: Um modelo da Somitogênese determinando a segmentação horária
e a frente de onda: são caracterizados pelo FCF (Fator de crescimento de broblasto) este está marcado (lilás), e pela concentração de acido retinoíco (verde) [6]. A cada 90 min um novo par de somitos surge. A expressão gênica da onda cíclica é controlada pelo relógio oscilador de segmentação que esta marcado ao lado esquerdo do embrião (laranja). A linha preta marca o limite entre a mesoderme não segmentada (pre-somática) e a segmentada. Retirado de [6].
Capítulo 2.
2.3
Desenvolvimento Embrionário
16
Formação do Coração Durante o Desenvolvimento Embrionário
Nesta secção descreveremos a formação anatômica dos primeiros estágios do coração de galinha (Gallus gallus) acompanhada de sua função siologica. O coração é um dos primeiros órgãos a funcionar durante o desenvolvimento do embrião, nos embriões de galinha é possível acompanhar seu desenvolvimento em embriões cultivados in vitro. O coração é derivado da mesoderme, e é uma estrutura não pareada, mas surge de um primórdio pareado o qual é a primeira estrutura a estar extremamente separada de um dos dois lados na linha média gura 2.9.
Figura 2.9: Corte transversal da região pericardial do embrião em vários estágios de desenvolvimento mostrando a formação do coração. (A) Às 25 horas, (B) às 26 horas, (C) às 27 horas, (D) às 28 horas. Retirado de [11]. O coração origina-se da mesoderme lateral, na embriogênese esta camada se divide em duas, a camada mais interna se une à mesoderme formando a esplanctopleure e a mais externa à mesoderme formando o somatopleure, como mostra a gura 2.9 (A). Os primeiros clusters de células surgem internamente na esplanctopleure entre a camada da mesoderme e a endoderme como mostra gura 2.9 (A). Estes clusters de células formaram espessamentos que darão origem a estruturas tubulares, o primórdio do endocárdio, um par de estruturas tubulares delicados como mostra gura 2.9 (B), estas estruturas darão origem a linhagem endotelial do coração. Grande parte do espessamento original mesodérmico formará a parte lateral dos tubos como o primórdio do epicárdico, que está destinado a aumentar a parte de
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
17
revestimento externo do coração, e camadas musculares pesadas do coração como o miocárdio. Em seguida o primórdio do endocárdio, estruturas tubulares, ou tubo endocardial, vão se aproximando um do outro. Esse processo é concomitante ao fechamento do intestino gura 2.9 (C), todos os fenômenos aqui ocorrem sincronizadamente. E nalmente quando o embrião completa 29 horas os tubos se fundem formando um único tubo, o Endocárdio como mostra a gura 2.9 (D). A parte interna é o Endocárdio, a parte do meio é o Miocárdio e o revestimento externo posteriormente formará o Epicárdio.
Figura 2.10: (A) As primeiras migrações celulares para formar os tubos do coração, (B) tubos formados, (C) fusão dos tubos, (D) deslocamento do tubo resultante para a direita. A linha numerada (1-4) representada o corte da secção transversal da gura 2.9. Retirado de [12]. Analisando a formação do coração sob um plano ventral. Sob este plano é possível observar as células na região do primórdio do endocárdio formando um espessamento celular gura 2.10(A). Este espessamento dará origem às estruturas tubulares gura 2.10(B), estas estruturas tubulares se encontram primeiro separadas e localizadas ao lado da linha média. E posteriormente, quando estes tubos estão mais calibrados são aproximados um do outro gura 2.10(C). Em um momento posterior ocorre a fusão dos tubos formando o Endocárdio, e
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
18
o coração é deslocado para à direita. Através de um estudo cuidadoso das secções do coração foi descoberto à presença de uma geléia cardíaca entre o miocárdio e o endocárdio [12]. Em embriões vivos esta geléia aparece homogênea e tem uma função importante de prender o endocárdio ao miocárdio, e fazer com que se movam juntos sincronizadamente quando o coração começa a pulsar. É funcionalmente interessante não apenas como uma unidade mecânica do endocárdio e miocárdio durante estágios prematuros, mas, posteriormente ela servirá de substrato em que as células migrarão movendo e formando tecidos celulares bem organizados. As regiões fundamentais estão começando a ser formadas. No nal do desenvolvimento do coração em direção a seu ao seu despejamento nal serão formados: ventrículo, átrio, seios venosos e artérias troncosas. Às 33 horas de incubação, no estágio de 9-somitos, o coração está alargado e deslocado para a direita da linha média. Neste momento se iniciam as primeiras contrações. Das 36-38 horas, no estágio de 16 somitos, o sangue começa a circular. O Átrio e o ventrículo estão se estabelecendo. Além disso, parte do coração se encontra mais dobrado para a direita. E apartir do estágio H-H 14 veja na gura 2.1 o embrião encontra-se bem deslocado para à direita. Neste estágio o embrião passa de sua forma planar para a forma mais côncava. A função siológica do coração durante o desenvolvimento embrionário está diretamente relacionada ao processo de sua formação anatômica. A seguir veremos que a dinâmica das contrações está diretamente relacionada ao processo de formação do coração.
Batimento Cardíaco As contrações do coração vão se de nindo durante a formação do coração. Inicialmente os batimentos são aleatórios e irregulares e com o desenvolvimento do coração esta freqüência vai se tornando menos aleatória. A partir do quarto dia de incubação estes batimentos tornam-se mais regulares e provalvemente a freqüência de batimento do embrião já estará bem próximo de um individuo adulto (5 batimentos/s) [15] [16] [17][18].
Estágio 10 [33-38 horas]- 10 somitos. Durante este estágio começam as primeiras contrações do coração que tornam-se aparentes no nível da região ventricular, estas contrações são ambas irregulares e intermitentes. As contrções se iniciam bem antes do sangue começar a circular no embrião. Contrações regulares e circulação efetiva do sangue serão estabelecidas durante estágios posteriores do desenvolvimento [15].
Capítulo 2.
Desenvolvimento Embrionário
19
Estágio 11 [40-45 horas]-13 somitos. Durante este período as contrações cardíacas que inicialmente começaram na area ventricular tornam-se regulares [15].
Estágio 12 [45-49 horas]-16 somitos. Neste estágio o átrio está formado, e as batidas cardíacas passam a ser controladas pelo átrio, agora à uma taxa mais rápida que quando estavam com o controle do marca-passo ventricular. No m deste estágio, a circulação do sangue torna-se aparente na direção cefalica-caudal [15]. Assim no quarto dia de incubação o coração já esta completamente formado e os batimentos já são bem próximos de uma galinha adulta.
Capítulo 3
Microscopia de Desfocalização
Neste capítulo será apresentado a Microscopia de Desfocalização, técnica que começou a ser desenvolvida durante o doutorado do Professor Ubirajara Agero no laboratório de Física de Sistemas Biológicos da UFMG, com o Professor Oscar Nassif de Mesquita [4] [19] [5][20]. Ao estudarem estruturas nas membranas de macrófagos, células brancas que fazem parte do sistema imune, eles observaram que ao variar o foco as estruturas na membrana mudavam o contrate. A observação deste fenômeno levou ao desenvolvimento da técnica. Desde então tem-se feito vários trabalhos no nosso laboratório para mostrar a capacidade da técnica, torná-la mais robusta e disseminar sua aplicação no meio cientí co. Na dissertação do aluno Ulisses Moreira Silveira Andrade, investigou-se os limites da aproximação paraxial que foi utilizada no desenvolvimento do modelo teórico da técnica. Os resultados obtidos experimentalmente mostraram-se bastantes promissores comparados com os teóricos [2]. Para aplicar esta técnica é necessário apenas um microoscopio e um deslocador de alta precisão, no laboratório usamos um deslocador piezoelétrico, Digital Piezo Controller (PI E-710-3CD). Através da Microscopia de Desfocalização é possível obter informações quantitativas de objetos de fase, que outras técnicas ópticas não conseguem extrair. As membranas biológicas bem aderidas em um substrato são objetos ideais para aplicação da 20
Capítulo 3.
21
Microscopia de Desfocalização
Microscopia de Desfocalização pois se comportam como um objeto de fase.
