BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Tumbuhan Mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq.)
2.1.1. Morfologi Tumbuhan Mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq.)
Mahoni termasuk tumbuhan tropis dari famili Meliaceae yang berasal dari Hindia Barat. Tumbuhan ini dapat ditemukan tumbuh liar di hutan jati, pinggir pantai, dan dijalan-jalan sebagai pohon peneduh. Perkembang-biakannya dengan menggunakan biji, cangkokan, atau okulasi. Untuk tanaman mahoni yang akan digunakan sebagai tanaman obat, maka tidak boleh diberi pupuk kimia (anorganik) maupun pestisida. Buahnya pahit dan berasa dingin.(Harianja, 2008).
Tanaman ini merupakan tanaman tahunan dengan tinggi ± 5-25 m, berakar tunggang, berbatang bulat, percabangan banyak dan kayunya bergetah. Daunnya majemuk menyirip genap, helaian daun berbentuk bulat telur, ujung dan pangkalnya runcing, dan tulang daunnya menyirip. Daun muda berwarna merah, setelah tua berwarna hijau. Bunganya majemuk tersusun dalam karangan yang keluar dari ketiak daun. Buahnya bulat telur, berlekuk lima, berwarna cokelat. Di dalam buah terdapat biji
berbentuk
pipih
dengan
ujung
agak
tebal
dan
warnanya
coklat
kehitaman.(Yuniarti, 2008).
2.1.2. Sistematika Tumbuhan Mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq.)
Taksonomi tumbuhan mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq) diklasifikasikan sebagai berikut:
Kingdom
: Plantae (tumbuhan)
Divisi
: Magnoliophyta (tumbuhan berbunga)
Kelas
: Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)
Ordo
: Sapindales
Famili
: Meliaceae
Genus:
Swietenia
Spesies
: Swietenia mahagoni (L.) Jacq.
Nama lain mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq) sesuai daerah atau negaranya: Di Bangli disebut sebagai mahagni. Di Belanda dikenal sebagai mahok. Orang Perancis menyebutnya acajou atau acajou pays, sementara di Malaysia tanaman ini dinamai cheriamagany. Lain lagi dengan orang Spanyol yang mengenalnya sebagai caoba/caoba de Santo/domingo. Di Indonesia sendiri tumbuhan berkayu keras ini mempunyai nama lokal lainnya, yaitu mahagoni, maoni atau moni.(Hendromono, 2001).
2.1.3. Manfaat Tumbuhan Mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq.)
Di tengah masyarakat, buah mahoni dikenal dapat menurunkan tekanan darah tinggi, antijamur, demam, kurang nafsu makan, rematik, dan masuk angin. Bijinya dikenal dapat menurunkan kadar gula darah. Kulit batangnya dikenal dapat mengobati demam, sebagai tonikum, dan astringent.(Harianja, 2008). Sedangkan untuk bagian lain dari tanaman ini seperti daun dan kulit buahnya saja belum pernah ditemukan di masyarakat untuk dimanfaatkan khasiatnya.
2.2. Klasifikasi Senyawa Organik Bahan Alam
Ada empat cara klasifikasi senyawa organik bahan alam, yaitu:
2.2.1. Klasifikasi Berdasarkan Sifat Fisiologis
Setelah penelitian yang lebih mendalam dilakukan terhadap morfin, penisilin dan prostaglandin, maka perhatian para ahli sering ditujukan terhadap isolasi dan penentuan fungsi fisiologik dari senyawa-senyawa organik bahan alam tertentu.
Hampir separuh dari obat-obatan yang kita gunakan sehari-hari merupakan bahan- alam, misalnya alkaloida dan antibiotik. Oleh karena itu senyawa organik bahan alam dapat juga diklasifikasikan dari segi aktivitas fisiologik dari bahan alam yang bersangkutan. Misalnya : kelas hormon, vitamin, antibiotik dan mikotoksin (racun yang dihasilkan oleh jamur). Meskipun senyawa-senyawa dalam satu kelas mempunyai struktur dan asal-usul biogenetik yang sangat bervariasi, namun ada kalanya terdapat korelasi yang dekat antara aspek-aspek tersebut dengan kegiatannya.
