FUNDAMENTOS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES Y GASES DE MASAS
Manuel Gayo González Responsable de Ventas Universidad Consultor LCMSQQQ&GCQQQ
Universidad Europea de Madrid, 15 Octubre 2010
Introducción a la cromatografía de gases
Definición de Cromatografía de gases La cromatografía es un método de separación físico. En cromatografía de gases, los componentes a separar se distribuyen entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil . Los componentes se separan debido a la diferencia de afinidad con la fase estacionaria. La fase móvil introduce los analitos en la columna y a través del sistema. Como fáse móvil se utilizan gases inertes (gas portador).
Esquema típico de un sistema de GC
Componentes Gases Sistema para introducción de la muestra Columna Detector Adquisición de datos
Componentes Gases
Gas portador: - transporta la muestra a través del sistema. - Su selección y velocidad influye en la eficiencia y el tiempo de retención. Gases del detector: Soporte para ciertos detectores, ej. FID.
Componentes Sistema de introducción de la muestra:
Introducción de la muestra en la corriente del gas portador con mínimas variaciones en la corriente de gas. -Rápido -Reproducible -Sin pérdida de eficacia. -Muestra representativa
Componentes Columna: Logra la separación de los componentes de la muestra. Detector:
Reconoce y responde a alguna propiedad de los componentes de la muestra a medida que eluyen de la columna. Adquisición de datos: Convierte la señal del detector en un cromatograma y permite la
determinación manual o automatizada de la identidad y cantidades de los componentes de la muestra.
Cromatógrafo de gases típico FIXED
MOL-SIEVE TRAPS
RESTRICTORS
RECORDER/ ELECTROMETER INJECTION PORT
REGULATORS
FLOW CONTROLLER
CARRIER GAS
HYDROGEN
AIR
DETECTOR
COLUMN
INTEGRATOR
Consideraciones generales en GC • Temperatura: Implica un peso molecular límite Heated to Vaporize Sample
Heated to Control Separation
Injection Port
Carrier Gas
Column Column
Integrator Detector Data System
Heated to Keep Clean
• Instrumento presurizado: Las fugas son problemáticas.
Consideraciones generales de los tipos de muestra Requirimientos de la muestra en cromatografía de gases •Suficiente Volatilidad: Las macro moléculas generalmente no tienen suficiente volatilidad (no pasan a fase gas en las condiciones instrumentales). •Libre de residuos: Esta es una extensión del primer requerimiento. Las impurezas no volátiles en la matriz de la muestra puede derivar en contaminación del inyector y columna que degradará rápidamente la cromatografía. •Estabilidad térmica: Los compuestos de interés no se deben degradar cuando se introducen en el inyector a alta temperatura (por encima de 300°C) o en la columna (por encima de 350°C). El 10-20% de todos los compuestos son adecuados para análisis por GC
Papel de la muestra
La muestra determina la configuración del instrumento, es decir:
Tipo de gas portador Tipo de inyector de la muestra Tipo de columna Tipo de detector
Tipos de columnas Empaquetadas
Capilares
Tubo abierto con recubrimiento
EMPAQUETADA Longitud (metros) D.I. (mm)
SERIES 530
0.5-10
5-100
2-4
0.53
NARROW BORE 5-100
0.1-0.25
Columnas capilares
Comparación de los tipos de columna 1 2 4
Muestra para evaluación de columna
5
6
7 9 1 1 & 1 2 1 0
8
Columna empaquetada: 5% OV101 sobre 80/100 Chromosorb 1 2
Semi-Capilar 30m X 0.53mm X .88
Capilar 30m X 0.32mm X .25
9
7 & 8 5 46
1 2 1 0 1 1
Modelo del proceso cromatográfico Separación de compuestos Flujo
A
B
C
D
Tiempo de retención tr: Tiempo de retención. Tiempo que tarda un analito en salir de la columna tr’: Tiempo de retención relativo. Tiempo que un analito pasa en la fase estacionaria tm: Tiempo muerto ( se conoce también como tiempo de retención de un compuesto no retenido). Tiempo que tarda en salir de la columna un compuesto no retenido.