Os objetos de fase são transparentes quando estão no foco, tornando-se visíveis quando desfocalizados por um microscópio óptico operando em campo claro. A desfocalização do objeto introduz uma diferença de fase entre a luz difratada e a luz não difratada que produz um contraste não nulo quando estas interferem no plano imagem. Devido a esta característica é difícil observar estes objetos no microscópio óptico, sendo necessário o uso de técnicas de contraste de fase. Uma das técnicas mais usadas é o contraste de fase descrita por Zernike em 1935. Nesta técnica a mudança na intensidade da imagem é proporcional a mudança de fase no objeto. Enquanto que na Desfocalização a intensidade local da imagem do objeto é proporcional a curvatura local. Esta técnica extrai informações físicas da membrana celular, pois a curvatura é um parâmetro importante na dinâmica de superfícies e a partir deste dado pode-se obter informações das atividades que ocorrem na célula. Grande parte dos biólogos que trabalham com técnicas tradicionais de contraste de fase não conseguem explorar muitas informações quantitativas da dinâmica que ocorre na membrana celular. Atualmente o laboratório tem colaborado bastante com biólogos que buscam obter maiores informações de membranas, procurando entender os processos dinâmicos que ali ocorrem. Aqui será esboçado um tratamento matemático desta técnica apenas apresentando-a. Pois um tratamento mais rigoroso e detalhado foi desenvolvido em trabalhos anteriores [20][2].
3.1
Campo Elétrico da Luz
~ r, t) de frequência, ω , e dependência harSupondo um campo elétrico monocromático E(~
mônica temporal, eiωt , que se propaga na direção do vetor de onda ~k, podemos escrever:
~ (~r, t) = E ~ (~r) eiωt . E
(3.1)
Substituindo a equação do campo elétrico 3.1 na equação de onda . ~ = µ ∇2 E
~ ∂2E . ∂t2
(3.2)
Capítulo 3.
Microscopia de Desfocalização
22
Obtém-se: ~ r)eiωt + ω 2 µE(~ ~ r)eiωt = 0. ∇2 E(~
Usando a relação: k =
ω υ
(3.3)
√ = ω µ obtém-se a equação ~ r) = 0. ~ r) + k 2 E(~ ∇2 E(~
(3.4)
A parte espacial do campo elétrico satisfaz a equação 3.4 que é conhecida por equação de Helmholtz.
Espaço Real e espaço dos vetores de onda Vamos trabalhar com campos elétricos escalares, que se propagam na direção do eixo z. Podemos tratar o sistema, que se encontra no espaço real em termos do espaço dos vetores de onda. A gura 3.1 apresenta estes espaços.
Figura 3.1: Coordenadas do Sistema de Referência: (a) No espaço real. (b) No espaço dos vetores de onda. Onde ~q é a projeção transversal de ~k no espaço dos vetores de onda e ρ~ é a projeção no plano xy de ~r. Retirado de [2]. É importante introduzir este conceito porque a seguir trataremos do per l do objeto de fase h(~ρ), este pode ser de nido no espaço dos vetores de onda, ~q aplicando a transformada de Fourier. Aplicando a transformada de Fourier: Z
∞
h(~q) = −∞
h(~ ρ)ei~q.~ρ dρ
(3.5)
Capítulo 3.
Microscopia de Desfocalização
23
Para obtermos h(~ρ) podemos aplicar a transformada inversa: Z
∞
h(~ ρ) =
h(~q)e−i~ρ.~qd~q
−∞
(3.6)
Propagação do campo elétrico através de um objeto de fase. Agora vamos propagar campo elétrico através de objetos de fase. Como descrito anteriormente, membranas celulares bem aderidas em um substrato se comportam como objetos de fase. Objetos de fase são aqueles que mudam a fase da luz incidente sem que ocorra perda de intensidade. A gura 3.2 apresenta um esboço de um campo elétrico atravessando um objeto de fase, que podemos pensar ser a região de uma célula dentro de um meio, separados pela membrana celular.
~ 0 é o campo elétrico incidente, h(~ Figura 3.2: Esboço de um objeto de fase. Onde E ρ) é a
amplitude do objeto , n1 e n2 são índices de refração do meio por onde o campo elétrico se propaga , ρ~ é o vetor posição no plano (x, y) perpendicular à direção z de propagação do campo elétrico. A variação da fase do campo elétrico no espaço livre, com índice de refração n1 , propagando por uma distância d é dada por: φ0 = n1 k0 d.
(3.7)
Considerando o objeto de fase, a fase introduzida é dada por: ϕφ(~ ρ) = n1 k0 (l + h(ρ)) + n2 k0 [d − (l + h(~ ρ))],
(3.8)
Capítulo 3.
24
Microscopia de Desfocalização
Assim, a diferença de fase é dada por: ∆φ(~ ρ)
(3.9)
= ϕφ(~ ρ ) − φ0 = (n1 − n2 )k0 (l − d) + (n1 − n2 )k0 h(~ ρ) = −∆nk0 (l − d) − ∆nk0 h(~ ρ) = constante + φ(~ ρ),
(3.10) Onde ∆n = n2 − n1 . Então, temos que o campo elétrico ao passar por um objeto de fase é dado por: (3.11)
~ ρ) = E0 ei∆φ(~ρ) . E(~
Retirando o termo contante da fase , pois esta não interfere nos cálculos e substituindo em 3.11 obtemos:
E(~ ρ) = E0 eiφ(~ρ) = E0 e−i∆nk0 h(~ρ) ,
(3.12)
onde E0 é o campo elétrico incidente. A equação 3.12 é uma aproximação local para o campo elétrico difratado e deixa de ser válida para componentes de Fourier de h(~ρ) com números de onda comparáveis ou maior que o número de onda da luz incidente no meio. Para φ(~ρ) << 1, o campo elétrico incidente da equação 3.12 é dado por: E(~ ρ) ≈ E0 [1 − iφ(~ ρ)] = E0 [1 + i∆nk0 h(~ ρ)] .
(3.13)
Como de nimos em 3.6, é possivel escrever E(~ρ) no espaço dos vetores de onda ~q. E o vetor ~q representa a ondulação na interface. Assim o campo elétrico ao atravessar um objeto de fase no espaço dos vetores de onda é dado por:
Z
∞
E(~q) = E0 1 + i∆nk0
h(~q)e −∞
−i~ ρ.~ q
d~q .
(3.14)
Capítulo 3.
3.2
Microscopia de Desfocalização
25
Propagação do Campo Elétrico através do microscópio desfocalizado
Nesta secção apresentaremos a propagação do campo elétrico através do microscópio desfocalizado. No microscópio com óptica corrigida no in nito, o objeto é colocado no foco da objetiva, assim a imagem é formada no in nito, por isso é necessário introduzir uma lente para que a imagem seja conjugada na ocular a qual é conhecida como lente de tubo. A gura 3.3 representa um esboço do sistema óptico utilizado no laboratório.
Figura 3.3: Esquema óptico do microscópio com óptica corrigida no in nito: S é a fonte de luz branca, L1 é a lente objetiva com distância focal f1 , L2 é a lente de tubo com distância focal f2 , O é o objeto que está no foco de L1 , d é a distância entre lentes, I é o plano imagem que está no plano focal de L2 . (a) Esboço do Microscópio. (b) Microscópio desfocalizado, é introduzido uma pequena desfocalização ∆f na distância focal da lente L1 , a imagem é desfocalizada no plano I. O termo
−k0 f1 kf2
que é o fator de magni cação do microscópio, e o sinal negativo signi ca
que a imagem é invertida. Para encontrar o campo elétrico ao passar pelo microscópio desfocalizado, é calculado
Capítulo 3.
26
Microscopia de Desfocalização
o campo após passar por cada elemento óptico como mostrado em [20][2]. O campo nal obtido ao passar pelo microscópio desfocalizado e levando se em conta essa desfocalização é dado por: Z ~0 E(~ ρ, ∆f ) = ceiβ(ρ ) E0 1 + i∆nk0
∞
∆f 2
h(~q)e−i~ρ.~qd~q)ei 2k q
−∞
Onde c =
1 i2π
q
(3.15)
k0 f1 kf2
E β(ρ~0 ) é dado por: k02 f1 f2 d 0 ~ β(ρ ) = k(f1 ∆f ) + k0 d + k0 f2 + 2 + ρ ~ − k0 k0 2f2 k
(3.16)
Vamos obter o contraste de fase de um objeto desfocalizado. O contraste é dado por: C(~ ρ, ∆f ) =
I(~ ρ, ∆f ) − I0 =0 I0
(3.17)
Obtendo a intensidade para um objeto desfocalizado: = |E(~ ρ, ∆f )|2 Z ∞ ∆f i ∆f q2 2 2 −i~ ρ.~ q i 2k 2 2k = c |E0 | 1 + i∆nk0 h(~q)e d~q e q − e Z ∞ −∞ ∆f 2 −i~ ρ.~ q q ) . = I0 1 − 2∆nk0 h(~q)e d~qsen( 2k −∞
I(~ ρ, ∆f )
(3.18) Substituindo 3.18 em 3.17 obtemos: Z
∞
−i~ ρ.~ q
C(~ ρ, ∆f ) = −2∆nk0
h(~q)e
d~qsen
−∞
O contraste é uma função oscilatória com frequência 2 temos: sen ∆f 2k q ≈=
∆f 2 2k q
q2 2k .
