INHIBISI XANTIN OKSIDASE OLEH EKSTRAK ETANOL KULIT MELINJO (Gnetum gnemon) RELATIF TERHADAP ALLOPURINOL Sri Wulandari, Subandi, dan Muntholib Universitas Negeri Malang Correspondence Author:
[email protected]
ABSTRAK: Xantin oksidase adalah enzim pensintesis asam urat. Sementara kulit melinjo mengandung metabolit sekunder yang diduga mampu menghambat xantin oksidase. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder, daya inhibisi kulit melinjo terhadap aktivitas xantin oksidase, dengan variasi usia buah dan perebusan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kulit melinjo mengandung flavonoid, saponin, alkaloid, dan polifenol dan daya inhibisi tertinggi terhadap aktivitas xantin oksidase diperoleh pada ekstrak etanol kulit melinjo muda mentah dan direbus yang pada konsentrasi 100 ppm setara dengan allopurinol 19,9 ppm. Kata Kunci: xantin oksidase, inhibisi, kulit melinjo, allopurinol
Asam urat merupakan hasil akhir dari katabolisme nukleotida purin yang berlangsung di dalam tubuh. Purin yang berasal dari dalam tubuh merupakan penghancuran dari sel-sel yang sudah tua dan sintetsis dari CO2, glisin, asam aspartat, glutamin, dan asam folat (Dalimartha, 2008: 6). Xantin oksidase memiliki peranan penting dalam proses pembentukan asam urat dengan mengkatalisis berturut-turut hipoxantin menjadi xantin kemudian asam urat. Pada reaksi tersebut dihasilkan pula radikal superoksida yang bereaksi dengan air membentuk asam peroksida. Xantin oksidase dapat ditemukan dalam susu sapi segar pada membran-membran di sekitar globula lemak. Membran tersebut berasal dari membran sel yang keluar berbentuk konsentrat (Briley, M.S. & Eisenthal, R. 1974: 417). Pada keadaan hiperurisemia, plasma darah tidak mampu menampung lagi garam urat sehingga terjadi pengendapan pada berbagai organ seperti sendi dan ginjal. Penderita penyakit gout seringkali menggunakan allopurinol sebagai obat penurun kadar asam urat dengan mekanisme kerja sebagai inhibitor xantin oksidase karena memiliki struktur mirip xantin yang merupakan substrat xantin oksidase. Allopurinol memiliki efek samping seperti mual, diare, hingga kulit kemerahan disertai gatal sehingga perlu dicari senyawa bioaktif tanaman sebagai inhibitor alami xantin oksidase untuk dijadikan alternatif pengobatan yang aman untuk dikonsumsi. Kulit melinjo mengandung asam askorbat, tokoferol, dan polifenol memiliki aktivitas sebagai antioksidan juga berpotensi sebagai inhibitor xantin oksidase (Santoso dkk., 2010: 522). Proses perebusan meningkatkan aktivitas antioksidannya. Beberapa senyawa antioksidan memiliki potensi sebagai inhibitor xantin oksidase karena mampu menangkap elektron. Flavonoid golongan flavon dan flavonol memiliki daya inhibisi lebih tinggi daripada golongan flavonoid yang lainnya karena posisi gugus hidroksilnya
lebih mudah menangkap elektron dari sisi aktif xantin oksidase (Cos, 1998: 74). Senyawa lainnya seperti polifenol dan saponin juga berpotensi sebagai inhibitor xantin oksidase karena memiliki gugus hidroksil sebagai akseptor elektron dari xantin oksidase. Penelitian ini bertujuan mengetahui 1) golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak etanol kulit melinjo, 2) daya inhibisi ekstrak etanol kulit melinjo dengan variasi usia buah dan perebusan terhadap xantin oksidase relatif terhadap allopurinol, dan 3) massa kulit melinjo yang diperlukan untuk menghasilkan ekstrak dengan aktivitas setara dengan 1 tablet allopurinol (100 mg). METODE Persiapan Simplisia 1000 g buah melinjo dicuci, dibagi menjadi dua bagian masing-masing direbus sebelum dikupas dan bagian lainnya langsung dipisahkan kulitnya kemudian