2.2.2. Klasifikasi Berdasarkan Struktur Kimiawi
Klasifikasi ini didasarkan pada kerangka molekul dari senyawa yang bersangkutan. Menurut sistem ini, ada 4 kelas senyawa organik bahan alam, yaitu: a. Senyawa alifatik rantai terbuka atau lemak dan minyak Contoh : asam- asam lemak, gula dan asam- asam amino pada umumnya b. Senyawa alisiklik atau sikloalifatik Contoh : Terpenoida, steroida c. Senyawa aromatik atau benzenoida Contoh : Golongan fenolat, golongan kuinon d. Senyawa heterosiklik Contoh : alkaloida, flavonoida
2.2.3. Klasifikasi Berdasarkan Biogenesis
Semua konstituen tumbuhan dan binatang dibiosintesis dalam mikroorganisme melalui reaksi- reaksi yang dibantu oleh enzim tertentu. Dalam hal ini sumber utama
dari karbon biasanya adalah glukosa, yang dibiosintesis dalam tumbuhan hijau atau yang diperoleh dari lingkungan dalam organisme.
Beberapa ahli mulai menyusun teori langkah-langkah biogenetik dari senyawa organik bahan alam yang berlangsung dalam mikroorganisme hidup. Basis dari teori ini adalah keteraturan struktural yang teramati sejak awal sampai akhir reaksi. Teori yang paling menonjol adalah “aturan isoprena” yang diusulkan oleh Ruzicka. Dia menyatakan semua senyawa terpenoida terbentuk dari “unit isoprena” C5. Dari semua teori biogenesis ini dapat disimpulkan adanya 4 kelas senyawa organik bahan alam, yakni : a. Poliketida (asetogenin) b. Fenolat (fenilpropanoida) c. Isoprenoida d. Alkaloida
2.2.4. Klasifikasi Berdasarkan Taksonomi
Pengklasifikasian ini didasarkan pada penyelidikan morfologi komparatif dari tumbuh - tumbuhan yaitu taksonomi tumbuhan. Pada hewan dan sebagian mikroorganisme, metabolit terakhir biasanya dibuang keluar tubuh, sedang pada tumbuh-tumbuhan metabolit tersimpan di dalam tubuh tumbuhan itu sendiri.
Pada mulanya beberapa metabolit dianggap hanya berasal dari tumbuhan tertentu. Kemudian diketahui bahwa beberapa metabolit tersebar pada berbagai tumbuhan dan ternyata banyak konstituen tumbuhan - tumbuhan (seperti alkaloida dan terpenoida) yang dapat diisolasi dari spesies, genus, suku atau famili tumbuhan tertentu. Malah dalam satu spesies tunggal, dapat ditemukan sejumlah konstituen yang strukturnya berhubungan erat satu sama lain.( Nakanishi, 1974).
2.3. Senyawa Terpena
Nama "terpena" (terpene) diambil dari produk getah tusam, terpentin (turpentine ). Terpena merupakan suatu golongan hidrokarbon yang banyak dihasilkan oleh tumbuhan dan terutama terkandung pada getah dan vakuola selnya.
Senyawa terpena mempunyai kerangka karbon yang dibangun oleh penyambungan dua atau lebih unit C-5 yang disebut unit isoprena. Unit C-5 ini dinamakan demikian karena kerangka karbonnya sama seperti senyawa isoprena {CH2=C(CH3)-CH=CH2}. Kepala
Isoprena
Ekor
Unit Isoprena
(Harborne, 1987).
2.4. Senyawa Terpenoida
Istilah “terpenoida” di sini dipilih untuk semua senyawa yang terbentuk dari satuan isoprena tanpa memperhatikan gugus fungsi yang ada, sementara terpena mengacu khusus ke hidrokarbon. Dengan kata lain, senyawa terpenoida dapat digambarkan sebagai sebuah terpena yang telah mengalami modifikasi, di mana kelompok kelompok metil dipindahkan atau dihapus, atau ditambahkan atom oksigen. Sebaliknya, beberapa penulis menggunakan istilah "terpena" lebih luas untuk menyertakan / mengistilahkan terpenoida.(Robinson, 1995).
Kebanyakan senyawa terpenoida terdapat bebas dalam jaringan tanaman, tidak terikat dengan senyawa-senyawa lain, tetapi banyak diantara mereka yang terdapat sebagai glikosida, ester dari asam organik dan dalam beberapa hal terikat dengan protein. (Sastrohamidjojo, 1996).
Terpenoida terdiri atas beberapa macam senyawa, mulai dari komponen minyak atsiri, yaitu monoterpenoida dan seskuiterpenoida yang mudah menguap (C10 dan C15), diterpena yang lebih sukar menguap (C20), sampai senyawa yang tidak menguap, yaitu triterpenoida dan sterol (C30), serta pigmen karotenoida (C40). (Harborne, 1987).