Resolución • Depende de tres parámetros: – Factor de Retención (k) – Selectividad ( ) – Eficacia (N) • Si los tres son correctos tendremos separación en línea base.
• Los tres parámetros son independientes entre sí y se pueden ajustar.
Factor de retención (k) tr(B) t’r(B) tr(A) Inyección
t
t’r(A)
tm
Soluto A
t‘r(A) = tr(A) – tm k(A) = t'r(A) / tm
Soluto B
t = tr(B) - tr(A)
Retention Time of Unretained Compound
Time
k es inversamente proporcional a la temperatura de la columna
Selectividad
t’r(B)
tm t’r(A)
=
Soluto A
t’r(B) t’r(A)
Soluto B
Inyección
TIME
> 1.05 son deseables para Columnas Capilares > 1.2 son deseables para Columnas empaquetadas
depende de la fase estacionaria
=
k(B) k(A)
Eficiencia tr
Número de platos teóricos (N)
t’r
tR N 16 wb
tm
2
tR 5.545 wh
2
Wh
Altura equivalente de plato teórico (HETP)
HETP
Inyección Wb
Es deseable el mayor valor N posible
H
Lc N
Resolución (Ecuación gráfica): Función del factor de retención, selectividad y eficiencia.
t
Wh1
Wh2
Wb(1)
Wb(2)
RS
t 1 W 2 b(1)
Wb(2)
RS = 1.17 x [ t / (Wh1 + Wh2)]
Resolución: Resumen
Rs
k
1
1 k
N 4
Factor de retención
Selectividad
Eficiencia
(Temperatura)
(fase estacionaria)
(Lc, Dc,
• La resolución depende de tres factores: k, , & N. • Todos estos factores son necesarios para conseguir buena separación en línea base.
Simetría de pico
Gases portadores y de soporte del detector
Los gases deben: o o o o
Elegirse considerando el tipo de detector utilizado Ser inertes Secos Puros Para la utilización del gas comprimido con seguridad: Seguir las normas de seguridad del Dpto. de seguridad de la empresa o las suministrada por el proveedor local
Los gases portadores más comunes son N2, He, H2.
Gases portadores Su selección y velocidad influye en la eficiencia y el tiempo de retención.
Curvas de Van Demmter
Tipos de inyectores en GC.
Sistemas de inyección Permiten introducir la muestra en el cromatógrafo de manera repetitiva y reproducible. La muestra debe ser representativa y debe inyectarse sin que haya cambios químicos. Tipos de inyectores: •Split/Splitless - EPC y no EPC •Empaquetadas con purga (Purged Packed) -EPC y no EPC •Refrigeración en columna (Cool on-column) - EPC •Vaporización a temperatura programada PTV y MMI - EPC
Inyector “Split/Splitless” (con/sin división)
Modo “Split” “Split” a pulsos
Modo “Splitless” “Splitless” a pulsos
Análisis de comp. principales Permite un volúmen de inyección mayor
Análisis de trazas de comp. Permite un volúmen de inyección mayor
Diagrama de flujo “Split” (con división): Pre-Inyección SEPTUM (SEPTUM) SALIDA DE PURGA
2 ml/min FLUJO TOTAL
50 ml/min SALIDA DE SPLIT
(ENTRADA) VALVULA DE PURGA
48 ml/min 47.4 ml/min
GAS PORTADOR ALINEADOR
0.6 ml/min
