TEKNIK KLONING

PENERAPAN TEKNIK-TEKNIK KLONING GEN DALAM KEHIDUPAN MANUSIA MIZAWARTI,S.SI Program Studi Biologi Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara I. Pendahuluan 1.1

Lahirnya Kloning Gen Kira-kira satu abat yang lalu Gregor Mandel telah merumuskan aturan-aturan untuk menerangkan pewarisan sifat-sifat biologis. Sifat-sifat organisme yang dapat diwariskan diatur oleh suatu faktor yang disebut gen, yaitu suatu partikel yang berada di suatu di dalam sel tepatnya di dalam kromosom. Gen menjadi dasar dalam pengembangan penelitian genetika meliputi pemetaan gen, menganalisis posisi gen pada kromosom. Hasil penelitian telah berkembang baik diketahuinya DNA sebagai material genetik beserta strukturnya, kode-kode genetik serta proses transkripsi dan translasi dapat dijabarkan. Suatu penelitian yang merupakan revolusi dalam Biologi medern adalah setelah munculnya metode teknologi DNA rekombinasi atau rekayasa genetika yang inti prosesnya adalah kloning gen yaitu suatu prosedur untuk memperoleh replika yang dapat sama dari sel atau organisme tunggal. II. Langkah-langkah dasar Kloning Gen Ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai berikut : 1. Suatu frakmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada molekul DNA sirkular yang di sebut sektor untuk menghasilkan chimoera atau molekul DNA rekombiner. 2. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk kedalam sel tuan rumah ( host ) yang biasanya berupa bakteri, walaaupun sel-sel jenis lain dapat di gunakan. 3. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau turunan yang identik, baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya. 4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi diwariskan pada progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya. 5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klonsel host yang identik Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinasi dengan demikian dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul rekombinasi telah diklon. III. Wahana dan ketrampilan dasar untuk Kloning Gen Komponen penting dalam eksperimen kloning gen adalah wahana yang membawa gen masuk sel tuan rumah dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai wahana suatu molekul DNA harus mampu memasuki

©2003 Digitized by USU digital library

1