2.4.1. Biosintesa Senyawa Terpenoida
Secara umum biosintesa terpenoida dengan terjadinya 3 reaksi dasar yaitu: 1. Pembentukan isoprena aktif berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat. Asam asetat setelah diaktifkan oleh koenzim A (Ko-A) melakukan kondensasi jenis Claisen menghasilkan Asetoasetil Ko-A. Senyawa ini dengan Asetil Ko-A melakukan kondensasi jenis Aldol menghasilkan rantai karbon bercabang sebagaimana ditemukan pada asam mevalonat. O CH3COOH Asam asetat
CoA-SH CH3C-SHCoA
O
O
O
CH3-C-SCoA + CH3-C-SCoA
O
O
O
CH3-C-CH2-C-SCoA + CH3-C-SCoA Asetil Ko-A Asetoasetil Ko-A
O
CH3-C-CH2-C-SCoA + CoA-SH Asetoasetil Ko-A
OH
O
CH3-C-CH2-C-SCoA CH2-C-SCoA O
OH
O
CH3-C-CH2-C-SCoA
OH H-OH
CH3-C-CH2-C-SCoA + CoA-SH
CH2-C-SCoA
CH2-C-OH
O
OH
O
O
OH
O [H]
CH3-C-CH2-C-SCoA
H2O
CH3-C-CH2-CH2-OH
CH2-C-OH O
CH2-C-OH O Asam mevalonat
2. Penggabungan kepala dan ekor dua unit isoprena akan membentuk mono-, seskui-, di-, sester-, dan poli- terpenoida. Setelah asam mevalonat terbentuk, reaksi-reaksi berikutnya adalah fosforilasi, eliminasi asam posfat, dan dekarboksilasi menghasilkan Isopentenil Pirofosfat (IPP). Selanjutnya berisomerisasi menjadi Dimetil Alil Pirofosfat (DMAPP) oleh enzim isomerase. IPP inilah yang bergabung dari kepala ke ekor dengan DMAPP. Penggabungan ini terjadi karena serangan elektron dari ikatan rangkap IPP terhadap atom karbon dari DMAPP yang kekurangan elektron diikuti oleh penyingkiran ion pirofosfat mengasilkan Geranil Pirofosfat (GPP) yaitu senyawa antara bagi semua senyawa monoterpenoida. Penggabungan selanjutnya antara satu unit IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama menghasilkan Farnesil Pirofosfat (FPP) yang merupakan senyawa antara bagi semua senyawa seskuiterpenoida. Senyawa diterpenoida diturunkan dari Geranil – Geranil Pirofosfat (GGPP) yang berasal dari kondensasi antara satu uni IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama.
OH
OP
CH3-C-CH2-CH2-OH
ATP 3 tahap
O
CH3-C-CH2-C-O- dekarboksilasi
CH2-C-OH
CH2=C-CH2-CH2-OPP
CH3
CH2-CH2-OPP
O Asam mevalonat
Isopentenil Pirofosfat (IPP)
CH3-C-CH2-CH2-OPP
CH2
CH3-C-CH2-CH2-OPP
enzim isomerase
CH3-C=CH-CH2-OPP Dimetil Alil Pirofosfat (DMAPP)
CH3
CH2
+ OPP
OPP
OPP Geranil Pirofosfat (GPP)
DMAPP
IPP
+ OPP
OPP GPP
IPP
+ OPP
OPP Farnesil Pirofosfat (FPP)
IPP
OPP Geranil - Geranil Pirofosfat (GGPP)
3. Penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau unit C-20 menghasilkan triterpenoida dan steroida.
Triterpenoida (C30) dan tetraterpenoida (C40) berasal dari dimerisasi C15 atau C20 dan bukan dari polimerisasi terus-menerus dari unit C-5. Yang banyak diketahui ialah dimerisasi FPP menjadi skualena yang merupakan triterpenoida dasar dan sumber dari triterpenoida lainnya dan steroida. Siklisasi dari skualena menghasilkan tetrasiklis triterpenoida lanosterol.( Pinder, 1960).