dikeringkan dan diblender menjadi serbuk. Untuk menentukan kadar air, 2 g serbuk simplisia dioven pada suhu 55 °C selama 30 menit, dan diulang hingga beratnya konstan. Ekstraksi Simplisia Serbuk simplisia diekstraksi menggunakan metode maserasi selama 24 jam dengan nisbah sampel:etanol 70 % sebesar 1:5 sambil sesekali diaduk. Maserat yang diperoleh selanjutnya dipekatkan dengan rotavapor hingga diperoleh ekstrak kental. Rendemen ekstrak dihitung dengan kadar air sebagai faktor koreksi. Uji Fitokimia Alkaloid Sebanyak 1 g ekstrak dilarutkan dalam 10 mL kloroform. Ditambahkan 5 mL HCl 2 M kemudian ditambahkan 0,5 g NaCl. Campuran diaduk dan disaring. Filtrat yang diperoleh ditambah 3 tetes HCl 2 M kemudian dipisah menjadi 4 bagian. Bagian pertama sebagai blanko, bagian kedua ditanbah reagen wagner, bagian ketiga ditambah reagen dragendorff, dan bagian keempat ditambah reagen mayer.untuk uji penegasan, bagian pertama ditambah amonia 25 % hingga mencapai pH 8-9. Kemudian ditambahkan 3 tetes kloroform selanjutnya diuapkan di atas penangas. Filtrat ditambahkan 2 mL HCl 2 M kemudian diaduk dan disaring. Filtrat dibagi menjadi 4 bagian seperti prosedur sebelumnya. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya alkaloid. Flavonoid Sebanyak 0,1 g sampel dilarutkan dalam 3 mL etanol 70 %. Larutan diambil 1 mL dan ditambahkan 10 tetes HCl 37 % kemudian dipanaskan selama 10 menit. Hasil positif ditunjukkan oleh adanya perubahan warna menjadi kuning, jingga, atau merah. Saponin, Tanin, dan Polifenol Sebanyak 0,1 g Sampel dilarutkan dalam akuades panas kemudian dibagi menjadi 2 bagian. Bagian pertama dikocok selama 10 detik dan dibiarkan hingga terbentuk buih stabil selama 10 menit. Bagian kedua ditambah 5 tetes NaCl 10 % dan disairng. Filtrat yang diperoleh dibagi menjadi tiga bagian. Filtrat pertama sebagai blanko, filtrat kedua ditambah 3 tetes FeCl3, dan filtrat ketiga ditambah 5 tetes gelatin. Hasil positif polifenol ditunjukkan oleh adanya perubahan warna mejadi hitam kehijauan. Sedangkan hasil positif tanin ditunjukkan oleh adanya endapan putih.
Isolasi Enzim Xantin Oksidase dari 250 mL Susu Sapi Segar Isolasi xantin oksidase berdasarkan Corran, H.S.& Green, D.E (1938) yang diperoleh dari 250 mL susu sapi segar dilakukan dengan pemanasan susu hingga mencapai suhu 30 °C. Kemudian menambahkan 81,68 g NaCl dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh difraksinasi amonium sulfat dengan fraksinasi 0-40 % pada suhu 4 °C menggunakan penangas es kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm suhu 4 °C selama 20 menit menggunakan ultrasentrifuge. Supernatan dan residu yang diperoleh digunakan sebagai sampel enzim xantin oksidase. Fraksi residu dilarutkan dalam buffer kalium fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 250 mL. Uji Aktivitas Enzim Pengujian aktivitas xantin oksidase berdasarkan Bergemeyer dkk (1974) sebanyak 1 mL xantin 0,15 mM ditambahkan 1,8 mL buffer kalium fosfat 0,05 M pH 7,5. Campuran tersebut diukur serapannya pada 290 nm hingga konstan. Selanjutnya, ditambahkan 0,2 mL xantin oksidase diinkubasi pada suhu kamar (25 °C) dan diukur serapannya pada 290 nm setiap 10 menit. Larutan buffer-xantin digunakan sebagai blanko. Konsentrasi asam urat dihitung berdasarkan hukum Lambert-Beer dengan koefisien ekstingsi molar asam urat pada 290 nm pH 7,5 adalah 12,2 mM-1cm-1 dan lebar kuvet 1 cm. Sedangkan aktivitas enzim diperoleh dari persamaan linier kurva waktu terhadap konsentrasi asam urat. Uji Inhibisi Ekstrak Etanol Kulit Melinjo Ekstrak kental diencerkan hingga konsentrasi 100 ppm dalam buffer kalium fosfat 0,05 M pH 7,5. Penambahan