Ciclo Celular: Introdução
Rodrigo Martins ICB _ LaNCE _ HU
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Células são geradas a partir de células e a única maneira de se fazer nova célula é a DIVISÃO de uma célula pré‐existente
De bactérias a mamíferos multicelulares
Ciclos sucessivos de duplicação
Quando na presença de estímulos adequados as células podem se multiplicar através de repetidos ciclos de proliferação e divisão celular, que em função dessa natureza cíclica, esse ciclo de vida das células proliferantes foi denominado CICLO CELULAR
> Proliferação Celular vs. Crescimento Celular > Nem todas as células precisam crescer para se dividir
Divisão Celular em Blastômeros
Roteiro • • • • •
Fases do Ciclo Celular Relevância da Pesquisa sobre Ciclo Celular Histórico Os “Artistas do Espetáculo”: Ciclinas e CDKs Métodos de Estudo do Ciclo Celular
Copiar e segregar/dividir material genômico de modo perfeito!
Fases do Ciclo Celular
> Mitose pode ocorrer sem citocinese > Formação de célula com muitos núcleos > Embriões de Drosophila
Particularidades do Ciclo Celular durante a Organogênse/ Desenvolvimento de Organismos Multicelulares
Mitose G0 G1
(pós-mitótica) “Nascimento”
Ciclo Celular está Acoplado a
G2
Mecanismos de Diferenciação Celular
**divisões simétricas vs. assimétricas
Síntese de DNA (S)
Divisão Meiótica Gera Células Germinativas Haplóides
Relevância do Estudo do Ciclo Celular
Biologia do Desenvolvimento
wt
Sox2
Microftalmia Fantes et al. Nature Genet. 33: 461‐2, 2003 Olena et al. Genes and Dev. 20: 1187‐02, 2006
A Retina de Vertebrados
Coordenação entre Proliferação, Saída do Ciclo e Diferenciação é Crucial para Formação da Retina
Mitose
Desenvolvimento Proliferação Saída do Ciclo Celular Especificação do Tipo Celular Morte Celular
Fase S
Migração Sinaptogênese
Particular Importância do Controle de Ciclo Celular para o Desenvolvimento da Retina
Saída Precoce do Ciclo
Functional Retina Retinoblastoma
Saída Tardia do Ciclo
Importância Clínica do Estudo do Ciclo: Biologia do Câncer Saída de um estado quiescente para um estado de proliferação celular ativa é um pré‐requisito para formação de diversos tumores
Necessidade de Controle Inequívoco do Estado Pós-mitótico
Células‐Tronco e Terapias Celulares Células Multipotentes com capacidade de gerar diferentes tipos celulares / tecidos / órgãos
Teratomas
Prêmio Nobel O Nobel em Fisiologia ou Medicina de 2001 foi dado a pesquisadores que fizeram descobertas sobre os mecanismos moleculares do ciclo celular (proteínas cdk e ciclina e seus mecanismos de ação).
Leland Hartwell
Tim Hunt
Paul Nurse
Evans, R., Rosenthal, E.T., Youngblom, J., Distel, D. & Hunt, T. Cyclin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. Cell 33, 389–396 (1983) Nurse, P. et al. Genetic control of the cell division cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol. Gen. Genet. 146, 167–178 (1976). Hartwell, L. H., Culotti, J., Pringle, J.R. & Reid, B.J. Genetic control of the cell division cycle in yeast. Science 183, 46‐51 (1974). Hartwell, H. L.,Culotti, J. & Reid, B. Genetic control of the cell‐division cycle in yeast. I Detection of mutants. PNAS 66, 352–359 (1970).