OPP Farnesil Pirofosfat (FPP)
skualena
2.4.2. Klasifikasi Senyawa Terpenoida
Senyawa terpenoida dapat diklasifikasikan ke dalam beberapa golongan utama terpenoida, yaitu : Jumlah satuan
Jumlah
isoprena
karbon
1
C5
Golongan hemiterpenoida
Jenis utama dan sumbernya Tersebar luar misalnya dalam
Valeriana
sp.
ataupun Geranium sp. 2
C10
monoterpenoida
minyak atsiri
3
C15
seskuiterpenoida minyak atsiri
4
C20
diterpenoida
asam diterpena damar tumbuhan Giberalin
5
C25
sesterterpenoida
resin
6
C30
triterpenoida
sterol,triterpena,saponin,
glikosida jantung 8
C40
tetraterpenoida
zat warna karoten
n
Cn
politerpenoida
Karet alam
2.4.2.1. Hemiterpenoida
Hemiterpenoida adalah anggota yang paling sederhana dari senyawa terpenoida. Senyawa ini merupakan hasil akhir metabolik yang dapat diisolasi karena jarang ada yang stabil di alam,. Namun demikian, mereka yang terdapat dalam sel hidup merupakan senyawa yang sangat reaktif. Keberadaan asam tiglat dan angelat di alam adalah salah satu contoh sumber senyawa dari golongan hemiterpenoida.
COOH
H
CH3 C=C
C=C CH3
COOH
CH3
Asam tiglat tersebar luas,misalnya Geranium sp
H
CH3
Asam angelat tersebar luas, mialnya Archangelica officinalis
2.4.2.2. Monoterpenoida
Monoterpenoida terbentuk dari dua satuan isoprena atau mempunyai sepuluh atom karbon (C10). Monoterpenoida merupakan cairan tanwarna, tidak larut dalam air, dapat disuling uap, berbau harum, dan titik didih antara 140 – 1800C. Beberapa senyawa bersifat optis aktif.
Senyawa golongan ini telah diketahui sejak bertahun – tahun sebagai komponen minyak esensial dari tumbuhan tingkat tinggi. Kebanyakan peneliti berpendapat bahwa fungsi terpenoida tingat rendah lebih bersifat ekologi ketimbang fisiologi dalam tumbuhan. Banyak senyawa ini yang menghambat pertumbuhan tumbuhan pesaingnya dan dapat juga bekerja sebagai insektisida atau berdaya racun terhadap hewan tingkat tinggi.
Rangka monoterpenoida meliputi asiklik, monosiklik, dan bisiklik seperti contoh di bawah ini: CH3
CH3 C CH H2C
CH2
H2C
CH C
CH2 mirsena (asiklik)
fenkana (bisiklik)
p-mentana (monosiklik)
2.4.2.3. Seskuiterpenoida
Seskuiterpenoida adalah senyawa C15, biasanya dianggap berasal dari tiga satuan isoprena. Seperti monoterpenoida, seskuiterpenoida terdapat sebagai komponen minyak esensial yang tersuling uap. Senyawa golongan ini memiliki titik didih >2000C dan berperan penting dalam memberi aroma pada buah.
Secara kimia, seskuiterpenoida juga dipilah – pilah berdasarkan kerangka karbon dasarnya seperti monoterpenoida. Umumnya terdiri atas seskuiterpenoida asiklik (misalnya
farnesol),
seskuiterpenoida
monosiklik
(misalnya
elemol),
dan
seskuiterpenoida bisiklik (misalnya β – selinena). Tetapi, dalam setiap golongan dikenal banyak senyawa yang berbeda.
Setelah penelitian lebih lanjut, seskuiterpenoida dapat juga diklasifikasikan terhadap
ada
tidaknya
gugus
lakton
dalam
struktur
senyawa
golongan
seskuiterpenoida tersebut. Seskuiterpenoida lakton ini mendapat perhatian khusus untuk diteliti lebih lanjut karena kemampuannya sebagai alergen. Rasanya kadang – kadang pahit atau pedas. Contoh dari seskuiterpenoida lakton ini yaitu santonin.
Santonin
O O O
2.4.2.4. Diterpenoida
Diterpenoida merupakan senyawa C20 atau yang berasal dari empat satuan isoprena. Umumnya bertitik didih tinggi, itu sebabnya diterpenoida tidak ditemukan dalam minyak atsiri tumbuhan meskipun hal tersebut bisa jadi mungkin untuk yang bertitik didih rendah. Senyawa golongan ini ditemukan dalam damar, eksudat berupa gom, dan dalam resin sisa penyulingan minyak atsiri.