sel tuan rumah serta dapat mengadakan replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah besar. Dua jenis molekul DNA alamiah yang memenuhi persyaratan tersebut adalah : 1. Plasmid, merupakan molekul DNA sirkuler yang terdapat dalam bakteri dan berbagai organisme lain. Plasmid dapat melakukan replikasi dengan tidak tergantung pada kromosom sel tuan rumah. 2. Krimosom virus, terutama bakteriofog, yaitu virus yang harus menginfeksi bakteri pada waktu infeksi molekul DNA bakteriofog diinfeksikan ke dalam sel tuan rumah, dan kemudian DNA ini mengalami replikasi. Molekul DNA plasmid dan bakteriofog mempunyai sifat-sifat dasar yang ditentukan sebagai wahana kloning, namun sifat ini tidak berguna tanpa adanya tehnik-tehnik eksperimen untuk manipulasi molekul DNA di dalam laboratorium. Ketrampilan dasar untuk melakukan kloning secara sederhana adalah : 1. Preperasi sampel DNA murni 2. Pemotongan DNA murni 3. Analisis ukuran fragmen DNA 4. Penggolongan molekul DNA 5. Memasukan molekul DNA ke dalam sel tuan rumah 6. Identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinasi. IV. Tehnik-tehnik Kloning Gen 2.1. Pengklonan c DNA Sebagian besar, metode-metode yang digunakan oleh perusahaanperusahaan pengklonan gen untuk memperoleh DNA rekombinan yang terdiri dari gen yang diinginkan dalam vektor ekspresi, adalah sama yang digunakan dalam laboratorium-laboratorium penelitian. Karena banyak protein yang bernilai komersil hanya terdapat dalam jumlah kecil dalam sel-sel dan jaringan hewan, dan karena ekspresi gen flon itu sangat penting, maka banyak pekerjaan komersial itu terpusat pada pengklonan c DNA dari mRNA-mRNA yang terdapat dalam jumlah sangat kecil didalam sel. Pendekatan lain yang digunakan untuk memperoleh insulin manusia, adalah sintesis kimia dari suatu gen. Hampir setiap molekul mRNA eukariot pada ujung 3’-nya mempunyai rangkaian resedu nukleotida adenin yang disebut ekor poli-A. Apapun fungsinya, poli-A itu memberikan jalan yang mudah untuk mensintesis suatu untaian DNA yang komplementer terhadap mRNA-nya. JIKa rantai-rantai pendek dari oligo –dT dicampur dengan mRNA, rantai tersebut berhibridasiasi ke ekor poli-A untuk memberikan suatu primer untuk aksinya enzim transfriptase balik. Enzim ini, yang disolasikan dari virus-virus tumor RNA tertentu dapat menggunakan RNA sebagai cetakan untuk mensintesis suatu untaian DNA. Hasil reaksinya adalah suatu hibrida RNA-DNA, untaian DNA yang baru itu mempunyai lingkaran tusuk konde pada ujungnya, tampaknya sebagai hasil dari enzim “ memutari sudut “ dan mulai mengkopi dirinya sendiri. Lingkaran tusuk konde itu mungkin merupakan suatu artefak ( sesuatu yang buatan ) ‘in vitro’ tetapi ia memang memberikan suatu primer yang sangat mudah untuk pembuatan untaian DNA yang kedua. cDNA ( DNA komplementer ) berantaian ganda yang dihasilkan mempunyai lingkaran tusuk konde yang utuh ini dapat dibelah oleh S1 nuklease, yaitu suatu nuklease spesifik yang beruntaian tunggal. Molekul cDNA yang beruntaian ganda yang diperoleh dengan cara tersebut, lalu disiapkan untuk disisipkan kedalam pBR 322, dengan jalan pemberi ekor dengan