volume ekstrak 0,2 mL, larutan buffer kalium fosfat 0,05 M pH 7,5 sebanyak 1,6 mL kemudian ditambahkan 1 mL xantin 0,15 mM. 0,2 mL enzim. Campuran tersebut dihomogenkan, diinkubasi pada suhu kamar (25 °C), dan diukur serapannya pada 290 nm setiap 10 menit selama 40 menit. Perhitungan daya inhibisinya seperti pada penentuan aktivitas enzim. Dengan prosedur yang sama, ekstrak diganti allopurinol sebagai pembanding. HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Etanol Kulit Melinjo Dari proses pencucian, perebusan, pengupasan, dan pengeringan diperoleh simplisia serbuk. Untuk mengetahui kelayakan simplisia disimpan dalam jangka waktu relatif lama, dihitung persentase kadar airnya. Simplisia yang baik adalah memiliki kadar air kurang dari 10 % untuk mencegah tumbuhnya mikroorganisme selama disimpan dalam jangka waktu tertentu (Winarno, 1988: 13). Kadar air yang telah diketahui juga digunakan sebagai faktor koreksi dalam perhitungan rendemen ekstrak. Metode ekstraksi yang dilakukan pada penelitian adalah maserasi dengan pelarut etanol 70 % merupakan pelarut polar yang memiliki gugus hidroksil dan etil dengan kepolaran yang berbeda. Etanol 70 % digunakan sebagai analisis pendahuluan obat karena aman untuk dikonsumsi lebih lanjut (Susanti, 2009). Maserasi digunakan karena mudah dilakukan dan menggunakan alat yang sederhana. Kekuatan dinding sel dan usia tanaman mempengaruhi jumlah zat yang terekstrak. Hasil keseluruhan penentuan kadar air dan rendemen ekstrak dapat dilihat pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1. Data Keseluruhan Penghitungan Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Melinjo
Massa (g)
Massa kulit (g)
Massa kulit setelah dikeringkan (g)
Massa serbuk (g)
Massa Ekstrak (g)
Kadar air (%)
Rendemen (%)
Tua mentah
500
242,49
116,94
115,06
5,93
4,83
5,41
Tua rebus
500
260
109,58
108,43
14,82
1,53
13,88
Muda mentah
500
180
92
90
13,28
5,33
15,59
Muda rebus
500
280
90,50
85,10
9,42
3,17
11,43
Uji Fitokimia Ekstrak Etanol Kulit Melinjo
Banyak sekali penelitian terkini terkait dengan inhibitor xantin oksidase. Dilaporkan bahwa polifenol salah satu inhibitor xantin oksidase (Constantino dalam Azmi, 2012: 160). Beberapa senyawa dari golongan flavonoid juga memiliki aktivitas inhibisi yang cukup tinggi. Tingkat inhibisinya tergantung oleh posisi gugus hidroksil dalam kerangka dasarnya. Baikalein, kaemferol, morin, kuersetin, fisetin, mirisetin, krisin, apigenin, galangin dan yang paling besar daya inibisinya adalah luteolin (Cos dkk., 1998: 74). Proses perebusan juga mempengaruhi jumlah senyawa yang terdapat dalam ekstrak etanol. Peningkatan kadar senyawa tersebut kemungkinan disebabkan oleh perebusan mengakibatkan rusaknya jaringan dan dinding sel pecah sehingga banyak senyawa yang keluar dan mudah terekstrak . Sedangkan adanya penurunan kadar kemungkinan senyawa dalam ekstrak bersifat tidak tahan panas. Tabel 4.2. Hasil Uji Fitokimia Berbagai Ekstrak Etanol Golongan Hasil Uji Senyawa Tua Mentah Tua Rebus Muda Mentah Muda Rebus Flavonoid +++ ++ +++ ++ Saponin + +++ + +++ Tanin Polifenol ++ +++ ++ +++ Alkaloid -Mayer + ++ + +++ -Wagner + +++ ++ +++ Uji penegasan -Mayer + ++ + + -Dragendorff +++ +++ +++ +++ *) Semakin banyak tanda (+) semakin banyak senyawa terdapat dalam sampel secara kualitatif