Senyawa golongan diterpenoida yang tersebar luas di alam ialah senyawa induk asiklik dari deret senyawa tersebut yaitu fitol, yang terdapat sebagai bentuk ester dalam molekul klorofil.
CH2OH
fitol
Diterpenoida dapat berbentuk asiklik, bisiklik, trisiklik, dan tetrasiklik. Sedangkan kelasnya dapat dibagi atas tiga, yaitu: a. diterpenoida damar berguna sebagai pelindung ketika dikeluarkan sebagai eksudat dari kayu pepohonan atau sebagai getah tumbuhan herba. Contoh: asam abietat.
b. diterpenoida racun diterpenoida racun ialah gravanatoksin, umumnya terdapat dalam daun jenis Rhododendron. Daun tersebut beracun oleh adanya senyawa gravanatoksin – 1.
c. giberelin merupakan golongan hormon yang dapat merangsang pertumbuhan. Asam giberelat adalah yang paling dikenal dari golongan ini.(Sastrohamidjojo, 1996).
2.4.2.5. Sesterterpenoida
Sesterterpenoida merupakan senyawa terpenoida yang terdiri atas lima unit molekul isoprena (C25). Sesterterpenoida sangat jarang terdapat dalam tumbuhan tingkat tinggi, meskipun memang ada (80). Ada kerumitan yang sangat meningkat dari senyawa diterpenoida sampai triterpenoida. Kedua hal inilah yang membuat golongan senyawa sesterterpenoida jarang dibicarakan. Contoh dari senyawa golongan ini adalah ofiobolin. O
OH ofiobolin
(Robinson, 1995).
2.4.2.6. Triterpenoida
Triterpenoida merupakan salah satu golongan senyawa terpenoida yang rantainya dibentuk oleh enam unit molekul isoprena atau mempunyai atom karbon sebanyak C30 pada kerangka dasarnya. Berupa senyawa tidak berwarna, seringkali bertitik leleh tinggi dan optis aktif, yang umumnya sukar dicirikan karena tidak ada kereaktifan kimianya.(Harborne, 1987).
Senyawa triterpenoida di alam terdapat pada tumbuhan dan hewan. Umumnya tersebar luas dalam damar, gabus, dan kutin pada tumbuhan. Mereka terutama terdapat dalam famili Rutaceae, Meliaceae, dan Simaroubaceae. Sedangkan pada hewan, misalnya terdapat pada minyak hati ikan hiu (hidrokarbon skualena diisolasi untuk pertama kalinya). Karena senyawa ini dianggap sebagai senyawa-antara dalam biosintesis steroida, senyawa ini harus dibuat sekurang-kurangnya dalam jumlah kecil oleh semua makhluk yang mensintesis steroida.(Manitto, 1992).
Berdasarkan bentuk dan keadaan senyawa triterpenoida, maka senyawa ini dapat diklasifikasikan sebagai berikut : a. Senyawa steroida/ sterol Merupakan salah satu golongan senyawa triterpenoida yang berstruktur dasar cincin siklopentana perhidrofenantrena. Contoh : Stigmasterol. C2H5 H 3C
CH3
H 3C CH3
HO
CH3
Stigmasterol
b. Senyawa triterpena Di dalam senyawa triterpenoida ini terdapat dalam bentuk asiklik dan siklik, yang dapat diklasifikasikan sebagai berikut: b.1. Triterpena asiklik, tidak mempunyai cincin tertutup pada strukturnya. Contoh: Skualena, senyawa ini berupa kristal yang tidak berwarna, mempunyai titik leleh tinggi, dan bersifat optis aktif. b.2. Triterpena trisiklik, mempunyai tiga cincin tertutup pada struktur molekulnya. Contoh: Ambrein. b.3. Triterpena tetrasiklik, mempunyai empat cincin tertutup pada struktur molekulnya. Contoh: Lanosterol, senyawa ini merupakan golongan tetrasiklis yang memiliki rangka perhidroksiklopentanofenantren dan dapat dianggap sebagai intermediate dan berhubungan erat dengan struktur sterol.
b.4.Triterpena pentasiklik, mempunyai lima cincin tertutup pada struktur molekulnya. Senyawa ini terdapat pada tumbuh – tumbuhan yang terikat dengan senyawa – senyawa gula yang disebut dengan triterpen glikosida.
c. Saponin Merupakan glikosida dari gabungan triterpena dan sterol. Bila senyawa ini dihidrolisis akan menghasilkan suatu senyawa aglikon ( saponin steroida ) dan glikosida ( gula ). Saponin larut dalam air dan biasanya berasa pahit. Contohnya : Stigmasteril-β-Dglukopiranosida.(Rahman, 1990).
d. Glikosida jantung/ kardenolida Merupakan salah satu golongan triterpenoida yang kerangka dasarnya sama dengan triterpenoida dan steroida, tetapi pada atom C17 berikatan langsung dengan senyawa glikosida atau senyawa turunan furan. Kebanyakan glikosida jantung adalah racun. Contoh : Oleandrin.(Sastrohamidjojo, 1996).