2

terminal transferase atau dengan menambahkan tempat-tempat enzim restriksi buatan pada ujung-ujung cDNA-nya. Tempat-tempat restriksi ini yang kita sebut ‘penyambung” ( “linker”) adalah oligunekloitida-oligunekloitida dari 8 sampai 10 pasangan basa yang dibuat secara kimia.Penyambung-penyambung itu ditambahkan pada cDNA beruntaian ganda dengan menggunakan DNA ligase, lalu penyambung-penyambung itu digunting hingga terbuka dengan enzim restriksi, dan cDNA-nya, yang sekarang mengandung ujung-ujung lekat yang dihasilkan oleh enzim tadi, dimasukkan ke dalam pBR 322 yang telah di belah dengan enzim yang sama. Kemudian plasmid rekombinan yang mengandung cDNA yang di hasilkan itu, dimasukkan ke dalam strain “ E. coli “ yang sesuai dan dikembangbiakkan. 2.2 Gen pengklonan : DNA rekombinan Bakteri merupakan mesin-mesin efesien untuk untuk menciptakan turunuan identik DNA bacterifogdalam jumlah. Begitu masuk dalam sel imangnya. DNA fag tersebut berlipat ganda berkali-kali, turunan dikemas kedalam partikel-partikel berdaya tulang, baru dilepas dari sel inangnya sehingga siap mengulangi daur infeksitersebut. Jika kita adapat menempelkan gen eukariotik kepada molekul DNA fag seperti itu, maka dapat direflikasi dengan cara yang sama sekali lagi endonukliase restriksi memungkinkan musliaht itu. Ekori adalah endonuklease resttriksi yang dihasilkan oleh “E. koli” . enzim ini membelah DNA hanya ditempat yang meliputi rangkaiannya. Setiap utusan pilihan ganda itu dipotong diantara buangin dan adenin. Setiap kali hal ini terjadi ujung-ujung belahan filman ganda itu membaawa panjang tambahan emapt nukleotida. DNA yang berpasangan (berhelai tunggal), yang dinamai ujung “lengket” karena mapu berpasangan basa dengan molekul DNA yang manapun mengandung ujung lengket pelengkap. Gagasannya adalah memperlakukan kedua DNA eukariotik dan DNA bakteriopag dengan endonuklease retriksi yang sama sehingga tercipta ujung-ujung pelengkap pada masing-masing. Dalam keadan yang sesusai, secara bercampur molekul-molekul DNA eukariotik akan menempel pada molekul-molekul DNA dengan ujung-ujung lengketnya masingmasing. Kemudian DNA ligase dapat dipakai untuk mengaitkan secara kovalen molekul-molekul itu bersama. Beberapa dari hibrid atau molekul-molekul rekombinan ini akan tetap berdaya infeksi pada inang bakteriofognya (ekoli) sebagaimana bakteriofog yang normal. Hal ini dapat dideteksi dengan membiarkan ekoli terbuka bagi campuran molekul DNA rekombinan dan selanjutnya menabur selsel pada cawan fetri berisi agar. Sel-sel bakteri itu mulai berkembang biak, membentuk selaput sel-sel dipermukaan agar. Akan tetapi, setiap sel yang secara berhasil diinfeksi oelh molekul-moleku DNA rekombinan akan membentuk banyak turunan baru DNA rekombinan tersebut sebelum dibunuh dan dilisis. Molekul-molekul yang infektif dilepas, menginfeksi sel-sel terdekat, dan proses itu diulang. Akibatnya segara nampak pada mata dengan mata telanjang sebagai zona atau plak sikular yang jernih pada “padang” sel-sel . setiap plak merupakan suatu “flon” molekul-molekul DNA dan dapat diriakkan secara tak terbatas dengan meninfeksi lebih banyak sel ekoli. Walau setiap plak (plague) menghasilkan ikon unit molekul-molekul DNA rekombinan, potongan “dari DNA” eukariotik yang ada pada plak tertentu merupakan kebetulan semata-mata. Pencernaan semua DNA dalam sel-sel organisme eukariotik seperti mencit atau tikus oleh oleh endonuklease restriksi menghasilkan kumpulan fragman DNA yang sangat beragam. Fragman-fragman ini tergabung pada DNA bakteriofag secara acak semata-mata. Pengklonan fragmen yang merupakan seluruh genam suatu organisme dinamakan pengklonan “senapan”.