∆f 2 q 2k
.
(3.19)
Para pequenas desfocalizações
E a relação do contraste de fase torna-se: Z
∞
C(~ ρ, ∆f ) = −2∆nk0 −∞
∆f 2 q h(~q)e−i~ρ.~qd~q 2k
(3.20)
Como k = n2 k0 obtemos: Z C(~ ρ, ∆f )
= ∆nk0 ∆n = ∆f n2
∞
∆f 2 q h(~q)e−i~ρ.~qd~q n2 k0
−∞ Z ∞
q 2 h(~q)e−i~ρ.~qd~q
−∞
(3.21)
Capítulo 3.
Microscopia de Desfocalização
27
Portanto temos uma expressão para o contraste de fase da qual é possível obter características quantitativas de células aderidas em especial da dinâmica que ocorre nas membranas celulares. Para ∆f = 0 ⇔ microscópio não desfocalizado a equação do contraste torna-se: C(~ ρ, ∆f = 0) =
∆n ∆f n2
Z
∞
q 2 h(~q)e−i~ρ.~qd~q = 0.
−∞
Este resultado mostra que os objetos de fase não são visíveis quando estão no foco. A desfocalização introduz uma diferença de fase ∆f , entre a luz difratada e a não difratada que ao se interferirem no plano imagem produz um contraste diferente de zero, e assim é possível visualizar o objeto.
Capítulo 4
Montagem Experimental
Neste capítulo será apresentada toda a montagem experimental desenvolvida neste trabalho, bem como todos os protocolos de extração e cultura de embriões, além dos procedimentos usados pra se estabelecer a cultura de células extraídas dos embriões. Nesse trabalho foi possível adaptar os protocolos de extração e cultura de embrião existentes na literatura ao laboratório de Física de Sistemas Biológicos do Departamento de Física. Além de estabelecer um protolo de extração e cultura de células mesenquimais somáticas extraídas dos embriões em estágios prematuros.
4.1
Extraindo Embriões
Os embriões de galinha são obtidos de ovos fertilizados fornecidos pela empresa Rivelli. Utilizamos uma linhagem para frangos de corte do tipo Cobb Avian tipo 1. Usando uma incubadora que mantém o ambiente a 37 0 C e umidade de 50 % obtêm-se embriões de galinha em vários estágios de desenvolvimento. Os embriões são extraídos seguindo o protocolo descrito em [1], que explicitaremos com mais detalhes a seguir. 28
Capítulo 4.
Montagem Experimental
29
Protocolo de Extração de Embriões Material: • Incubadora que mantém o ambiente a 37 0 C e 50 % de umidade, a que utilizamos tem
capacidade para incubar 20 ovos. • Ovos fertilizados. • Papel ltro cortado em forma de anel. • Pratos petri fundo com 10cm de diâmetro. • Um aro de arame. • Tesoura ponta na. • Pinça metálica de ponta na. • PBS (do inglês
Phosphate-Buered Saline ) com pH de 7,4.
• Béquer de 1L.
Preparando PBS (Phosphate-Buered Saline). O PBS pH 7,4 é preparado a partir da diluição de duas soluções bases: solução doadora (D) e a solução aceitadora (A). Preparando a solução aceitadora: • Dissolver 5 mM de N a2 HP O4 (Fosfato de Sódio Dibásico Anidro) em 600 mL de H2 O
deionizada (DI). Um mol de N a2 HP O4 corresponde a m=141,96 g, assim a massa correspondente a 5 mM será m=426 mg. Preparando a solução doadora: • Dissolver 10 mM de N aH2 P O4 (Fosfato de Sódio Monobásico Anidro) em 500mL de H2 O DI. Um mol de N aH2 P O4 corresponde a m=137,99 mg, então a massa corre-
spondente a 10 mM será m=690 mg. Para obter o PBS de pH 7,4: 44,6 mL da solução doadora é díluída em 355,4 mL da solução aceitadora. Posteriormente acrescenta-se 3,27g de NaCl, o pH deverá ser medido
Capítulo 4.
Montagem Experimental
30
para a con rmação após o acréscimo de NaCl, pois o pH da solução será levemente alterado. A osmolaridade desta solução é aproximadamente 0.14M.
Procedimentos 1. Limpar os ovos com álcool 70%. 2. Para romper a casca do ovo: deve-se segurar o ovo horizontalmente na mesma posição retirado da incubadora, sobre o prato petri de 10 cm de diâmetro, abrir o ovo e remover a casca. Na maioria dos casos, a blastoderme estará posicionada na parte superior e aproximadamente na região central da gema. 3. Identi car a região onde está o embrião, esta região não será nítida nos primeiros estágios . 4. Retirar o excesso da clara com o aro de arame na região próxima ao embrião, com cuidado pra não destruir o embrião, pois este é muito frágil. É necessário retirar todo o excesso de clara para permitir uma boa adesão do papel ltro em forma de anel à membrana vitelina. 5. Colocar o anel sobre a membrana vitelina, de forma a cobrir a região onde o embrião se encontra. É importante que o anel esteja bem aderido a membrana para evitar que este despreenda da membrana durante o experimento. 6. Recortar com a tesoura a região ao redor do anel. 7. Retirar o anel de papel da superfície da gema com a pinça na, o anel deve conter em seu meio o embrião. Retirar o anel sempre obliquamente à superfície, para evitar que o embrião se depreenda do anel e que não ocorra acúmulo de gema. 8. Em um prato petri de 10 cm colocar PBS, lavar o embrião no PBS de forma a retirar todo o excesso de gema. Deixando assim a região em que o embrião se encontra totalmente transparente. Isso é importante porque facilitará a visualização do embrião na Lupa ou no microscópio. 9. Assim o embrião está pronto para ser cultivado ou para extrair material dos somitos. Sendo que para serem cultivados é necessário a produção de um meio de cultura
Capítulo 4.
Montagem Experimental
31
Figura 4.1: (a) Incubadora com 20 ovos. (b) Bancada preparada para extração dos embriões. (c) Os embriões sendo preparados para extração das células dos somitos. (d) Os embriões levados à Lupa para observar o batimento cardíaco e o crescimento de vasos. Agar+Albumina que será descrito posteriormente quando tratarmos de cultura de embrião. 10. O béquer será utilizado para colher o restante do ovo, o qual o embrião foi retirado. Em média conseguimos obter 75 % de embriões dos 20 ovos colocados na incubadora. No nal dos experimentos tínhamos o equivalente a 1L de material restante dos ovos. Imagens do processo de extração são mostradas na gura 4.1. É importante que todo material usado neste protocolo seja limpo com álcool etanol 70% e esterilizado. O processo de esterilização usado neste trabalho será descrito a seguir:
Esterilização
Capítulo 4.
Montagem Experimental
32
1. Levar o material ao microondas juntamente com um béquer de 1L de água e deixar por 4min. A água do béquer deve ser trocada à cada 4min. Este processo é repetido 4 vezes, que equivale deixar o material 16 minutos no microondas. Durante os 4min que a água permanece no microondas ela começa a entrar em ebulição, assim o sistema atinge uma temperatura próxima à 100 0 C. À esta temperatura grande parte das bactérias que conseguem sobreviver a temperatura ambiente morrem. É sempre importante entre um intervalo e outro manter a porta do microondas fechada. 2. Posteriormente todo o material deve permanecer na luz UV por 20 minutos para destruir o restante dos microorganismos.