2.4.2.7. Tetraterpenoida
Tetraterpenoida terdiri atas delapan unit isoprena atau kerangka dasarnya terdiri atas 40 atom karbon (C40). Tetraterpenoida yang paling dikenal adalah karotenoida. Karotenoida tersebar luas pada tumbuhan (misalnya pada famili Compositae) dan merupakan golongan pigmen yang larut dalam lemak. Pada hewan, suatu karotenoida khusus, yaitu β – karotena, merupakan makanan yang diperlukan karena ia merupakan sumber vitamin A, yaitu suatu isoprenoida alkohol C20. Vitamin A diperoleh setelah β – karotena tadi mengalami hidrasi dan molekulnya terpecah dua.
Karotenoida yang terkenal ialah hidrokarbon tak jenuh turunan likopena atau turunan likopena teroksigenasi, yang dikenal sebagai xantofil.
2.4.2.8. Politerpenoida
Politerpenoida terdiri atas lebih dari delapan unit isoprena atau kerangka dasarnya terdiri atas lebih dari 40 atom karbon. Contohnya karet alam.
karet alam
2.5. Teknik Pemisahan
2.5.1. Ekstraksi
Ekstraksi dapat dilakukan dengan metoda maserasi, partisi, perkolasi, dan sokletasi. Sebelum ekstraksi dilakukan, biasanya serbuk tumbuhan dikeringkan lalu dihaluskan dengan derajat kehalusan tertentu, kemudian diekstraksi dengan salah satu cara di atas. Ekstraksi dengan metoda sokletasi dapat dilakukan secara bertingkat dengan berbagai pelarut berdasarkan kepolarannya, misalnya : n–heksana, eter, kloroform, etil asetat, etanol, metanol, dan air. Untuk mendapatkan larutan ekstrak yang pekat biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotavapor.(Harborne, 1987).
Beberapa penelitian mengenai isolasi senyawa terpenoida sudah pernah dilakukan menggunakan metoda partisi, antara lain: 1. Isolasi senyawa triterpenoida dari lapisan dalam batang tumbuhan Diospyros maritima dimaserasi dengan etanol, (EtOH) ditambahkan H2O lalu dipartisi dengan n-heksana. Lapisan yang diteruskan pengerjaannya adalah yang dari fraksi etanolnya.(Kuo, 1997). 2. Isolasi senyawa diterpenoida (diterpenoida baru) dari buah Vitex rotundifolia dimaserasi dengan metanol (Me-OH) lalu dipartisi dengan n-heksana. Lapisan yang kemudian di kromatografi kolom adalah yang dari lapisan metanolnya. (Yamamoto, 2002). 3. Isolasi senyawa limonoida baru dari kulit batang tumbuhan Swietenia mahagoni dipartisi dengan n-heksana untuk menghilangkan asam-asam
lemaknya terlebih dahulu, kemudian diekstraksi dengan etanol, lalu dipekatkan. Dilarutkan kembali dengan MeOH-H2O lalu dipartisi lagi dengan dietil eter. Lapisan dietil eter adalah yang diteruskan untuk dikromatografi kolom.(Iwagawa, 2003).
2.5.2. Kromatografi
Penjelasan terperinci tentang kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, seorang ahli botani Rusia yang bekerja di Warsawa. Pada tahun 1906, dia mengumumkan cara pemisahan klorofil dan pigmen lainnya dalam suatu seri tanaman. Larutan eter petroleum yang mengandung cuplikan diletakkan pada ujung atas tabung gelas sempit yang telah diisi dengan serbuk kalsium karbonat. Ketika ke dalam kolom itu dituangi eter petroleum maka akan terlihat bahwa pigmen-pigmen itu terpisah dalam beberapa daerah. Setiap daerah bewarna itu diisolasi dan diidentifikasi senyawa penyusunnya. Adanya pita bewarna itu maka dia mengusulkan nama “kromatografi” yang berasal dari bahasa Yunani “kromatos” yang berarti warna dan “graphos” yang berarti menulis.