3

Kini masalahnya adalah salah satu temuan dari satu atau lebih plag (mungkin dari beberapa ribu ) yang mengandung gen edukariotik yang menarik perhatian kita. Untuk ini diperlukan suatu “tolok”. Misalnya kitya mencari DNA kelinci yang menjadikan lantai-lantai hemoklobinnya. Sebagaimana kita ketahui, RNA pesuruh untuk rantai-rantai ini dapat diisolasi dari prekursor sel-sel darah merah kelinci. Pesuruh-pesurh ini dapat diisolasi dari prekursor dan dapat diberi label isotop radio aktif dan digunakan untuk mencari plak-plak yang mengandung rangkaian DNA pelengkap, yaitu rangkaian DNA yang dari pada pesuruh-pesuruh hemoglobin ini ditranskripsi. Inilah prosedurnya, sehelai kertas saring yang dibuat dari nitro selulosa secara perlahan ditekan pada permukaan lempengan agar yang berplak. Beberapa dari DNA pada setiap plak diserap oleh kertas saring tadi. DNA yang terserat itu kemudian diubah sifatnya menjadi pelayan tunggal, dan kertas saring yang dicelupkan kedalm kedalam larutan yang berisikan molekul-molekul DNA rekombinan yang menyatakan rangkaiannya yang dicari itu. Karena plak-plak asal tidak menjadi rusak karena prosedur ini, maka molekul-molekul tambahan sampel khusus DNA rekombianan itu dapat dibiakkan dalam sel-sel “koli” tambahan untuk memproduksi sebanyak turunan sampelnya yang diinginkan. Maka inilah satu cara (namun bukan satu-satunya cara) untuk mencapai tujuan terdekatnya yaitu sampel murni suatu gen eukariotik. Prosesnya mungkin tanpak rumit, tetapi sungguh sangat langsung dan akhirnya tujuan dapat diacapai. 2.3. Pengklonan Individu Kromosom karena sekarang terdapat kemungkinan untuk menyortir kromosomkromosom manusia secara fisik kedalam klas-klas ukurang yang terpisah dengan suatu prosedur yang dikenal sebagai sortasi sel yang teraktifasi fluoresens (FACS : fluoresende-activa-ted celsorting). Maka terbukti kemungkinan untuk mengkon DNA dari individu kromosom. Misalnya, mulai dengan suatu galur sel manusia dengan kariotip yang abnormal (empat kromosom X) terdapat kemungkinan mensortir cukup banyak kromosom X manusia yang bebas dari autosom untuk dapat membuat suatu perpustakaan fag X dari DNA kromosom X itu. Bersama-sama, pag-pag rekombinan dalam perpustakaan itu mempunyai sebagian besar, jika tidak dapat dikatakan semua, DNA kromosom X. Maka dari itu semua tehnik yang telah dilukiskan dari itu semua tehnik yang dilukiskan sebelumnya dapat digunakan untuk menganalisis DNA kromosom X, memetakan tempat-tempat restriksi, mengidentifikasi rangkaian-rangkaian alu yang berulang, dan mancari gen-gen yang diketahui akan terbawa pada kromosom X tersebut. Satu tugas yang sekarang dapat dilakukan adalah mencari polimorpisme tempat restriksi untuk menentukan adakah yang terapuaut erat dengan salah satu pemyakit genetik yang terpeta kadar kromos X. jika, misalnya dapat ditunjukkan bahwa suatu pola tertentu dari tempat-tempat enzim restriksi terpaut erat pada distropi otot Duchenne dan tidak terdapat pada individu-individu normal, maka da kemungkinan besar untuk mendiagnosis penyakit, genetik yang umum dan letal ini, bahkan sebelum kita mengetahui gentermutasi dimana yang bertanggung jawab untuk hal itu. 2.4. Pengklonan Onkogen Manusia sekarang ini 3 onkogen manusia yang diduga telah diklon dengan menggunakan teknik penyaringan alu dan teknik banntuan tRNA. Sudah emapt laboratorium yangh berlainan yang cecara sendiri-sendiri telah mengklon gen-gen kangker kandung kemih. Semua gen ini tampak sama (berukuran mendekati 5,4 kb), tetapi kesamaan ini mungkin mencerminkan kenyataan, bahwa galur-galur sel yang dianggap berlainan ini mempunyai sumber yang sama. Gen neuroblastoma sekarang juga telah diklon secara lengkap dengan menggunakan metode bantuan TRNA yang memperlihatkan gen mendekati 13,5 kb mengklon gen kangker kolon