Periódicos Internacionais Especializados
Desde 2002 www.landesbioscience.com/journals/cc/
Histórico
Omnis cellula e cellula “ Toda célula se origina de outra célula similar pré‐existente.“ 1858
Rudolf Virchow, 1821 – 1902
Robert Remak, 1815‐1865
Na vidada para o XX, a divisão celular foi estudada em detalhe por embriologistas e microscopistas •
Eduard Strasburger (1875), botânico, e Walther Flemming (1979), que estudava células animais, são considerados os descobridores da MITOSE;
•
Flemming descreveu a cromatina e ambos deduziram que o núcleo estaria relacionado com hereditariedade;
Walther Flemming, 1843 – 1905
Eduard Strasburger, 1844 ‐ 1912
• Nas décadas de 1970 e 1980, novas metodologias de biologia molecular permitiram os pesquisadores das áreas de biologia celular, bioquímica e genética, de forma conjunta, elucidar os mecanismos moleculares de controle do ciclo celular;
• Novamente, o progresso científico foi fruto das pesquisas e descobertas terem sido feitas em diversos organismos vivos cada um com suas “vantagens” biológicas ou metodológicas;
• Embriologistas vs. Geneticistas Embriologistas ‐ Anfíbios, Ouriço do mar e outros invertebrados marinhos Geneticistas ‐ Leveduras
“Cell Cycle Classics”
Pesquisas em leveduras levaram a descoberta de Genes essenciais para o Ciclo Celular • Reprodução rápida • Genoma relativamente pequeno ( em torno de 1% do nosso) • Fácil manipulação genética • Rápida identificação e caracterização de mutantes genéticos;
Genes Cdc (Cell‐division cycle) Busca sistemática por mutações que inativavam genes necessários para o ciclo/divisão celular
Cdc15 selvagem
Cdc15 mutante
Muitas Descobertas sobre a Bioquímica do Ciclo foram feitas Estudando de Ovócitos Anfíbios 1 ovócito de Xenopus tem 1mm de diâmetro e um volume de citoplasma 100.000 vezes maior que uma célula humana; • Fertilização dispara Divisão por Clivagem* do ovócito; • Total de 4096 células em 7 horas ( ~15 minutos de fase S e M) • Fases G1 e G2 indetectáveis; • Fácil de injetar substâncias nas células e observar efeitos no ciclo. •
Descoberta do MPF (“Maturation promotion factor”) Maturação = indução de entrada em meiose MPF = complexo proteico formado pelas ptns : Cinase Cdc2 (hoje também chamada de Cdk1) e Ciclina B2
Masui e Markert, 1971 - J. Exp. Zool. 177: 129-146
A “natureza” do MPF (“Maturation promotion factor”)
Gerhart, J.; Wu, M. & Kirschner, M. J. Cell Biol. 98: 1247-1255, 1984
Newport, J.W. & Kirschner, M. Cell 37: 731-742, 1984
ATIVIDADE DO MPF DEPENDE DE SÍNTESE PROTÉICA
COMPORTAMENTO CÍCLICO DO MPF
IDENTIFICAÇÃO DE CICLINAS EM OVOS DE INVERTEBRADO MARINHO
MPF E CICLINAS
Hunt, T.; Luca, F.C. & Ruderman, J.V. J. Cell Biol. 116: 707-724, 1992
Cdc2 = CDK1 !! Alguns dos genes essenciais para divisão das leveduras codificavam exatamente proteínas que mediavam a atividade bioqímica/biológica do MPF
“MPF was first known for its function, then as a protein and finally as a gene. In contrast, CDC28 (S. cerevisiae) or cdc2 (S. pombe) was first described as a gene with a known function and only later was the protein identified. Cyclin was first discovered as a protein, then as a gene and finally its function was known as a component of MPF”
Os Artistas do Espetáculo: Ciclinas e CDKs •
Ciclinas – Proteínas cuja expressão varia de forma dependente da fase do ciclo celular
• CDK (cinases dependentes de ciclina ) 1‐ Proteínas cinase ‐ capazes de transferir radicais fosfato para seus substratos (vídeo) 2‐ CDKs são serina‐treonina cinases 3‐ Atividade de cinase das CDK depende de associação com as ciclinas 4‐ Eventos pós‐traducionais de fosforilação e defosforilação contribuem para a ativação plena das CDK
Moléculas Reguladoras do Ciclo são extremamente conservadas evolutivamente
Em camundongos, por exemplo, existem aproximadamente 20 enzimas CDK, mas somente algumas regulam a transição entre as fases do ciclo celular (ex: CDK1, CDK2, CDK4, CDK6 e CDK7