Uji Aktivitas Xantin Oksidase Susu merupakan salah satu sistem koloid jenis emulsi dengan zat terdispersi dan pendispersinya adalah cair. Pemanasan hingga suhu 30 °C dan penambahan NaCl dapat memecah lapisan pelindung sehingga membalikkan emulsi susu menjadi air dalam minyak akibatnya enzim dapat keluar dari membran (Johannes, 1974: 173). Pemisahan dengan sentrifugasi 3000 rpm selama 30 menit sehingga diperoleh supernatan dan residu. Residu berwarna kuning menunjukkan pengotor yang mengendap pada proses pemecahan emulsi. Supernatan yang diperoleh difraksinasi dengan amonium sulfat fraksinasi 0-40 % pada penangas es untuk menjaga stabilitas enzim hingga homogen. Untuk memisahkan residu dan supernatan, dilakukan sentrifugasi 8000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 °C. Supernatan dan residu selanjutnya diuji aktivitas enzimnya. Residu dilarutkan dalam larutan bufer kalium fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga mencapai 250 mL. Seperti dilaporkan oleh Egwim dkk (2004) bahwa kondisi optimum xantin oksidase pada pH 7,5. Pada uji aktivitas xantin oksidase, absorbansi yang diukur merupakan jumlah produksi asam urat. Sehingga perhitungan konsentrasinya ditentukan berdasarkan hukum Lambert-Beer dapat dihitung konsentrasi asam urat dari absorbansi asam urat pada 290 nm dengan rumus berikut: A = ε. b . C dengan A adalah absorbansi asam urat pada 290 nm, ε adalah koefisien ekstingsi molar asam urat pada pH 7,5 dan λ 290 nm sebesar 12,2 mM-1cm-1 (Bergmeyer, 1974), b adalah lebar kuvet 1 cm, dan C adalah konsentrasi asam urat (mM). Xantin oksidase akan mengendap pada fraksinasi amonium sulfat 0-40 % (Corran, H.S.& Green, D.E, 1938). Oleh karena itu, aktivitas enzim tertinggi ditunjukkan oleh fraksi residu sebesar 0,0011 U/mL. Adanya aktivitas xantin oksidase pada supernatan disebabkan masih adanya enzim yang tidak terendapkan pada fraksinasi amonium sulfat. Hasil uji aktivitas dapat dilihat pada Tabel 4.3. Tabel 4.3. Aktivitas Xantin Oksidase pada Fraksinasi Amonium Sulfat 0-40% Hasil
Supernatan
Residu
Waktu (menit)
Absorbansi
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
0,248 0,27 0,309 0,328 0,364 0,262 0,386 0,521 0,634 0,737
Konsentrasi Asam Urat (mM) 0,023 0,025 0,028 0,029 0,033 0,024 0,035 0,047 0,058 0,067
Aktivitas XO (U/mL)
Volume (mL)
Aktivitas Total (U)
0,0003
126,1
0,075
0,0011
250
0,275
Inhibisi Aktivitas Xantin Oksidase Apabila dilihat dari mekanismenya, allopurinol termasuk inhibitor reversibel kompetitif. Suatu inhibitor kompetitif memiliki struktur mirip dengan substrat. Hal ini
menyebabkan adanya kompetisi antara substrat dengan inhibitor dalam mengikat sisi aktif enzim. Xantin oksidase yang berikatan dengan allopurinol akan membentuk oksipurinol. Pada uji inhibisi xantin oksidase, allopurinol 10 ppm mampu menginhibisi sebesar 27,28 %. Oleh karena itu, allopurinol digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini. Ekstrak etanol kulit melinjo juga memiliki aktivitas sebagai inhibitor xantin oksidase. Hal ini ditunjukkan dengan adanya penurunan aktivitas enzim. Adanya proses perebusan tidak mempengaruhi inhibisi pada ekstrak etanol kulit melinjo tua dan muda. Meskipun kadar senyawa metabolit sekunder mengalami perubahan pada proses perebusan tetapi tidak mempengaruhi daya inhibisinya. Hal ini kemungkinan senyawa yang berpotensi sebagai inhibitor xantin oksidase, sebagian rusak sehingga meskipun yang terekstrak bertambah tetapi aktivitas totalnya tetap. Sedangkan usia buah melinjo memiliki pengaruh terhadap daya inhibisinya. Ekstrak etanol kulit melinjo muda memiliki daya inhibisi lebih tinggi daripada ekstrak etanol kulit melinjo tua. Hal ini kemungkinan senyawa yang berpotensi sebagai inhibitor pada kulit melinjo muda jumlahnya lebih banyak daripada kulit melinjo tua. Daya inhibisi ekstrak etanol kulit melinjo yang lain dapat dilihat pada Tabel 4.4. Tabel 4.4. Daya Inhibisi Allopurinol terhadap Aktivitas Xantin Oksidase Sampel
Tanpa inhibitor