4

(paru-paru) terbukti lebih sukar mencapai, karena ia teralu besar untuk diklon dalam sepotong fag. 35 macam fag, yang masing-masing mengandung rangkaianrangkaian varsail yang tumpang tindih, mula-mula diisolasi lalu dianalisis dengan menggunakan tehnik-tehnik penyaring Alu dan homologi pada rangkaian gen ras virus sarcoma Kirsten, prosedur gen ini berkembang yang kemudian digunakan untuk menentukan struktur gen 45 kb. Meskipun variasi ukurannya besar, namun gen-gen kanker kandung kemih, neuroblastoma, dan kanker kolon ( paru-paru ) mempunyai susunan dasar exonintron yang sama, dengan empat exon yang digunakan untuk mengklode protein yang serupa tetapi berlainan dengan berat molekul masing-masing sekitar 21.000 (p21). Protein-protein p21 itu ditemukan terikat dalam jumlah kecil pada membran plsma luar sel-sel kanker, dan mereka secara homolog erat dengan produk dari gen-gen kanker yang ditemukan sebelumnya pada retrovirus onkogen. Gen kanker kandung kemih manusia sangat serupa dengan ras onkogen virus sarkoma Harvey, sedangkan gen kanker paru-paru sangat mirip dengan ras onkogen virus sarkomi Kirsten. Seperti onkogen-onkogen retro virus, gen-gen kanker manusia ini mempunyai ekuivalen sel normal mereka, memang gen-gen kanker itu diduga berasal dari ekuivalen-ekuivalen sel normal mereka melalui mutasi yang dengan cara tertentu membawa onkogen yang potensial kepada produk-produk proteinnya. Langkah berikutnya yang masuk akal adalah merangkai onkogen-onkogen manusia maupun ekuivalen-ekuivalen normal mereka.Hasil pertama semacam itu menunjukkan bahwa gen kanker pada sel-sel tarsinoma kandung kemih manusia berbeda dari imbangannya dalam sel-sel normal dalam satu mutasi titik tunggal. Mutasi itu mengubah sisa glesin pada posisi 12 dalam produk protein normal (protein p12) menjadi paling dalam protein sel-sel carcinoma tersebut. Akan tetapi, pada saat ini belum ada bukti bahwa perubahan sederhana ini merupakan satu-satunya penyebab carcinoma kandung kemih, dan kita juga tidak mengetahui peranan protein p12 itu dalam keadaan normal maupun keadaan mutasi. 2.5 Pengklonan hewan Klon-klon yang ditangani oleh para ahli biologi molekular, biasanya klon-klon dari bakteri atau organisme lain, sel-sel dalam kultur jaringan dan akhir-akhir ini molekul-molekul DNA. Para ahli taman dan pemulia tanaman sebaiknya, secara teratur menangani dan memproduksi organisme-organisme tinggat lebih tinggi yang diklon, tanaman-tanaman yang mereka biakkan dengan pemangkasan, enten, pembelahan umbi dan rhizoma (akar rimang) dan sebagainya. Tumbuhan tinggi memberi kemungkinan untuk reproduksi aseksual dan klon; untuk banyak spesies liar, pembiakan aseksual lebih penting daripada pembiakan seksual. Sebaiknya hewan-hewan tingkat alami tidak bereproduksi secara aseksual. Untuk mengklon seekor binatang perlu untuk mengambil nukleus dalam telur yang telah dibuahi, baik melalui pembedahan, maupun menonaktifkannya secara total dengan radiasi dan menggantikannya dengan nukleus yang diambil dari individu lain. Ini memerlukan transplankasi suatu nukleus utuh yang tidak rusak dan mampu untuk berkembang. Demikianlah, nukleus-nukleus yang dicangkokkan dari sel-sel embrio katak yang sangat muda, yang masih totipoten, dapat melahirkan katak-katak dewasa. Sebaliknya, nukleus-nukleus yang ditransplantasi dari katak ‘dewasa’ sampai kini sekian jauh belum pernah mampu meningkatkan perkembangan hewan dewasa ; proses perkembangannya selalu gagal pada tahap embrional atau larva tertentu. Transplantasi nukleus dengan telur-telur katak pertama kali dicapai dalam tahun 1952, tetapi tentu saja akan lebih menarik untuk membiakkan mamalia secara aseksual daripada katak. Masalah-masalah teknis dari reproduksi mamalia dengan transplantasi nukleus, sebaliknya adalah jauh lebih besar karena sangat sukar untuk