Sekarang kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tetap tinggal pada sistem dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah - celah fasa diam. Gerakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusunan cuplikan.
Ada
beberapa
cara
dalam
mengelompokkan
teknik
kromatografi.
Kebanyakan berdasarkan pada macam fasa yang digunakan (fasa gerak - fasa diam), misalnya kromatografi gas dan kromatografi cairan. Cara pengelompokan lainnya berdasarkan mekanisme yang membuat distribusi fasa. Disini metoda kromatografi sebagian dikelompokkan berdasarkan macam fasa yang digunakan dan sebagian lain berdasarkan pada mekanisme pada distribusi fasa.
Kromatografi cair-padat atau kromatografi serapan, ditemukan oleh Tswett dan dikenalkan kembali oleh Khun dan Lederer pada 1931, telah digunakan sangat luas untuk analisis organik dan biokimia. Pada umumnya sebagai isi kolom adalah silika gel atau alumina yang mempunyai angka banding luas permukaan terhadap volume sangat besar. Sayangnya hanya ada beberapa bahan penyerap, maka pemilihannya sangat terbatas. Keterbatasan yang lebih nyata pada kenyataan bahwa koefisien distribusi untuk serapan kerap kali tergantung pada kadar total. Hal ini akan menyebabkan pemisahan tidak sempurna.
Kromatografi cairan-cairan atau kromatografi partisi, dikenalkan oleh Martin dan Synge pada 1941, dan kemudian mendapatkan hadiah Nobel untuk itu. Fasa diam terdiri atas lapisan tipis cairan yang melapisi permukaan dari padatan inert yang berpori-pori. Ada banyak macam kombinasi cairan yang dapat digunakan sehingga metode ini sangat berguna. Lebih lanjut, koefisien distribusi sistem ini lebih tidak tergantung pada kadar, memberikan pemisahan yang lebih tajam.
Kromatografi gas-padat, digunakan sebelum tahun 1800 untuk memurnikan gas. Pada waktu dulu teknik ini tidak berkembang karena keterbatasannya yang sama seperti halnya kromatografi cairan-padat, tetapi penelitian lebih lanjut dengan macam fasa padat baru memperluas penggunaan teknik ini.
Kromatografi gas-cairan merupakan metoda pemisahan yang sangat efisien dan serba guna. Teknik ini telah menyebabkan revolusi dalam Kimia Organik sejak dikenalkan pertama kali oleh James dan Martin pada tahun 1052. Hambatan yang paling utama adalah bahan cuplikan harus mempunyai tekanan uap paling tidak beberapa torr pada suhu kolom. Sistem ini sangat baik sehingga dapat dikatakan sebagai metoda pilihan dalam kromatografi karena dapat memisahkan dengan cepat dan peka.(Sudjadi, 1986).
2.5.2.1. Kromatografi Lapisan Tipis
Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif dan preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi.
Pada hakikatnya Kromatografi Lapisan Tipis melibatkan dua peubah: sifat fasa diam atau sifat lapisan dan sifat fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fasa diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair - padat) atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair - cair). Fasa diam pada KLT sering disebut penyerap, walaupun sering berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair di dalam sistem kromatografi cair- cair. Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT, yaitu: silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kieselgur (tanah diatomik), dan selulosa. Fasa gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut.
Kromatogram pada kromatografi lapis tipis merupakan noda – noda yang terpisah setelah divisualisasi dengan cara fisika atau kimia. Visualisasi cara fisika yaitu dengan melihat noda kromatogram yang mengadsorbsi radiasi ultraviolet atau berfluorosensi dengan radiasi ultraviolet pada λ = 254 nm atau λ = 356 nm. Visualisasi dengan cara kimia adalah dengan mereaksikan kromatogram dengan pereaksi warna yang memberikan warna atau fluorosensi sensitif. Visualisasi cara kimia ini dilakukan dengan cara penyemprotan dengan atomizer atau memberikan zat uap kimia pada kromatogram atau dengan pencelupan kedalam pereaksi penampak warna. Pada kromatografi lapis tipis, dikenal istilah atau pengertian Rf untuk tiap – tiap noda kromatogram yang didefenisikan sebagai berikut :
Rf
= Jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal Jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal
Faktor – faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf yaitu: 1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan 2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya 3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap 4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa gerak 5. Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang dilakukan 6. Teknik percobaan 7. Jumlah cuplikan yang digunakan 8. Suhu 9. Keseimbangan (Sastrohamidjojo, 1985).