4.2
Extraindo células dos somitos do embrião
Um dos primeiros padrões estruturados que surgem no embrião em desenvolvimento são os somitos. As células dos somitos ainda possuem grande capacidade de diferenciação, mas começam a apresentar alguma especialização com surgimento de epitélio nas bordas. Para extrair células dos embriões precisamos de um embrião que já tenha somitos desenvolvidos, entretanto como queremos obter parâmetros que caracterize células não especializadas, é necessário que o embrião se encontre em um estágio prematuro, ou seja, com pouca diferenciação celular. O embrião no estágio 10 atende estes requisitos segundo [9]. Para se obter o embrião no estagio 10 o ovo deve permanecer de (33-38) horas na incubadora a 37 o C e a 50 % de umidade. Como descrito no capitulo 2, neste estágio já houve a segmentação da mesoderme somática, e o embrião apresenta de 7 a 10 pares de somitos, mas seu sistema nervoso ainda encontra-se bastante prematuro. A região de interesse para a extração de células são os somitos mostrados na gura 4.2, a gura apresenta um embrião com 9 pares de somitos. O material removido dos somitos é extraído usando uma micropipeta com uma ponta de 15 µm a 20 µm de diâmetro. Construimos as pipetas com um puxador comercial de pipetas, Pipette Puller (CE-HEKA). Realizamos várias tentativas até encontrar os parâmetros que nos permitiram obter a pipeta com a ponta de dimensões desejadas. Desenvolvemos a montagem para conectar a micropipeta, por uma mangueira, à uma seringa e assim conseguir sugar o material dos somitos. A micropipeta esta ligada a um deslocador (x,y,z), o qual
Capítulo 4.
Montagem Experimental
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Figura 4.2: Embrião com 9 pares de somitos. Estão identi cadas acima as principais estruturas do embrião no estágio H-H 10 segundo [9]. Esta foto foi obtida com uma Lupa (modelo GWH10X-D OLYMPUS-JAPAN), calibração da Lupa 1pixel=0.007mm. permite escolher com bastante precisão o somito do qual será sugado o material 4.3. O material removido dos somitos é colocado em portas-amostra de acrílico com aproximadamente 0.5ml de meio de cultura RPMI 1640. Como segue os protocolos a seguir.
Porta-Amostras Para observar as células com objetiva de pequena distância de trabalho foi necessário desenvolver portas-amostra especiais os materiais e procedimentos estão descritos a seguir.
Material: • Reservatório de acrílico de 1,5ml. • Lamínulas de microscópio (CORNING). • Graxa de silicone para AUTO-VÁCUO. • Mistura de ÁLCOOL-ETER 50% de cada. • Papel de seda branco.
Capítulo 4.
Montagem Experimental
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Figura 4.3: Montagem Experimental. (a) Micropipeta acoplada por uma seringa a um deslocador (x,y,z). (b) Embrião após remover material de um somito. Todo procedimento abaixo foi realizado dentro do uxo laminar para evitar a contaminação das amostras.
Procedimentos 1. As lamínulas permanecem mergulhadas na mistura de ÁLCOOL-ETER 50% em um recipiente fechado de um dia para outro. Esta solução retira qualquer gordura da superfície das lamínulas permitindo ou facilitando a adesão das células 2. As lamínulas devem ser secadas usando papel de seda branco. 3. Os reservatórios de acrílico serão colados às lamínulas usando a graxa de silicone para auto-vácuo. Atualmente existe no mercado alguns porta-amostras, apropriados para cultivar células que posteriormente serão analisadas em objetivas de pequena distância de trabalho. Entretanto como não conseguimos adquirir estes porta-amostras em tempo abil à conclusão do mestrado desenvolvemos porta-amostras com reservatórios de acrilico, lamínulas e graxa de silicone. Inicialmente encontramos di culdade em conseguir células aderidas nos portaamostras fabricados, pois as colas usadas para aderir o reservatório de acrilico à lamínula eram tóxicas às células. Posteriormente testamos uma graxa de silicone para auto-vácuo e obtemos sucesso na cultura. Desde então obtemos células bem aderidas nos porta-amostras fabricados.
Capítulo 4.
Montagem Experimental
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Meio de cultura: As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com SFB (Soro Fetal Bovino), com proteínas inativadas. Foram usadas concentrações 10 % e 20 % de SFB.
Procedimentos para fazer 50 ml de meio de cultura: 1-Preparando 50ml de RPMI com 10% SFB. Após esterilizar todo material a ser utilizado na preparação do meio. Em um béquer de 80 ml é colocado 45 ml de RPMI, e em um béquer de 15 ml são medidos 5 ml de SFB que será então adicionado ao béquer de 80ml. Usamos antibiotico para evitar contaminação por bactérias, Penicilina (100Unidades/ml).
2-Preparando 50ml de RPMI com 20% SFB. Em um béquer de 80 ml é colocado 40 ml de RPMI, e em um béquer de 15 ml são medidos 10 ml de SFB que será então adicionado ao béquer de 80 ml. Todo este procedimento deverá ser realizado dentro de um ambiente esteril, a capela. Foi observado um maior número de células aderidas nas amostras que estavam com meio suplementado a 20% de SFB.
Cultura de Células Mesenquimais Somáticas. A cultura de células mesenquimais somáticas é obtida através do material removido dos somitos que será mantido em cultura com meio RPMI 1640. O cultivo de células é muito suscetível à contaminações. Assim, antes de iniciar o processo de colhimento de material dos somitos para ser colocado em cultura, todo material a ser utilizado na cultura deve estar previamente separado e esterilizado.
Material: • Material retirado dos somitos. • Portas-amostra de acrílico, esterilizados. • Meio de cultura. • Câmera de CO2 mantida a 370 C e com 5% de CO2 . • Placas petri de 10cm de diâmetro com tampas descartáveis. • Penicillina 1% da solução total.
Capítulo 4.
Montagem Experimental
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Procedimentos 1. O material retirado dos somitos deverá ser colocado no porta-amostra de acrílico e levado rapidamente à capela para evitar qualquer tipo de contaminação com o ambiente. O esquema de extração de material dos somitos é mostrado na gura 4.3-(a). 2. Acrescentar 1ml de meio de cultura RPMI 1640 ao reservatório de acrílico. 3. Os portas-amostra são colocados em placa petri, e levados a câmera de CO2 onde permaneceram de 2 a 3 dias. Cada placa de petri pode conter até dois portas-amostra. O meio de cultura deve ser trocado todos os dias para manter o meio sadio e evitar possíveis contaminações. As células realizam metabolismo rápido e consequentemente o pH do meio muda, conseguimos identi car a variação de pH pela mudança da coloração no meio de cultura. Quando os portas-amostra são colocadas na câmera de CO2 o meio contém uma coloração rósea e posteriormente quando as células iniciam o metabolismo o meio torna-se mais amarelo. Se ocorrer uma contaminação por fungo, por exemplo, o tom amarelado normalmente torna-se bastante escuro. Isso pode ocorrer durante a obtenção de células, e nesse caso as células devem ser descartadas e o procedimento para obtenção das células deve ser recomeçado do princípio. Para veri car se as células aderiram às lamínulas é necessário aguardar de 2 a 3 dias. Posteriormente é realizada uma lavagem nas amostras com meio de cultura suplementado com SBF, neste processo as células não aderidas são removidas da amostra. A amostra deverá ser levada do uxo para a montagem experimental da gura 4.4, normalmente tampamos a amostra com uma lamínula de microscópio previamente esterilizada para evitar contaminações.
Montagem Experimental Utilizamos a montagem mostrada no esquema da gura 4.4 para realizarmos os experimentos. A montagem é feita sobre um microscópio invertido (Nikon Eclipse TE300) com uma objetiva de imersão a óleo (CFI Plan Apochromat 60X oil) com aumento de 60X e abertura numérica 1,4. Para manter o sistema à 37 0 C, placas de cerâmicas são ligadas a um controlador de temperatura e funcionam como aquecedores. Toda a montagem experimental apresentada na
Capítulo 4.
Montagem Experimental
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Figura 4.4: Esboço da montagem experimental. A luz da lâmpada de tungstênio halógena passa por um condensador e ilumina a amostra. A amostra está entre duas placas de cerâmica que funcionam como aquecedores mantendo o ambiente a 37 0 C, estas são ligadas a um controlador de temperatura. A amostra é livre para deslocar em x, y, z usando um deslocador piezoelétrico, Digital Piezo Controller (PI E-710-3CD). As estruturas são visualizadas com uma objetiva de imersão a oléo com aumento de 60X, e as imagens são capturadas por uma camera CCD (UNIQ Vision lnc) e processadas por um computador. gura 4.4 é isolada por uma caixa de acrílico. Usamos um termômetro digital (EQUITHERM SERIE-27341) para veri car se a temperatura próximo as amostras permanece a 37 0 C. A imagem é obtida por uma câmera CCD (UNIQ Vision lnc) que está ligada ao computador. Para capturar os lmes usamos o programa X-CAP (EPIX). E para analisar os lmes usamos o ImageJ, software livre http://rsbweb.nih.gov/ij/.