SELLO COLUMNA
Diagrama de flujo “Split”: Inyección de muestra (SEPTUM) SALIDA DE PURGA FLUJO TOTAL
SALIDA DE SPLIT
(ENTRADA) VALVULA DE PURGA
= GAS PORTADOR = MOLECULAS DE MUESTRA LÍQUIDA
REL. SPLIT = FLUJO EN COLUMNA + SALIDA SPLIT FLUJO EN COLUMNA COLUMNA
Diagrama de flujo “split”: Vaporización de la muestra (SEPTUM) SALIDA DE PURGA
FLUJO TOTAL
SALIDA DE SPLIT
= GAS PORTADOR = MOLECULAS DE MUESTRA
= MOLECULAS DISOLVENTE
Típicamente los inlets se mantienen a temperaturas elevadas (>175°C hasta 350°C dependiendo de la temperatura de vaporización de la muestras
(ENTRADA) VALVULA DE PURGA
La vaporización tiene lugar cuando se transfiere suficiente energía térmica a la muestra. Esto puede ocurrir en el gas portador, pero es más probable durante el contacto con una superficie sólida, como el alineador o el medio de mezcla. COLUMNA
Diagrama de flujo “split”: Mezcla Muestra/Gas (SEPTUM) VALVULA DE PURGA FLUJO TOTAL
VALVULA DE SPLIT
= GAS PORTADOR = MOLECULAS DE MUESTRA = MOLECULAS DE DISOLVENTE
(ENTRADA) VALVULA DE PURGA
Para que el concepto de SPLIT RATIO (Relación de Split) sea válido, la muestra (disolvente + analito) debe mezclarse con el gas portador y generar una mezcla homogénea. Al fondo del puerto de inyección, una pequeña parte de esta mezcla se transferirá a la columna, mientras el exceso de la mezcla salga del cromatógrafo por la Salida de “SPLIT” COLUMNA
Diagrama de flujo en el Splitless •La vávula de purga está cerrada durante la inyección (no hay flujo en la válvula de split) •En un tiempo específico después de la inyección, la válvula de purga se abre para eliminar vapores remanentes en el inlet.
Injection
Initial oven temperature is maintained below the boiling point of the solvent causing the solvent to condense at the head of the column "swelling" the stationary phase and trapping the analyte.
Solvent Effect:
S S S
S S S A S S S A S S A A S S S S S A A SA S S S S S S
S
S
S S S
A = ANALYTE
S = SOLVENT S
S
A
S S S A S A S S S S S A
S
S
S
S
S S
A
S S
S
S
SOLVENT
DICHLOROMETHANE CHLOROFORM CARBON DISULFIDE
DIETHYL ETHER PENTANE HEXANE ISO-OCTANE
A S S
S
S
S
S A S
S
S
S
A
S S
BOILING POINT
INITIAL OVEN TEMP o
( ºC)
( C)
40 61 46 35 36 69 99
10-30 25-50 10-35 10-25 10-25 40-60 70-90
Los liners más utilizados Alineadores: Desactivados Tipo
Configuración
HP Ref. Uso recomendado
Empaquetada
cónica
4-mm di, volúmen nominal 900 ul, vidrio borosilicato (desactivado), lana de vidrio silanizada (desactivada)
No empaquetada,
4-mm di, volúmen nominal 900 ul, vidrio de borosilicónica cato (desactivado) Lana vidrio grado pesticidas
Modos Split y splitless. Puede estar medio empaquetada.
5062-3587
Modos Split y splitless. Puede estar medio empaquetada.
