Beberapa penelitian terdahulu melaporkan keberhasilan isolasi DNA Gracilaria menggunakan metode konvensional yakni metode isolasi menggunakan bufer-bufer tertentu yang disusun berdasarkan laporan penelitian terdahulu (Sahu et al., 2012; Saptasari, 2012; Shivji et al., 1992; Sui et al., 2002). Saptasari (2012) melaporkan bahwa penggunaan metode CTAB yang dimodifikasi menunjukkan hasil isolat DNA Gracilaria verrucosa yang memiliki kualitas dan kuantitas yang baik yang dapat digunakan untuk PCR. Selain menggunakan metode konvensional, isolasi DNA total Gracilaria verrucosa juga dapat dilakukan menggunakan kit komersial dengan takaran bufer sesuai dengan protokol yang tercantum dalam kit tersebut. Terdapat beberapa kit komersial yang dapat mengisolasi DNA total tumbuhan dengan kualitas dan kuantitas yang baik (Sahu et al., 2012). Optimasi isolasi DNA diperlukan untuk mengetahui protokol yang efektif dan efisien digunakan dalam isolasi DNA Gracilaria verrucosa.
METODE Penelitian yang dilakukan bersifat deskriptif analitik untuk mengetahui hasil optimasi isolasi DNA Gracilaria verrucosa yang dilakukan berdasarkan protokol asli dan protokol modifikasi kit komersial yang digunakan. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah Gracilaria verrucosa kering. Isolasi DNA sampel dilakukan dengan 5 protokol asli dan 5 protokol modifikasi dari ketiga kit yang digunakan, yaitu kit Geneaid Genomic DNA Mini Kit (Plant), kit Macherey Nagel NucleoSpin Plant II, dan kit Vivantis GF-1 Plant DNA Extraction. Protokol asli merupakan protokol yang dirujuk dari petunjuk penggunaan masing-masing kit, sedangkan protokol modifikasi disusun berdasarkan hasil yang diperoleh pada setiap tahap yang dilakukan pada uji pendahuluan dengan protokol asli. Kesepuluh protokol isolasi DNA total yang digunakan terdiri dari beberapa tahap secara berurutan sebagai berikut: preparasi dan lisis mekanik, lisis kimiawi, pemisahan debris sel, presipitasi, pencucian, dan elusi. Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan membandingkan hasil yang diperoleh pada tiap tahap isolasi serta hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian isolat DNA menggunakan spektrofotometer Thermo-Scientific NanoDrop 2000 dengan metode rasio A260/ A280 dan A260/ A230.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Masing-masing protokol isolasi DNA menunjukkan hasil yang berbeda pada setiap tahapnya. Secara umum, kendala yang terjadi pada isolasi DNA Gracilaria verrucosa menggunakan protokol asli ada pada tahap lisis dan pemisahan debris sel, dan pencucian. Kendala yang terjadi diantaranya adalah sampel yang sulit tergerus, sampel yang menggumpal walaupun sudah diberi bufer lisis dan diinkubasi, pemisahan debris sel yang tidak sempurna, dan adanya residu di tepi membran column yang digunakan pada tahap pencucian. Kendalakendala tersebut menyebabkan hasil kuantifikasi yang rendah pada protokol asli. Modifikasi dilakukan pada semua tahap isolasi DNA yang meliputi preparasi dan lisis mekanik, lisis kimiawi, pemisahan debris sel, presipitasi, pencucian, dan elusi (Gambar 1). Hasil penelitian menunjukkan bahwa protokol modifikasi dari kit Geneaid Genomic DNA Mini Kit (Plant) merupakan protokol yang paling efektif dan efisien untuk mengisolasi DNA total Gracilaria verrucosa daripada sembilan protokol lain.
Perlakuan: Sampel yang akan digunakan direndam dalam etanol 10% dan disimpan dalam refrigerator bersuhu 4oC selama 21 hari kemudian dicuci dengan aquades steril dan ditimbang sebanyak 250 mg. Sampel kemudian digerus hingga halus dalam nitrogen cair. Hasil: Sampel tergerus dengan baik. Setelah digerus sampel berbentuk pasta padat.
Perlakuan: Sampel yang telah digerus diletakkan dalam mikrotube dan disimpan dalam refrigerator bersuhu -60oC selama semalam. Sampel kemudian diberi 1125 µl buffer GPX1+ 11,25 µl βmercapto ethanol + 25 µl RNase A kemudian diinkubasi dalam water bath bersuhu 60oC selama 30 menit. Selama inkubasi, sampel dibolak-balik setiap 5 menit. Sampel diberi 250 µL Buffer GP2 kemudian diinkubasi dalam es selama 3 menit. Hasil: Setelah penambahan GP2, warna sampel tetap jernih.
Perlakuan: Sampel diberi 1,5 volume Buffer GP3, divortex, kemudian dipindahkan ke GD Column dan disentrifugasi 16000 x g selama 2 menit. Flow through dibuang. Hasil: Supernatan terpisah menjadi 2 fase cair setelah penambahan GP3. Kedua fase cair tersebut tercampur setelah vortex. Warna hasil vortex bening.
Perlakuan: Sampel diberi 400 µL Buffer W1 kemudian disentrifugasi 16000 x g selama 1 menit, flow through dibuang. Sampel diberi 600 µL Washing Buffer kemudian disentrifugasi 16000 x g selama 1 menit, flow through dibuang. Tahap pencucian dengan Wash Buffer diulangi sebanyak tiga kali. Sampel disentrifugasi 16000 x g selama 3 menit untuk mengeringkan column. Hasil: Tidak ada residu berwarna coklat di tepi membran column.