4.3
Cultura de Embrião
Para analisar a freqüência do batimento cardíaco e o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionário desenvolvemos um sistema de cultura de embriões no Laboratório de Física de Sistemas Biológicos. Para tanto zemos uma adaptação do protocolo descrito em [21]. O meio de cultura Agar-Albumina, contém os nutrientes necessários para o embrião
Capítulo 4.
Montagem Experimental
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sobreviver até 36 horas in vitro.
Preparando meio de Cultura de embriões. Material: • 0.18g de Agar (HIMEDIA RM-666). • 30 ml de solução salina (0.791g de NaCl dissolvido em 100 ml de água destilada). • 0.6 ml de Penicilina (100Unidades/ml). • Placas petri de 35mm. • 2 Béquers de 100ml. • 30ml de clara na extraída de 8 ovos frescos. • Recipiente com grande área super cial, e com tampa, reservatório de porta-amostras.
Todos materiais utilizados neste protocolo devem ser submetidos ao processo de esterilização.
Procedimentos 1. Colocar 30 ml de salina em um béquer de 100 ml e levar a um aquecedor ou microondas. Quando a salina começar a entrar em ebulição deve-se adicionar 0.18g de Agar e devemos mexer até que o Agar esteja completamente dissolvido. Inicialmente a solução tem uma coloração turva e isso indica que o Agar ainda não está completamente dissolvido, quando o Agar esta completamente dissolvido a solução terá uma coloração transparente. 2. Extrair 30ml de clara na, parte mais líquida da clara, de 8 ovos frescos. 3. Aquecer a clara em banho-maria. Neste procedimento a água deve estar à temperatura menor ou igual à 50 0 C para evitar que as enzimas presentes na clara sejam desnaturadas, o que leva à perda da atividade biológica do meio. 4. A clara aquecida em banho-maria é adicionada no bequer contendo o Agar dissolvido em salina. É necessário adicionar a clara devagar para evitar a criação de bolhas na solução. As bolhas são indesejadas, pois atrapalham na obtenção dos lmes.
Capítulo 4.
Montagem Experimental
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5. Forrar com papel toalha o reservatório de porta-amostras e molhar para manter o ambiente úmido, evitando assim que o meio resseque. 6. A solução é distribuida em placas petri de 35 mm, mantendo à temperatura ambiente o meio adquire uma consistência de gelatina. Após o embrião ser extraído, no estágio de interesse, de acordo com o protocolo descrito acima e colocado em meio de cultura. O embrião é levado à montagem experimental apresentada na gura 4.5 para obtenção dos lmes, que posteriormente serão analisados.
Montagem Experimental A montagem experimental apresentada na gura 4.5 foi desenvolvida para obter lmes do embrião in vitro. A montagem é feita sobre uma Lupa, modelo GWH10X-D OLYMPUSJAPAN. Esta montagem foi realizada com a colaboração dos funcionários da o cina mecânica e elétrica do Departamento de Física da UFMG.
Figura 4.5: Montagem da caixa de acrílico sobre a Lupa, internamente a caixa esta acoplada a uma resistência que funciona como um aquecedor para manter o sistema a 37 0 . Para manter o sistema à 37 0 C e à umidade de 50 % montamos uma caixa de acrílico com um orifício central, onde a amostra será colocada. Ao redor do orifício na caixa de acrílico foi acoplada uma resistência que funciona como um aquecedor em imersão à água. A água umedece a região ao redor da amostra, mantendo assim o ambiente nas condições necessárias à sobrevivência do embrião in vitro. Entretanto, como a lupa está localizada logo acima da
Capítulo 4.
Montagem Experimental
40
caixa, a imagem do embrião embaçava devido a grande umidade do ambiente, sendo assim, foi necessário retirar a água do sistema. A resistência usada era ideal para funcionar imersa à água, ao retirar a água do sistema ela superaquecia o ambiente. Assim foi necessário ligar ao sistema um transformador, que diminuiu a tensão da resistência. Desta forma foi possível manter o sistema a uma temperatura constante próximo aos 370 C. Um termômetro digital foi usado para medir a temperatura próximo as amostras, e veri car a estabilidade desta temperatura. Atualmente já instalamos controladores de temperatura para esta montagem, o que deverá melhorar nosso sistema experimental. A imagem é obtida por uma câmera CCD, a captura é feita usando o X-CAP e para analisar dos lmes usamos o Imagej, mesmo sistema descrito anteriormente para observar células.
Capítulo 5
Resultados e Discussões
Neste capitulo, em primeiro lugar, serão apresentados os resultados obtidos usando a Microscopia de Desfocalização, para analisar o tempo de relaxação da membrana das células mesenquimais somáticas. Posteriormente, serão discutidos os resultados da freqüência de batimento cardíaco e a criação de vasos durante o desenvolvimento embrionário.
5.1
Células Mesenquimais Extraídas dos Somitos
Nas primeiras tentativas para se estabelecer o protocolo de extração, cultura e o tempo de aderência à lamínula das células extraídas dos somitos, células mesenquimais somáticas, usamos uma objetiva de 40X para observar as amostras, pois o porta-amostra, placa-petri, era bastante espesso e não conseguimos analisar as amostras com objetiva 60X, que possui pequena distância de trabalho. 41
Capítulo 5.
Resultados e Discussões
42
Para estabelecer o tempo de aderência das células à lamínula as amostras foram levadas ao microscópio a partir do primeiro dia após a extração. A gura 5.1 apresenta as amostras observadas após o primeiro, segundo e terceiro dia de cultura.
Figura 5.1: (a) Primeiro dia após a extração, di cilmente se observa células aderidas. (b) Segundo dia após a extração, poucas células aderidas. (c) Terceiro dia após a extração, maior quantidade de células aderidas. Usualmente células de cultura necessitam de algumas horas para aderirem ao substrato mas como podemos observar na gura 5.1, apenas após o segundo e terceiro dia que o material permanece em cultura é possível observar células aderidas à lamínula. Em poucas amostras foram observados células aderidas no segundo dia de cultura, enquanto o maior número de células aderidas em 75% das amostras é observado a partir do terceiro dia de cultura. Foram testadas concentrações diferentes de SFB (Soro Fetal bovino) 10% e 20% da solução total de meio de cultura RPMI 1640. Para ambas concentrações foram observadas células aderidas, entretanto foi observado um número maior de células aderidas para as amostras com 20% de SFB. Após estabelecer o protocolo de extração, cultura e o tempo de aderência das células à laminula, a proxima etapa deste trabalho foi conseguir observar células com uma objetiva de maior aumento, 60X. A distância de trabalho da objetiva de 60X é pequena, assim foi necessário desenvolver porta-amostras de acrílico, cubetas de acrílico aderidos com uma graxa de silicone à laminulas de microscópio, e com estes porta-amostras foi possível analisar as células em uma objetiva de maior aumento. A gura 5.2 apresenta células extraídas dos somitos desfocalizadas de aproximadamente 1, 5µm, mantidas em cultura com 20% de SFB e com mesmo período de incubação na câmera
de CO2 , entretanto estas células exibem formatos bem diferentes. Para fazer uma caracteri-
Capítulo 5.
Resultados e Discussões
43
zação mais rigorosa destas células seria necessário usarmos marcadores, através destes seria possivel detectar quais os tipos de células presentes nas amostras. Entretanto neste trabalho o objetivo principal foi obter parâmetros quantitativos da dinâmica na membrana celular, através dos quais conseguiriamos caracterizar o comportamento de uma célula.
Figura 5.2: Células extraídas dos somitos e bem aderidas na lamínula. Esta gura apresenta as células a partir do terceiro dia, do qual o material extraído dos somitos permaneceu bem aderido em cultura.