Allopurinol 10 ppm
Ekstrak Etanol Kulit Melinjo Tua mentah 100 ppm
Ekstrak Etanol Kulit Melinjo Tua Rebus 100 ppm
Ekstrak Etanol Kulit Melinjo Muda Mentah 100 ppm
Ekstrak Etanol Kulit Melinjo Muda Rebus 100 ppm
Waktu (menit) 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Absorbansi 0,248 0,270 0,309 0,328 0,364 0,236 0,346 0,452 0,540 0,597 0,424 0,513 0,579 0,653 0,714 0,372 0,446 0,517 0,592 0,635 0,371 0,451 0,512 0,565 0,606 0,363 0,420 0,479 0,544 0.,595
Konsentrasi Asam Urat (mM) 0,023 0,025 0,028 0,029 0,033 0,021 0,031 0,041 0,049 0,05 0,039 0,047 0,053 0,059 0,065 0,034 0,041 0,047 0,054 0,058 0,034 0,041 0,047 0,051 0,056 0,033 0,038 0,044 0,049 0,054
Aktivitas XO (U/mL)
Daya Inhibisi (%)
0,0011
0
0,0008
27,28
0,0006
45,46
0,0006
45,46
0,0005
54,55
0,0005
54,55
Berdasarkan uji fitokimia, senyawa, metabolit sekunder yang berpotensi sebagai inhibitor xantin oksidase dan memiliki kemiripan struktur dengan xantin adalah flavonoid. Hal ini disebabkan oleh adanya dua cincin aromatic yang memiliki gugus hidroksil sebagai akseptor elektron dari xantin oksidase (Cos dkk., 1998: 71). Selain flavonoid, saponin dan polifenol juga memiliki kemampuan sebagai inhibitor xantin oksidase yang mekanisme inhibisinya belum diketahui (Constantino dalam Azmi, 2012: 161). Daya inhibisi ekstrak etanol kulit melinjo muda mentah dan direbus konsentrasi 100 ppm setara dengan daya inhibisi allopurinol 19,9 ppm. Sedangkan daya inhibisi ekstrak etanol kulit melinjo tua mentah dan direbus konsentrasi 100 ppm setara dengan allopurinol 16,7 ppm. Dapat dikatakan bahwa semakin tinggi daya inhibisi ekstrak etanol kulit melinjo semakin tinggi pula kesetaraannya dengan konsentrasi allopurinol. Sehingga semakin semakin sedikit jumlah ekstrak yang diperlukan untuk menghasilkan senyawa yang mampu menginhibisi aktivitas xantin oksidase. Sedangkan massa kulit melinjo yang dibutuhkan untuk menghasilkan ekstrak dengan jumlah yang telah diketahui berbeda-beda pada setiap jenis usia dan perebusan. Hal ini disebabkan oleh jumlah massa kulit segar yang diperoleh pada variasi tersebut berbeda-beda kemungkinan dipengaruhi oleh ukuran buah dan kadar air. Inhibisi oleh ekstrak etanol kulit melinjo muda mentah membutuhkan 1,5 g ekstrak untuk mendapatkan inhibisi setara dengan 1 tablet allopurinol yang massanya 0,3 g. Sehingga untuk memperoleh ekstrak sebanyak tersebut diperlukan 20,3 g kulit melinjo segar. Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat dikatakan bahwa kulit melinjo memiliki potensi sebagai alternatif obat penurun kadar asam urat darah atau gout. Kesetaraan ekstrak etanol kulit melinjo terhadap allopurinol dapat dilihat pada Tabel 4.5. Tabel 4.5 Kesetaraan Ekstrak Etanol Kulit Melinjo terhadap 1 Tablet Allopurinol Ekstrak Etanol Kulit Melinjo Tua Mentah Tua Rebus Muda Mentah Muda Rebus
Konsentrasi (ppm)
Setara dengan Allopurinol (ppm)
Massa Ekstrak Setara 1 Tablet Allopurinol (g)
Massa Kulit Segar (g)
100 100
16,7 16,7
1,8 1,8
242,5 260
Massa Kulit Segar untuk Menghasilkan Ekstrak Setara 1 Tablet Allopurinol (g) 73,6 31,6
100
19,9
1,5
180
20,3
100
19,9
1,5
280
44,6
PENUTUP Kesimpulan Dari hasil penelitian dan pembahasan, dapat diperoleh kesimpulan sebagai berikut: 1) senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak etanol kulit melinjo adalah flavonoid, alkaloid, saponin, dan polifenol. Perebusan mampu meningkatkan kadar saponin, polifenol, dan alkaloid sedangkan kadar flavonoid menurun, 2) daya inhibisi tertinggi terhadap aktivitas xantin oksidase diperoleh pada ekstrak etanol kulit melinjo muda mentah dan direbus yang pada konsentrasi 100 ppm setara dengan allopurinol 19,9 ppm.