5181-3316
5181-8818
Alineadores: No tratados Split/Splitless
4-mm di 1000-ul volumen nominal, vidrio borosilica- to (no tratado), tapón de lana de vidrio silanizada
Modos Split y splitless, especialmente recomendados para inyecciones rápidas con el Inyector Automatico 7673
19251-60540
@Consultar el catálogo de Columnas y Consumibles de Agilent Technologies: http://www.chem.agilent.com/en-US/Search/Library/_layouts/Agilent/PublicationSummary.aspx?whid=57180&liid=56
Expansión de disolventes comunes
Cálculo del volumen de expansión
Solvent Vapor Volume Calculator
http://www.chem.agilent.com/en-US/Support/Downloads/Utilities/Pages/GcPressureFlow.aspx
Nuevo Inyector Multimodo para muestras con alto contenido en matriz - Capacidad de programación de temperatura - Flexibilidad en los volúmenes de inyección Análisis de muestras termolábiles y mínima discriminación en la inyección para compuestos con alto peso molecular
- Mayor sensibilidad en inyecciones de gran volumen - Disminuye pasos de preparación de muestra Mayor productividad
MMI en la práctica Inyección Solvent Vent 5 µL Temperatura de la fuente 350⁰ C
Inyección cold Splitless 4 µL Temperatura de la fuente 350⁰ C Inyección Splitlless 250⁰C 3µL Temperatura de la fuente 280⁰ C Patrón directo compuesto por 56 compuestos: 17 Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAHs) 23 Pesticidas Organoclorados (POCs) 6 Pesticidas Nitrogenados, Triazinas 10 Hidrocarburos Clorados
INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFÍA DE GASES MASAS ACOPLAMIENTO GC/MS La espectrometría de masas es una técnica analítica muy
potente utilizada para: Identificar compuestos desconocidos. Cuantificar compuestos conocidos. “Elucidar la estructura química de las moléculas”.
240 Trampa de Iones
220 Trampa de Iones
Comparación Detectores de Cromatografía de Gases TCD
El Detector Selectivo de Masas (MSD) es a la vez:
FID ECD
Universal (trabajando con
NPD(N)
barridos completos - modo SCAN) NPD(P)
Específico y muy sensible
FPD(S)
(trabajando con iones selectivos modo SIM)
MSD (SIM) 10 -15 fg
10 -12 pg
1ppb = 1 pg / µl
(SCAN) 10 -9 ng
10 -6 µg
1ppm = 1 ng / µl
10 -3 mg
Proceso de Ionización por Impacto Electrónico (EI) Ionización: +. ABC + 2e
ABC + e Molécula Neutra
La curva depende del producto (ABC)
#ABC . +
Ión Molecular Excitado 0
70
10
100 eV Energía de los electrones
Fragmentación: ABC +.
. AB + C+ A+ + BC . AB +. + C
AC + + B etc.
Espectro de Masas
(reordenamiento)
.
Abundancia Señal
+ AB
+ C + A
(pérdida de un neutro)
m/z
+ AC
+. ABC
Diagrama de un Espectrómetro de Masas Sistema en Vacío Fuente de Iones
Analizador
Detector de Iones
Sistema de Datos
Inyector Introducción de la Muestra: GC/MS - LC/MS - Directa
Espectro de Masas
Componentes Fuente de Iones Foco de electrones
Lentes "Draw-Out" Lentes de entrada
Filamento
Línea de transferencia de columna
--> Cuadruplo
*
Lentes de focalización de iones
"Repeler" " Magnet" (imán colimador)
"Target"
Filamento: Proporciona electrones para la ionización
Lentes "Draw-Out":
Foco de electrones:
"Empuja" los electrones hacia fuente de iones Target: "Atrae" los electrones ionizantes hacia la fuente Magnet: Controla la forma del haz de electrones ionizantes Repeller: "Empuja" los iones formados fuera de la fuente
"Arrastra" a los iones fuera de la fuente Actua como apertura de entrada al juego de lentes de focalización
Lentes de focalización Focaliza los iones hacia las lentes de iones: de entrada Lentes de entrada
Focaliza los iones hacia el campo del cuadrupolo
Analizador-Filtro de Masas ELECTRODOS POSITIVOS FRECUENCIA RF +
(+) FILTR0 MASAS BAJAS
+DC AMPLITUD
0
AMPLITUD RF
( - ) FILTRO MASAS ALTAS
-
Los voltajes aplicados en ambos pares de electrodos son iguales en magnitud pero de signo opuesto. La magnitud del potencial DC controla la masa seleccionada ELECTRODOS NEGATIVOS
2 pares de electrodos Hiperbólicos ("rods") a los que se aplica una componente de corriente alterna y otra de continua de igual magnitud pero de signo opuesto
+
0
-
-DC AMPLITUD
AMPLITUD RF
Barrido de Masas (modo "SCAN") con Cuadrupolo Para barrer un rango de masas, los potenciales de DC y RF aplicados al cuadrupolo han de ser variados, para variar las masas que son filtradas. La relación entre los potenciales RF y DC es la llamada LINEA DE BARRIDO.