Caracterizando a membrana das células mesenquimais somáticas. Para caracterizar as células foi obtido o tempo de relaxação da membrana. Para isto foram feitas analises de correlação temporal do contraste de lmes digitalizados. A gura 5.3 apresenta uma célula que exibe duas regiões com comportamentos diferentes. A seta indica a direção de movimento de cada região da membrana. Os tempos de correlação temporal foram obtidos a partir de um lme de 10 minutos capturado pelo programa X-CAP(EPIX) e processado usando um plugin do Imagej, Correlação
Temporal Média Pixel segue em Anexo. Através deste plugin obtemos as curvas correlação temporal para o contraste, que podem ser ajustadas pela equação 5.1, que apresenta um decaimento exponencial simples.
t C(~r, t0 ) hC(0)C(t)i = (∆n∆f )2 k 2 e− τ .
(5.1)
Onde ~r é a distância pixel a pixel, t é o tempo entre um pixel e o pixel de referência. ∆n é a diferença dos índices de refração entre o meio e o objeto de fase, as células. ∆f
Capítulo 5.
Resultados e Discussões
44
Figura 5.3: Através da correlação temporal encontramos resultados diferentes para diferentes regiões da membrana celular. Nesta gura estão identi cadas duas regiões 1 e 2 que exibem comportametos diferentes. é a desfocalização introduzida na imagem, e é esta desfocalização que gera a diferença de fase, que nos permite observar o objeto como descrito no capitulo 3. O termo k2 é a curvatura local da membrana. Para caracterizar o tempo de relaxação da membrana foi feito um mapeamento em toda membrana celular e obtemos resultados diferentes para regiões diferentes, o grá co 5.4(a) mostra o tempo de relaxação característico para a região que apresenta maior motilidade, região 1 sinalizada na gura 5.3. Obtemos também o tempo de relaxação da região da membrana que apresenta menor motilidade, região 2 sinalizada na gura 5.3. Usualmente as células de vertebrados estudadas no laboratório como macrófagos e broblastos apresentam um comportamento isotropico em toda membrana celular, bem diferente do comportamento apresentado pelas células mesenquimais extraídas dos somitos. Nos grá cos 5.4(a) e 5.4(b) os pontos experimentais estam bem ajustados à uma exponencial simples, equação 5.1, através do ajuste da curva obtemos um tempo de relaxação para a região de menor motilidade e outro para a região de maior motilidade. O tempo de relaxação da região de maior motilidade é menor que o tempo da região de menor motilidade. A membrana celular das células mesenquimais somáticas não apresentava um tempo de relaxação homogêneo, assim foi necessário fazer novos experimentos, nos quais fosse possivel
Capítulo 5.
45
Resultados e Discussões
(a)
(b)
Figura 5.4: Tempo de relaxação obtido do ajuste da equação 5.1 de autocorrelacção temporal do contraste em nivel de cinza para as regiões de: a)Maior motilidade, menor tempo de relaxação obtido foi τ = (6.6 ± 0.1)s. b)Menor motilidade, maior tempo de relaxação obtido foi τ = (17 ± 3)s. acompanhar celo comportamento celulra por um longo tempo. Além disso, obtemos o tempo de relaxação em cada região da membrana para lmes curtos. Como mostrado na gura 5.3 para o lme curto podemos observar a membrana aderindo em uma direção e desaderindo na direção oposta.Então, nós monitoramos a célula por um longo tempo, a m de analisar o comportamento de células com diferentes tempos de relaxação obtidos em membrana. Os resultados são muito interessantes durante um lme de (1-2) horas é possível ver o deslocamento de células, como mostrado na gura 5.3.
As células mesenquimais são bastante invasivas, pois elas vão se deslocando pelo embrião, diferenciando e montando os tecidos [22]. Além disso, estas células tem características bastante semelhantes às células cancerígenas [23]. Sendo assim é esperado que a dinâmica na membrana celular seja diferente das células de vertebrados já analisadas no laboratório. A partir da observação dos lmes veri cou-se que as regiões das células apresentavam dinâmicas diferentes. Algumas partes da membrana celular estão aderindo em uma direção da lamínula enquanto outras estavam desaderindo em outra região. Para relacionar o tempo de relaxação da membrana com o movimento da célula foram feitos lmes de longa duração
Capítulo 5.
Resultados e Discussões
46
com 1 e 2 horas. A gura 5.5 apresenta uma foto inicial do lme de 1 e 2 horas, e uma foto no nal do lme mostrando o deslocamento da célula no intervalo de tempo analisado. Com os lmes longos foi possível acompanhar o comportamento da célula em um tempo maior, observar a direção do deslocamento da célula, enquanto que os lmes curtos de 10min foram obtidos para analisar o tempo de relaxação da membrana celular.
Figura 5.5: Fotos de células aderidas extraídas dos somitos inicialmente, 2 e 1 horas depois, as setas na região 1 indicam as regiões de maior motilidade, menor tempo de relaxação temporal. As setas na região 2 indicam as regiões de menor motilidade, maior tempo de relaxação temporal. A seta GRANDE indica a direção do movimento da célula. Novamente encontramos o tempo de relaxação em toda membrana e os resultados obtidos mostram que o tempo de relaxação é menor na região para qual o movimento da célula está direcionado. Os grá cos 5.6 e 5.6 apresentam os tempos de relaxação, obtidos nas regiões de maior motilidade da membrana e de menor motilidade respectivamente. Os lmes mostram uma região da membrana espalhando e aderindoem uma direção da lamínula (região com menor tempo de relaxação) enquanto o maior tempo de relaxação da membrana está na região contraria à direção do movimento da célula. Os resultados desta análise mostraram que as células mesenquimias somáticas, extraídas dos somitos, exibem comportamentos diferentes na membrana celular. Para caracterizar esta
Capítulo 5.
47
Resultados e Discussões
(a)
(b)
Figura 5.6: Grá cos de correlação temporal do contrate em nivel de cinza ajustado com a equação 5.1 para diferentes regiões das células observadas em intervalos de tempo de 1 a 2 horas. No grá co a) O tempo de relaxação obtido foi τ = 7 ± 2s para a região de maior motilidade. No grá co b) o tempo de relaxação obtido foi τ= 20 ± 2s para a região de menor motilidade.
diferença, analisamos o tempo de relaxação da membrana, o qual é bastante heterogêneo. Os tempos obtidos foram: da ordem de τ = 7 ± 2s nas regiões de maior motilidade e da ordem de τ= 20 ± 2s nas regiões de menor motilidade. Associando o tempo de relaxação da membrana com o movimento da célula obtemos um resultado bastante consistente. As análises mostram que as regiões na qual encontramos o menor tempo de relaxação é a região de maior motilidade da membrana celular. Enquanto que na região na qual encontramos o maior tempo de relaxação da membrana a molitidade é menor. Assim podemos a rmar que a célula sinaliza a direção do seu movimento, ou seja a célula sempre se move na direção da região de maior motilidade. Precisamos agora obter uma estatística maior para comprovar de nitivamente nossos resultados. Um outro fator importante que podemos explorar nos próximos experimentos é usar marcadores de células, com estes é possível analisar se um mesmo grupo de células tem comportamentos semelhantes. Em nossas amostras tinhamos grupos variados de células, algumas apresentaram grande motilidade analisadas em um tempo maior enquanto outras cavam completamente paradas.
Capítulo 5.
5.2
Resultados e Discussões
48
Frequência de Batimento Cardíaco Durante o Desenvolvimento Embrionário.
Nesta seção será apresentado o comportamento da freqüência de batimento cardíaco do embrião de galinha(Gallus gallus), cultivado in vitro em meio de Agar + albumina durante o desenvolvimento embrionário. A freqüência de batimento cardíaco começa irregular e vai se de nindo durante o desenvolvimento embrionário, as primeiras contrações começam quando os embriões se encontram no estágio 10 (33-38 horas). Aqui vamos apresentar também resultados encontrados para a freqüência de batimento de cardiomiócitos em cultura, células do coração para comparação. Para obter a freqüência de batimento foram feitos lmes de 900 frames durante 60 segundos. Foram feitos lmes dos corações de embriões extraídos de acordo com o protocolo descrito 4. Usamos o plugin, Mouse Listener (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/mouselistener.html) para capturar a posição (x,y) da interface do coração. A posição x é mantida como uma posição xa enquanto a componente y desloca a medida que o coração se contrai nos 900 frames do lme. Assim obtemos o sinal das contrações, variação da componente y, do coração durante um minuto, a cada intervalo de uma hora. A gura 5.7 apresenta um exemplo do sinal obtido das contrações do coração. Usamos o programa Mathcad (PTC software) para fazer a transformada de Fourier do sinal. Inserimos a posição da interface do coração e o tempo para obter o espectro de potência pela freqüência em (Hz).