5

memanipulasi telur-telur mamalia tanpa merusaknya. Pada tahun 1981, serangkaian percobaan semacam itu dengan tikus, telah dilaporkan, tetapi belum diulangi dan diperbuat secara bebas. Sebelum metode-metode itu dapat direproduksi, mereka tidak akan memberi sumbangan yang berarti pada pengertian kita tentang perkembangan mamalia. Dalam masa dekat hanya terdapat kemungkinan kecil bahwa transplantasi nukleus dicoba pada spesies mamalia lain. Jika efisiensi dan reproduksibilitasnya dapat ditingkatkan, maka mungkin metode itu akan mendapat tempat di bidang penangkaran hewan. Dalam teori ia dapat dicoba pada telur-telur sel embrio manusia, tetapi untuk alasan apa? Tidak ada penerapan praktis. Dan perlu ditekankan bahwa belum terbukti ada kemungkinan bahwa dengan katak sekalipun untuk menghasilkan suatu individu dewasa yang diklon melalui pencangkokan nukleus sel dewasa ke dalam sebuah telur. Komplotan jutawan tua golongan gothik yang membujuk para dokter untuk mengklon beberapa kopi dari dirinya sendiri dengan pencangkokan nukleus-nukleus selnya kedalam telur-telur yang dibuahi dan kemudian menanamkannya pada wanita, tetapi merupakan fantasi murni, untuk katak tua sekali pun, hal itu tidak dapat dilakukan. 2.6 Pengklonan Hormon Pertumbuhan Manusia Produksi hormon pertumbuhan manusia dalam ‘E.coli’ menarik perhatian orang pada beberapa prilaku rekayasa genetika. Hormon pertumbuhan manusia (HGH= Human Growth Hormone) adalah suatu rantai polipeptida tunggal yang mempunyai 191 asam amino dan diproduksi dalam kelenjar pituiteria (kelenjar pada infundibulum otak). Seperti insulin, ia tidak terglirosilasi. Hormon pertumbuhan mengendalikan pertumbuhan tubuh kita ; tubuh kecil orang kerdil disebabkan karena kekurangan hormon pertumbuhan. Dengan menggunakan kombinasi dari sintesis kimia DNA dan sintesis enzimatik cDNA, telah diproduksi suatu rangkaian yang mengkode asam-asam amino 1-14 telah disintesis secara kimia.Langsung di depan kodon pertama, ditambahkan suatu trio (triplet) basa (ATG) yang menspesifikasi asam amino metionin.Bila permulaan dari gennya telah disintesis secara kimia untuk menjamin permulaan yang tepat dari proteinnya, maka diperoleh suatu rangkaian DNA yang mengkode sisa dari rantai polipeptida yaitu, residu asam amino 25-19,1 dengan membuat kopikopi cDNA dari preparat-preparat nRNa darii sel-sel pituitaria manusia. Kedua fragmen DNA ini kemudian dikonkan secara terpisah. Fragmenfragmen DNAnya dimurnikan kembali dan disambung menjadi satu untuk menghasilkan rangkaian DNA lengkap untuk horman pertumbuhan manusia mulai dengan suatu prodon inisiator yaitu metionin, diikuti oleh rangkaian untuk 191 asam amino dalam frotein masak, dan berakhai dengan sinyal untuk menghentikan sintesisi frotein. Kemudian “gen”dimasukkan kedalam suatu fektor ekspresi dan dimasukkan kedalam “ekoli” diaman diarahkan untuk membaut pertumbuhan manusia. V. PENUTUP Saat ini telah dikembangkan tehnik-tehnik mengisolasi gen terpilih, yaitu kloning dan menenukan rangkaian neuklitidanya. Gen-gen enkariotik dan juga prikariotik dapat diklon dengan menyisipkannya dalam sepotong DNA, yang dapat di reflikasi dala inang bakterinnya. Bakteriopag dan flasmi membentuk “DNA Rekombinan” yaitu dengan peleburan DANnya. Selain itu tehnik-tehnik untuk menyisipkan gen-gen asing kedalam eukariotik dan prokariotik turut bekembang dan gen-gen ini secara efesien ditranskripsi dan


6

translasi. Tehnik-tehnik DNA rekombianan ini sudah dieploitasi dalam pembuatan protein-protein manusia yang berniai hanya oleh bakteri dan khamir. Ada juga kemungkinan bahwa tehnik-tehnik tersebut pada akhirnya dapat memungkinkan untuk memperbaiki fungsi gen yang efektif pada eukariotik atau memberikan fungsifungsi gen yang baru baginya.

DAFTAR PUSTAKA 1.

Kimbal, John W. 1989.

Biologi . Edisi kelima cetakan kedua. Penerbit

Erlangga. Jakarta 2. Muhammad, S.A. 1991. Pengantar Kloning Gena. Yayasan Esentia Medica Yogyakarta 3. Roberts, J.A. Fraser, Pambrey, Marcus E. 1995. Genetika Kedokteran. Suatu Pengantar.Edisi kedelapan Cetakan Pertama Penerbit

Buku

kedokeran

(EGC) Jakarta. 4.

Watson, James D., Tooze, John, Kurtz, David T. 1988. DNA Rekombinan. Penerbit Erlangga Jakarta


7

TEKNIK KLONING

Recommend Documents