2.5.2.2. Kromatografi Kolom
Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Ukuran keseluruhan kolom sungguh beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurangkurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin saja sampai 100 kali.
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fasa gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong oleh tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom.(Gritter, 1991).
2.5.3. Preparatif
2.5.3.1. Preparatif Kromatografi Lapis Tipis
Pelat lapis tipis preparatif memungkinkan pengerjaan memisahkan sampel yang sangat beragam dalam ukuran dari gram hingga ke miligram. Tersedia dengan atau tanpa indikator fluoresensi, pelat kromatografi lapis tipis (KLT) unutk preparatif tersedia dari ukuran paling tipis 0.5 cm dan paling tebal 2 cm. Pelat ini juga menggunakan teknologi pengikat silika Merck yang telah terbukti seperti pada pelat KLT analitis. Pada preparatif KLT, sampel umumnya diaplikasikan sebagai suatu pita di sepanjang seluruh lebar pelat. Deteksi UV digunakan hampir secara eksklusif untuk membuat substansi nampak. Untuk mengisolasi substansi dengan ekstraksi, cukup dengan mengelupas titik tersebut dari lapisan.
2.6. Teknik Spektroskopi
Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia-fisika yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik.
Ada dua macam instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer. Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut sebagai spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer.( Muldja, 1955 ).
Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe-tipe dari adanya gugus fungsi dalam satu molekul. Resonansi Magnet Inti yang memberikan informasi tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen. Ini juga memberikan informasi yang menyatakan tentang alam serta lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen. ( Pavia, 1979 ).
2.6.1. Spektrofotometri Inframerah ( Fourier Transform - Infra Red/ FT - IR)
Spektrum inframerah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran yang berlainan. Pancaran inframerah yang kerapannya kurang dari 100 cm -1 (panjang gelombang lebih daripada 100 µm) diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah menjadi putaran energi molekul.
Penyerapan ini tercantum, namun spektrum getaran terlihat bukan sebagai garis – garis melainkan berupa pita – pita. Hal ini disebabkan perubahan energi getaran tunggal selalu disertai sejumlah perubahan energi putaran.(Silverstein, 1984).
Vibrasi molekul dapat dibagi dalam dua golongan yaitu vibrasi regang (stretching) dan vibrasi lentur (bending vibrations). 1. Vibrasi Regang Terjadi perubahan jarak antara dua atom dalam suatu molekul secara terusmenerus. Vibrasi regang ada dua macam, yakni vibrasi regang simetris dan tak simetris. 2. Vibrasi Lentur Terjadi perubahan sudut antara dua ikatan kimia. Ada dua macam vibrasi lentur yaitu vibrasi lentur dalam bidang (scissoring dan rocking) dan vibrasi luar bidang (wagging dan twisting).(Noerdin, 1985).
Hanya getaran yang menghasilkan perubahan momen dwikutub secara berirama saja yang teramati di dalam inframerah. Medan listrik yang berganti-ganti, yang dihasilkan oleh perubahan penyebaran muatan yang menyertai getaran menjodohkan getaran molekul dengan medan listrik pancaran elektromagnet yang berayun.(Silverstein, 1984).
2.6.2. Spektrometri
Resonansi
Magnetik
Inti
Proton
(Nucleic
Magnetic
1
Resonance Proton/ H-NMR )
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul. Struktur NMR memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hidrogen.(Cresswell, 1982)
Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua proton-proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa kadang-kadang menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa memberikan penaikan menjadi puncak absorpsi tunggal dalam spektrum NMR. (Bernasconi, 1995).
Beberapa keuntungan dari pemakaian standar internal TMS yaitu : 1. TMS mempunyai 12 proton yang setara sehingga akan memberikan spektrum puncak tunggal yang kuat. 2. TMS merupakan cairan yang mudah menguap, dapat ditambahkan ke dalam larutan sampel dalam pelarut CDCl3 atau CCl4. Boleh dikatakan semua senyawa organik memberikan resonansi bawah medan terhadap TMS. Hal ini disebabkan Si lebih bersifat elektro positif dibandingkan atom C. TMS sendiri dari segi kimia bersifat lembam, tidak bercampur dengan H2O ataupun air berat.(Muldja, 1955).