TRABAJO EN MODO SCAN
BARRIDO- ELECTRODOS POSITIVOS
+ LINEA DE BARRIDO DC AMPLITUD
RF AMPLITUD
0
Amplitud RF/ DF = cte.
La magnitud del potencial DC controla la masa seleccionada,
Detector de Iones: Electromultiplicador
+
+
+
+
SEÑAL
+ + +
QUADS E.M. VOLTS (CDEM) (-1200V TO -3000V)
Los multiplicadores son capaces de aumentar la corriente por un factor de 1,000,000 pero el rango de trabajo típico es de 100,000. El tamaño de la señal (y ruido) es función del voltaje del EM, cuanto mayor es el voltaje mayor es la señal. El EM tiene un tiempo de vida finito. Este tiempo de vida es función de la corriente de salida, cuanto mayor es ésta, menor es el tiempo de vida del EM.
Espectro de Masas Dodecano : C12H26 (M=170) Abundance
Average spectrum of dodecane from EVALDEMO.D 57 <--[C H ] + (Base peak) 4 9
100 90 80 70
71 43
60
<--[C H ] 5 11
+
50 85
40
<--[C H ] + 6 13
30
20 10 m/z-> 20
+ M . (Parent)
55
29
98 40
60
80
100
113
128
120
141 140
170 159 160
Ión Molecular (M +): pérdida de un electrón Pico Base: ión más abundante del espectro
180
Sintonizado con PFTBA Espectro Perfluorotributylamine (PFTBA) Scan: 10.00 - 650.00 Samples: 16 Thresh: 500 117 peaks Base: 69.00 Abundance: 1974784 69
100
F3 C - F2C - F2C - F2 C .. N
CF2 - CF2 - CF2 - CF3
219
F3 C - F2C - F2C - F2 C 50 131
264 414 (GCD) 502
614
0 50
100
150
200
250
300
350
400
450
Mass Abund Rel Abund Iso Mass Iso Abund Iso Ratio 69.00 1974784 100.00
70.00
219.00 1161216
58.80
219.95
45968
3.96
502.00
2.87
503.00
5690
10.04
56648
20344
1.03
500
550
600
650
¿Qué es un espectro EI clásico? M
+
+
Metil estearato (C19H 38 O2 ) M = 298 Ión M+1+= 299 Contribución isotópica del carbono: C19 x 1.1% de C13 = 20.9% Contribución isotópica del deuterio: H38 x 0.015% de D = 0.6% Contribución isotópica total
+
M +1 = 21.5%
= 21.5%
Los espectros clásicos de EI deben proporcionar picos isotópicos con relaciones respecto al ion molecular muy cercanas a los valores teóricos.
298 299
Ionización Química Positiva (PCI) Forma iones a partir del “gas reactivo” por bombardeo con electrones. Los iones del gas reactivo sufren reacciones con moléculas de la muestra produciéndose iones de la misma. La ionización química (CI) es mucho más suave que la ionización por impacto electrónico (EI), por lo que se produce menos fragmentación. El gas reactivo más común es el metano, que produce iones con prácticamente cualquier molécula de muestra. Otros gases reactivos (isobutano, amoniaco) son más selectivos y producen incluso menos fragmentación. Presión de la fuente ~ 0.2 Torr. Es el método más frecuentemente utilizado para determinar pesos moleculares de compuestos. Con metano se forma: M+1, M+29; M+41. Muy útil para asegurar M. Con amoníaco se suele formar el M+1 y el M+18. Es muy selectivo (aminas). Con isobutano sólo suele obtenerse el M+1.