Saran Berdasarkan hasil penelitian mengenai daya inhibisi ekstrak etanol kulit melinjo dapat disarankan hal sebagai berikut: 1) perlu adanya penelitian lebih lanjut tentang senyawa aktif yang lebih spesifik yang mampu menginhibisi xantin oksidase dan mekanisme inhibisinya dan 2) perlu adanya pengujian toksisitas ekstrak untuk mengetahui batas konsentrasi aman untuk dikonsumsi sebagai obat, sehingga dapat diuji lebih lanjut secara in vivo. DAFTAR RUJUKAN Azmi, S. M. N., Jamal, P. & Amid, A. 2012. Xanthine Oxidase Inhibitory Activity from Potential Malaysian Medicinal Plant as Remedie for Gout. International Food Research Journal, (Online), 19 (1): 159-165, (http://www.ifrj.upm.edu.my/ 19%20(01)%202011/(21)IFRJ-2010-271%20Parveen.pdf), diakses 21 Maret 2012. Bergmeyer, H.U., Gawehn, K. & Grassl, M. 1974. Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U. ed.). New York : Academic Press Inc. Briley, M.S. & Eisenthal, R. 1975. Association of Xanthine Oxidase with the Bovine Milk-Fat-Globule Membrane. Journal of Biochemistry, (Online), 147: 417 - 423, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC1165467/pdf/biochemj005590049.pdf), diakses 27 Maret 2012. Corran, H.S., Dewan, J.G., Gordon, A.H. & Green, D.E. 1939. CCXI. Xanthine Oxidase and Milk Flavoprotein. Journal of Biochemical, (Online), 107 (2): 1693-1708, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov_pmc_article_PMC 1264634_pdf_biochemj010200178.pdf), diakses 12 Agustus 2011. Cos, P., Ying, L., Hu, C.J.P., Cimanga, K., Poel, B.V., Pieters, L., Vlietinck, A.J. & Berghe, D.V. 1998. Structure Activity Relationship and Classification of Flavonoids as Inhibitors of Xanthine Oxidase and Superoxide Scavengers. J. Nat. Prod, (Online), 61 (1): 71-76, (http://www. pharmanet.com.br/pdf/np970237h.pdf), diakses 4 Desember 2011. Dalimartha, S. 2008. Resep Tumbuhan Obat untuk Asam Urat. Bogor: Penebar Swadaya. Egwim, E.C., Vunchi, M.A. & Egwim, P.O. 2005. Comparism of Xanthine Oxidase Activities in Cow and Goat Milks. Nigeria Society for Experimental Biology, (Online), 17 (1): 1-6, (http://www.bioline.org .br/pdf/bk05001), diakses 18 Januari 2012. Johannes. 1974. Kimia Koloid dan Kimia Permukaan. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada. Santoso, M., Naka, Y., Angkawidjaja, C., Yamaguchi, T., Matoba, T. & Takamura, H. 2010. Antioxidant and Damage Prevention Activities of the Edible Parts of Gnetum gnemon and Their Change upon Heat Treatment. Journal Food Science and Technology, (Online), 16 (6): 549-556, (http://www.jstage.jst.go.jp/ article/fstr/16/6/549/_pdf), diakses 5 November 2011.
Susanti, A. 2009. Inhibisi Ekstrak Air dan Etanol Daun Asam Jawa san rimpang Kunci Pepet terhadap Lipase Pankreas secara in Vitro. Skripsi tidak diterbitkan. Bogor: MIPA IPB. Winarno, F.G. 1988. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