A fosforilação de dezenas de substratos celulares por enzimas CDKs específicas em estágios específicos do ciclo celular induz modificações funcionais dos diferentes substratos Eventos como a desmantelamento da membrana nuclear, condensação da cromatina, indução da replicação do DNA e montagem dos fusos mitóticos dependem das fosforilações mediadas por diferentes CDKs Alterações cíclicas na atividade das CDKs depende da associação dessas cinases com as ciclinas. Ao contrário das CDK, cuja expressão não varia muito, a expressão das ciclinas muda dependendo da fase ciclo celular. • A transição entre as fases do ciclo celular é regulada por diferentes complexos ciclina/CDK
• Como as células conseguem variar a quantidade das ciclinas ? Transcrição Gênica e Síntese de proteínas vs. Proteólise Controlada Ubiquitinação e Degradação proteossomal
CDK1 regula Mitose e tem degradação mediada pelo complexo APC (“anaphase‐promoting complex”)
Além da Expressão de Ciclinas (transcricional vs. proteólise) a atividade das CDKs também é regulada por eventos PÓS‐TRADUCIONAIS
Regulação Pós‐traducional da Ativação de CDK1
Wee1 CAK (MO15, Cdk7/CycH)
Cdc25
Regulação Simplificada da Transição G1-S do Ciclo Celular
G0 (Pós-mitótica)
“Rb” G1
Proto‐oncogenes (MYC)
Ciclina/CDK
S
Reguladores “Upstream”
Ativação de vias de sinalização por Mitógenos
“Rb” Ciclina / CDK Entrada na fase S
“Rb” = Rb, p107 ou p130
Ciclina D1 CDK4/6 Ciclina D3 CDK2 Ciclina E
Proteínas Rb: Supressores de Tumor que controlam o Ciclo Celular
• RBL: Terceiro tipo de câncer pediátrico mais comum
• Enucleação: Perda de visão
Rb1 +/-
• Somente ~10% de sobrevivência quando ocorre metástase
Proteínas CKI (CDK inhibitor) Inibem as CDKs
Regulação Simplificada da Transição G1-S do Ciclo Celular
G0 (Pós-mitótica)
“Rb” G1
Proto‐oncogenes (MYC)
Ciclina/CDK
S
Reguladores “Upstream”
“Rb”
Supressores de Tumor (p53/Arf)
CKI
Ciclina / CDK
CKI Entrada na fase S
“Rb” = Rb, p107 ou p130
Kip p21 p27 p57
Ink p15, p16 p18, p19
Ciclina D1 CDK4/6 Ciclina D3 CDK2 Ciclina E
Pontos de Checagem ou Checkpoints
É necessário um controle de qualidade da replicação do DNA
A perfeição na divisão mitotica é crucial para que os cromossomos duplicados sejam corretamente distribuídos para as células‐filha
O ambiente está propício para que a célula continue se proliferando e entre na fase S novamente?
Mecanismos Moleculares de Checkpoints regulam diretamente a atividade das CDKs
Técnicas de Estudo Como determinar em que fase do ciclo celular uma célula está? Análogos de timidina são incorporados ao DNA na fase S do Ciclo
Timidina Tritiada 3[H]
Bromodeoxi-Uridina – BrdU Iododeoxi-Uridina - IrdU
Citofluorometria
Uso de múltiplos marcadores de Fase S permite detectar Re-Entrada no Ciclo Celular
P30 “p107‐single” In vivo BrdU 24 h
In vivo
In vitro
intervalo
3[H]‐timidina
48 h
24 h
Comparando a Quantidade Total de Células Proliferantes
3[H]‐thymidine
retinas
3[H]‐thymidine H3-thymidine
RbRB1
Proportion of progenitors dividing at that developmental stage for each animal
3[H]‐thymidine H3-thymidine
Kip1
Kip1 p27p27
time (hr)
Estudo da Cinética de Progressão no Ciclo Celular: Saída do Ciclo Celular ou Aumento do tempo de Ciclagem? (Exit or Lengthening? )
Proporção de células proliferantes se dividindo Velocidade de progressão no ciclo celular
time (hr)
Infecção por Retrovírus Incompetente de Replicação no Estudo da Proliferação Celular (Expansão Clonal) E14.5
retina
retinas
10 dias de cultura
Retrovírus Incapaz de Replicação
1 1
1
2 4 3 15 6 7 8 9
Clone de 9 células
Modelos de Estudo mais Modernos Repórter fluorescente das diferentes fases do ciclo celular in vivo
Sakaue‐Sawano et al., 2008 Cell. 132(3):487‐98. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell‐cycle progression
Mais Informações • Molecular Biology of THE CELL ‐ Cap 17 • http://www.hchs.hunter.cuny.edu/wiki/index. php?title=19th_Century_Science • http://www.nature.com/ncb/journal/v3/n1/fu ll/ncb0101_e1.html