¿Qué es un Espectro CI clásico? Ionización del fenobarbital [M/z-232] empleando CH4 como gas reactante
Formación Iones Reactivos Primaria CH 4 +e CH+4 +2e CH ++e CH+ +e- +H+ 4 CH4+ +CH4 CH+3 +CH4 C H+ +CH4 2 5
[M+1] +
3
CH 5+ +CH3 C 2 H 5+ [29] +H 2 C H+ [41] + 2H2 3 5 Reacciones Analito-Gas Reactivo
Secundaria
[M+29]+ [M+41]+
Las moléculas neutras de muestras reaccionan con iones secundarios del gas reactante para formar aductos
Transferencia de Protones +
M + CH5 Adición Alquílica
M + C2 H5+ M + C3H5+
233 261 273
+
CH4 + [M-H] +
[M-C2 H5 ] [M-C3 H5 ] +
m/z = M + 1 m/z = M + 29 m/z = M + 41
100 pg de Benzofenona PCI en Modo SCAN
M+1 M+29
La PCI facilita la detección del ión molecular
M+41
Ionización Química Negativa (NCI) “Ionización química negativa por captura electrónica”. Primero se forma una nube de electrones con poco exceso de energía (“electrones térmicos”). Los “electrones térmicos” son capturados por moléculas de muestra. Es necesario un gas amortiguador (que retira energía de los electrones/iones). El metano es el más utilizado. Presión de la fuente ~ 0.4 Torr (mayor que en PCI). Sólamente ciertos tipos de moléculas son capaces de capturar electrones térmicos (selectividad). Extremadamente eficiente para algunas moléculas (sensibilidad). Los límites de detección son generalmente muy bajos debido a la falta de respuesta de los contaminantes o de la matriz. Usado frecuentemente para análisis selectivos y de alta sensibilidad de compuestos electrofílicos. Suele proporcionar el M(-).
Voltaje de Ionización Variable (5-240 eV) Beneficios:
Scan 619 (7.531 min.): 2.D (-) 7000
Los voltajes pequeños proporcionan una menor fragmentación general y por otro lado incrementan el ion molecular en relación a la ionización estándar a 70eV. Los voltajes pequeños proporcionan ionización selectiva [ej..: aromáticos en alcanos]. Los voltajes altos con CI son también posibles y proporcionan una mayor sensibilidad.
394
Abundance
6000
12 eV
71
5000 4000 3000 2000 1000
99 127
169
210 225 253
309
0 220 260 100 180 300 m/z--> 60 140 Abundance Scan 617 (7.515 min.): GLUC.D (-) 57 11000 10000 9000 8000 85 7000 6000 5000 4000 3000 113 2000 141 168 183211 1000 238 268 295 0 m/z--> 60 100 140 180 300 220 260
337
340
365 380
C28H58 70 eV M+
337 365 340
394
380
Obtención de información •
El proceso para conseguir el password es el siguiente:
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Acuda a la página de Agilent. (www.chem.agilent.com) Pinche en el botón de Register Siga los pasos que le indique el navegador Finalmente adquiera su clave de acceso (password) Una vez tenga la clave de acceso: Acuda a www.chem.agilent.com
•
Luego:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Haga clic en Login Introduzca su nombre y password De nuevo en la pagina inicial entre en Literature Library – Online Literature Una vez en Library introduzca un keyword (por ejemplo: PAH) Introduzca un tipo de publicación (por ejemplo: Application) Rellene el resto de campos si lo considera necesario Haga clic en Search
RESUMEN: Ventajas del acoplamiento GCMS • • • • •
Operación robusta Identificación y confirmación Sensibilidad y Especificidad Facilidad de Uso Tecnología asequible
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