Figura 5.7: (a) Sinal obtido da variação da interface do coração, posição y, mostrando um zoom em uma região.
Capítulo 5.
Resultados e Discussões
49
Apresentaremos no grá co 5.8, o resultado do espectro de potência pela frequência em (Hz) de um cardiomiocito, célula do coração, para comparação com as contrações nos primeiros estágios de desenvolvimento embrionário
Figura 5.8: Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um cardiomiocito, célula do coração de camundongo de cultura primária. Os embriões foram cultivados in vitro e acompanhamos as contrações ao longo de algumas horas para obter os espectros de potência. A partir do sinal apresentado na gura 5.7, obtém-se a transformada de Fourier das contrações do coração. A gura 5.9 apresenta o espectro de potência pela freqüência em (Hz). Inicialmente o espectro é bastante aleatório, similar ao comportamento do espectro obtido para o cardiomiocito apresentado no grá co 5.8, e posteriormente observa-se a de nição de um pico em uma determinada frequência de batimento. O grá co 5.10(a) apresenta os resultados obtidos para dois embriões cultivados in vitro. Apresentaremos a frequência do maior pico em função da idade do embrião em horas. Os pontos apresentam um comportamento bastante interessante, inicialmente a frequência de batimento é pequena e vai aumentando com a idade do embrião. Espera-se que esta curva atinja um ponto de saturação quando a freqüência de batimento cardíaco do embrião estiver de nida, esse tempo é da ordem de 9 dias. Como discutido no capítulo 2, o número de somitos é um parâmetro ideal para indicar o estágio embrionário, a idade do embrião que se desenvolve in vitro, assim o grá co 5.10(b) apresenta a freqüência do batimento cardíaco pelo número de somitos. Os resultados apresentados no grágico 5.10(b) foram obtidos para dois embriões cultivados in vitro. Apesar
Capítulo 5.
Resultados e Discussões
50
Figura 5.9: Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um embrião cultivado em vitro a partir das 36hs ate 49hs. do grá co 5.10(b) ter poucos pontos seu comportamento é similar ao do grá co 5.10(a), conseguimos obter um comportamento padrão que descreve a frequência de batimento do coração de galinha nos primeiros estágios do desenvolvimento embrionário. Estes resultados são muito interressantes, entretanto não são inéditos, quando iniciamos o trabalho sobre a freqüência de batimento cardíaco procuramos na literatura trabalhos relacionados e não encontramos, entretanto ao fazer a revisão bibliográ ca mais rigorosa, após obter estes resultados foram encontrados alguns trabalhos antigos, publicados em livros de periódicos. Desde 1932 existem pesquisadores, investigando a freqüência de batimento do coração de galinha durante o desenvolvimento embrionário. No artigo de 1932 [24] foi investigado a freqüência de batimento cardíaco do coração de galinha (Gallus gallus) durante o desenvolvimento embrionário, desde as primeiras contrações do coração até o momento
Capítulo 5.
51
Resultados e Discussões
(a)
(b)
Figura 5.10: Freqüência do pico do espectro obtido através da Transformada de Fourier pela idade do embrião em: horas e número de somitos a)Idade do embrião em Horas. b)Idade do embrião em número de somitos em que o embrião nasce. Neste artigo é apresentado um grá co das batidas do coração em um minuto pela idade do embrião em horas. Inicialmente o grá co tem um comportamento exponencial similar aos resultados que obtemos nesta dissertação, e a partir do nono dia de incubação a curva satura até o momento do nascimento. Além disso, no artigo [24] foi analisado a freqüência de batimento do coração de galinha para machos e fêmeas e os resultados obtidos mostram que não ha diferença signi cativa entre as freqüências de batimentos de ambos sexos. Em outro artigo de 1967 [25], foi feito uma análise da freqüência de batimento cardíaco do coração de galinha (Gallus gallus) pela idade do embrião em horas por dois métodos diferentes, um método não invasivo (embrião não é exposto ao ambiente), e outro invasivo (embrião é exposto ao ambiente). Os resultados mostram que o comportamento da curva em ambos casos é o mesmo, entretanto, análises dos batimentos usando o método invasivo mostram-se menores comparadas com os resultados dos batimentos do método não invasivo. Em todos os trabalhos citados, a frequência de batimento inicialmente tem um comportemento exponencial e posteriormente atinge um patamar de saturação. Portanto, os resultados da literatura comprovam o comportamento exponencial para a frequência de batimento cárdico que obtemos neste trabalho nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário. Ainda assim, esperamos que nosso método seja útil para identi car parâmetros importantes que levam o coração a iniciar seu batimento, principalmente quando comparamos esses resultados com cultura de cardiomiócitos.
Capítulo 5.
5.3
Resultados e Discussões
52
Crescimento de vasos em embrião de galinha
(Gallus gallus). O sistema circulatório é muito importante no desenvolvimento embrionário, sua tarefa é complicada porque além de crescer e ser continuamente remodelado para acompanhar o crescimento global do embrião, ele deve permanecer totalmente funcional para suprir as necessidades das células embrionárias desde o início do desenvolvimento. Além disso, é um modelo interessante para se estudar e entender o processo de formação de vasos, que é um ponto de partida para se estudar doenças como o câncer, que induz regiões irrigadas de vasos sanguíneos. Sendo assim, pretendemos usar nosso sistema para estudar a formação dos vasos, nesta seção será apresentado algumas fotos extraídas dos embriões mantidos na incubadora. A gura 5.11 apresenta um embrião no estágio 10, este embrião apresenta poucas estruturas do sistema vasculatório. Não conseguimos identi car nenhum vaso na area opaca e é possível identi car os primeiros vasos que estão se formando na região da área pelucida, região interna do embrião.
Figura 5.11: Embrião no estágio 10 em meio de cultura de Agar+Albumina. A primeira e mais importante estrutura do sistema vascular é o coração que analisamos anteriormente. As estruturas tubulares que se fundem formando o coração estudado no capitulo 2, darão origem aos primeiros grandes vasos do sistema vasculatório. A circulação no embrião de galinha pode ser dividida em circulação de dois arcos distintos sendo que o coração
Capítulo 5.
Resultados e Discussões
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é uma estrutura comum e está localizado no centro. Um arco completamente circulatório é estabelecido internamente com o corpo do embrião. E um segundo arco determina veias localizadas nas membranas extra-embrionárias envolvendo a gema. As veias vitelinas se comunicam com o coração por meio de veias que atravessam o corpo embrionário [12].
Figura 5.12: Embrião no estágio 17 (60 horas), em meio de cultura de Agar+Albumina. Nesta gura está apresentando os vasos na região da área opaca (são vasos mais calibrados), e os vasos na região da área pelucida (vasos mais nos). Na gura 5.12 conseguimos observar que o sistema vascular do embrião está em um estágio bem avançado, as duas arterias principais já estão formadas e a região da area opaca encontra-se completamente vascularizada.
Figura 5.13: (a) Vasos do arco interno, na região da área pelucida em um embrião de 36 horas.(b) Vasos do arco interno em um embrião de 49 horas.
Capítulo 5.
Resultados e Discussões
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A seguir apresentaremos na gura5.14 um embrião extraído no sexto dia de incubação. Em (A) está apresentado o embrião sobre a super cíe do ovo identi cando as regiões 1 e 2. As regiões 1 e 2 são imagens extraídas das rami cações dos vasos no embrião.
Figura 5.14: Embrião no estágio 29, neste estágio o sistema vasculatório está bem avançado e começa envolver toda a superfície do ovo. Na foto (A) do embrião sobre ovo está identi cado as regiões 1 e 2, estas regiões são mostradas as imagens obtidas pela lupa. Em 1 está apresentado as rami cações das extremidades dos vasos, e em 2 é apresentado o tronco do qual se origina as rami cações. Com as fotos obtidas oberva-se que o crescimento de vasos no embrião de galinha é um processo que pode ser acompanhado, pois ocorre na ordem de horas . Apesar dos embriões de galinha não apresentar um desenvolvimento bem característico, em nossos experimentos conseguimos observar que os primeiros vasos se formam no embrião apartir das 36 horas de incubação. E segundo [9] as primeiras vesiculas ópticas ocorrem entre os estágios 9(29-33 horas) e 10(33-38 horas).Um dos próximos objetivos deste trabalho é acompanhar a formação dos vasos no tempo. Queremos acompanhar a evolução no tempo de um embrião no estágio 10 para o estagio 29 por exemplo. A gura 5.13 mostra que estamos progredindo bastante
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Resultados e Discussões
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para observar esse fenômeno em um embrião. Para tanto precisamos aprimorar o sistema de observação do embrião in vitro no microscópio.