Keterangan: = Tahap preparasi dan lisis mekanik = Tahap lisis kimiawi = Tahap pemisahan debris sel
Perlakuan: Sentrifugasi dengan kecepatan 1000 x g selama 2 menit. Hasil: Supernatan jernih dan tersaring semua. Di atas filter hanya ada debris sel yang tersaring.
Perlakuan: Sampel diberi 50 µL Elution Buffer, kemudian didiamkan selama 10 menit. Sampel disentrifugasi 16000 x g selama 1 menit untuk mengelusi DNA murni. mengulangi tahap elusi sebanyak satu kali. Hasil elusi dipindahkan ke mikrotube baru. Hasil: Isolat DNA hasil elusi bersih, tidak ada residu yang tampak. Konsentrasi DNA 30,1 ng/µL dengan kemurnian 1,89 (A260/ A280) dan 0,87 (A260/ A230).
= Tahap presipitasi = Tahap pencucian = Tahap elusi
Gambar 1 Isolasi DNA Gracilaria verrucosa Menggunakan Protokol Modifikasi Kit Geneaid Genomic DNA Mini Kit (Plant)
Modifikasi tahap preparasi dan lisis mekanik dilakukan dengan penambahan jumlah sampel menjadi 250 mg untuk meningkatkan konsentrasi isolat DNA. Modifikasi tahap lisis kimiawi dilakukan pada dengan penambahan jumlah bufer lisis yang digunakan menjadi 1125 µL, penambahan βmercaptoethanol pada bufer lisis sebanyak 11,25 µL, dan penambahan durasi inkubasi menjadi 30 menit. Penambahan jumlah bufer lisis dan durasi inkubasi dilakukan untuk memaksimalkan terjadinya lisis sel pada sampel Gracilaria verrucosa. Penambahan β-mercaptoethanol bertujuan untuk mengurangi kontaminasi polifenol pada isolat DNA (Sahu et al., 2012). Modifikasi tahap pencucian dilakukan dengan mengulangi tahap tersebut sebanyak tiga kali. Pencucian berulang dilakukan untuk meminimalkan jumlah residu reagen pada isolat DNA. Modifikasi tahap elusi dilakukan dengan mengurangi jumlah total Elution Buffer yang digunakan menjadi 100 µL pada setiap sampel dan mendiamkan sampel yang sudah diberi Elution Buffer selama 10 menit sebelum sentrifugasi. Pengurangan jumlah Elution Buffer dilakukan untuk meningkatkan konsentrasi DNA pada tiap µL isolat.
PENUTUP Kesimpulan Isolasi DNA Gracilaria verrucosa dengan kit komersial paling efektif dilakukan dengan jumlah sampel 250 mg, perendaman sampel dalam etanol 10% pada suhu 4oC selama 21 hari, penyimpanan sampel yang telah digerus pada suhu -60oC selama semalam, penambahan β-mercaptoethanol pada bufer lisis, penambahan waktu inkubasi, pengulangan tahap pencucian sebanyak tiga kali, dan pengurangan jumlah bufer elusi menjadi 100 µL. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini belum optimal untuk keperluan penelitian tahap selanjutnya. Saran Berdasarkan kesimpulan, optimasi isolasi DNA lebih lanjut masih diperlukan untuk memperoleh isolat DNA dengan konsentrasi dan kemurnian lebih tinggi yang dapat digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya.
DAFTAR RUJUKAN Darsono, P. 1999. Pemanfaatan Sumber Daya Laut dan Implikasinya Bagi Masyarakat Nelayan. Oseana, 24(4): 1-9. De Almeida, C. L., Falcao, H. S., Lima, G. R. M., Montenegro, C. A., Lira, N. S., De Athayde-Filho, P. F., Rodrigues, L. C., de Souza, M. F. V., BarbosaFilho, J. M. & Batista, L. M. 2011. Bioactivities from Marine Algae of the
Genus Gracilaria. International Journal of Molecular Sciences, 12: 45504553. Dharmawan, A., Setiawati, F. K. & Gofur, A. 2014. Pemanfaatan Rumput Laut (Gracilaria verrucosa Kualitas Rendah) dan Biota Hama sebagai Pakan Ternak dan Ikan. LP2M & Balitbang Provinsi Jatim. Sahu, S. K., Thangaraj, M. & Kathiresan, K. 2012. DNA Extraction Protocol for Plants with High Levels of Secondary Metabolites and Polysaccharides without Using Liquid Nitrogen and Phenol. International Scholarly Research Network Molecular Biology, 2012: 1-6. Saptasari, M. 2012. Analisis Variasi Genetik dan Hubungan Kekerabatan Varian Gracilaria verucosa (Huds) Papenfus di Jawa Timur Berdasarkan Penanda Morfologi dan Molekuler Mikrosatelit sebagai Penyusun Buku Belajar Sistematik pada Makroalga Berbasis Molekuler. Disertasi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Sui, Z. H., Zhang, X. C. & Cheng, X. J. 2002. Comparison of Phycobiliproteins from Gracilaria Lemaneiformis and Its Pigment Mutants in Spectral and Molecular Respects. Acta Botanica Sinica, 44 (5): 557-561. Shivji, M. S., Rogers, S. O. & Stanhope, M. J. 1992. Rapid Isolation of High Molecular Weight DNA from Marine Microalgae. Marine Ecology Progress Series, 84: 197-203.