Capítulo 6
Conclusões Neste trabalho, desenvolvemos protocolos, também como toda montagem experimental, para extração e cultura de células mesenquimais somáticas e de embriões de galinha
Gallus gallus adaptados ao Laboratório de Física de Sistemas Biológicos do Departamento de Física da UFMG. Usando a Microscopia de Desfocalização foi possível observar células mesenquimais somáticas aderidas em substrato desfocalizadas aproximadamente 1,5µm, após o segundo dia de cultura. A partir das análises de correlação temporal do contraste obtemos os tempos de relaxação de diferentes regiões na membrana celular. Os tempos de relaxação obtidos foram bastante heterogêneos. Para relacionar o tempo de relaxação da membrana com o comportamento das células foram capturados lmes longos de (1-2) horas. Os resultados indicam que a célula apresenta uma sinalização do seu movimento. Em nossas análises, as células sempre se movimentam em direção a região da membrana que apresenta menor tempo de relaxação. Além disso, temos grande interesse em analisar o tempo de relaxação da membrana durante o processo de diferenciação celular. Células mesenquimais têm capacidade de se transformarem em outros tipos de células devido a sua grande plasticidade. No processo de diferenciação a rigidez da membrana varia, com isso esperamos que o tempo de relaxação da membrana também sofra alterações. Além disso, analisamos o batimento cardíaco e o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionário. Utilizamos uma Lupa com aumento de 7.5X para obter os lmes dos embriões em diferentes estágios de desenvolvimento. Estudamos a evolução da freqüência de batimento do coração de galinha nas primeiras horas do desenvolvimento. Para tanto, obtemos o espectro de potência a partir da posição (x-y) na interface do coração capturados durante as contrações. Em estágios iniciais as contrações são irregulares e fracas, como as contrações em 1
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Conclusões
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culturas de cardiomiócitos, tornando-se mais regulares e fortes em estágios posteriores. As análises da frequência de batimento mostram que inicialmente a freqüência de batimento é bastante irregular bem próxima da freqüência de batimento de uma única célula do coração, o cardiomiocito, tornando mais regular durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, conseguimos observar o crescimento de vasos no embrião de galinha, obtemos estágios no qual o embrião não apresentava vasos e estágios bem vascularizados. Na próxima etapa deste trabalho queremos acompanhar o crescimento de vasos no tempo e conseguir obter paramentos da dinâmica de crescimento.
Apêndice A
Programa para auto-correlação temporal.
import ij.*; import ij.process.*; import ij.gui.*; import java.awt.*; import ij.plugin.*; import ij.plugin.filter.*;
public class CorrelaçãoTemporalMediaPixel_ implements PlugIn {
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public void run(String arg) {
ImagePlus imp = WindowManager.getCurrentImage(); if (imp==null) {IJ.noImage(); return;}
Roi roi = imp.getRoi(); if (!(roi!=null && roi.getType()==roi.LINE) ) {IJ.error("Straight line selection required."); return;}
double angle = 0.0; if (roi.getType()==Roi.LINE) { Line line = (Line)roi; angle = roi.getAngle(line.x1, line.y1, line.x2, line.y2); } else if (roi.getType()==Roi.POLYLINE) angle = ((PolygonRoi)roi).getAngle();
int nSlices=imp.getStackSize();
double[] data = ((Line)roi).getPixels(); int tamanholinha = (int)data.length-1; double[][] dados = new double[tamanholinha][nSlices]; double[] correlacao = new double[nSlices]; double[] media = new double[tamanholinha];
for (int j=0;j
for(int i=0; i
for (int k=0; k
for (int j=0; j
}
String headings = "t\t"; IJ.setColumnHeadings(headings);
for(int i=0;i
} //IJ.write("media="+media); //IJ.write("tamanho linha="+tamanholinha); //IJ.write("nSlices="+nSlices);
IJ.showProgress(1.0);
}
}
Referências Bibliográ cas [1] U. Agero, James A. Glazier, and M. Hosek. Bulk elastic properties of chicken embryos during somitogenis. BioMedical Engineering Online, 9:19, 2010. [2] U.M.S. Andrade. Microscopia de Desfocalização e seus Limites de Validade. Master's thesis, Universidade Federal de Minas Gerais, 2010. [3] C. Vater, P. Kasten, and M. Stiehler. Culture media for the dierentiation of mesenchymal stromal cells. Acta Biomaterialia, 2010. [4] U. Agero, C.H. Monken, C. Ropert, R.T. Gazzinelli, and O.N. Mesquita. Cell surface uctuations studied with defocusing microscopy . Physical Review, E 67:051904, 2003. [5] J.C. Neto, U. Agero, D.C.P. Oliveira, R.T. Gazzinelli, and O.N. Mesquita. Real-time Measuraments of Surface Dynamics on Macrophages and the Phagocytosis of Leishmania Parasites. Experimental Cell Research,
303:207217, 2005.
[6] O. Pourquié. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mechanisms of development, 121(9):10691079, 2004. [7] C. Tickle. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of development,
121(9):10191029, 2004.
[8] C.D. Stern. The Chick:: A Great Model System Becomes Even Greater. Developmental cell, 8(1):917, 2005. [9] V. Hamburger and H.L. Hamilton. A series of normal stages in the develoments of the chick embryo. Journal of Morphology,
88:232272, 1951.
[10] Marianne Bronner-Fraser. Methods in Avian Embryology. Academic Press Limited 24-28 Oval Road, Lodon NM1 7DX, 1996. [11] Scott F. Gilbert. Developmental of Biology. Sinauer Associates Inc, 2007. [12] Bradley M. Patten. Early Embryology of the Chick. The Blakiston Company, 1951. [13] C. Vilhais-Neto, G., M. Maruhashi, T. Smith, K., M. Vasseur-Cognet, S. Peterson, A., L. Workman, J., and Olivier Pourquié. Rere controls retinoic acid signalling and somite bilateral symmetry. Mechanisms of development,
463:953957, 2010.
[14] A. Aulehla and O. Pourquié. Signaling Gradients during Paraxial Mesoderm Development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology,
2:a000869:114, 2009.
6
[15] Simón Muñoz-Armas María Victoria da la Cruz and Luis Muñoz-Castellanos. Development os the Chick Heart.
The Johns Hopkins University Press, 1972.
[16] I. BERUL, C. A Beat Is Born: Embryonic Development of Arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Electrophysiology,
17:13601361, 2006.
[17] A. SARRE, P. MAURY, P. KUCERA, L. KAPPENBERGER, and E. RADDATZ. Arrhythmogenesis in the Developing Heart During Anoxia-Reoxygenation and Hypothermia-Rewarming:An In Vitro Model. Journal of Cardiovascular Electrophysiology,
17:13501359, 2006.
[18] L. Polo-Parada, X. Zhang, and A. Modgi. Cardiac Cushions Modulate Action Potential Phenotype During Heart Development. Developmental Dynamics, 238:611623, 2009. [19] U. Agero, L.G. Mesquita, B.R.A. Neves, R.T Gazzinelli, and O.N. Mesquita. Defocusing Microscopy. Microscopy Reserch and Technique,
65:159165, 2004.
[20] U. Agero. Microscopia de Desfocalização Aplicada ao Estudo de Fagocitose por Macrófagos. PhD thesis, UFMG, 2003. [21] C. Cui. Dynamics of Cell Movement and Tissue Motion in Gastrulation and Micromass Cell Culture. PhD thesis, University Graduate School, July 2005. [22] JN Petitte, G. Liu, and Z. Yang. Avian pluripotent stem cells. Mechanisms of development, 121(9):1159 1168, 2004. [23] T. Reya, S.J. Morrison, M.F. Clarke, and I.L. Weissman. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature,
414(6859):105111, 2001.
[24] J.Y. Bogue. The heart rate of the developing chick. Journal Experimental of Biology, 9:351, 1932. [25] JR Cain, UK Abbott, and VL Rogallo. Heart rate of the developing chick embryo. In Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. Society for Experimental Biology and Medicine (New York, NY),
volume 126, page 507, 1967.
