19 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian
Preparasi Sampel
Pembuatan Gaplek
Penentuan Kadar Protein Tepung Gaplek Terfortifikasi dengan Metode Biuret
Pembuatan Tepung Gaplek Terfortifikasi
Identifikasi Asam Amino Tepung Gaplek Terfortifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Identifikasi Asam Amino Tepung Gaplek Terfortifikasi dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
20 Lampiran 2. Pembuatan Kurva Standar untuk Pengukuran Kadar Protein Metode Biuret BSA (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Akuades (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Konsentrasi (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A 550 nm
Kurva Standar Biuret 0.500 0.450 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000
y = 0.048x + 0.005 R² = 0.997
0
2
4
6
Konsentrasi (mg/ml)
8
10
A550nm 0 0,059 0,109 0,139 0,199 0,259 0,279 0,339 0,399 0,449 0,459
21 Lampiran 3. Kadar Protein Terlarut Tepung Gaplek Terfortifikasi (TGT) dan Tepung Gaplek Kontrol (TGK) pada lama waktu fermentasi 0,20, dan 40 jam Ulangan
Sampel G0
G20
G40 1 GF0
GF20
GF40
A 550 nm 0,028 0,029 0,040 0,033 0,038 0,030 0,037 0,038 0,039 0,224 0,237 0,237 0,261 0,270 0,271 0,289 0,297 0,297
Rata-Rata A 550 nm
Konsentrasi (mg/ml)
Kadar Protein (%)
0,0323
0,5409
2,17
0,0337
0,5696
2,28
0,0380
0,6578
2,63
0,2660
5,329
21,32
0,2673
5,3565
21,43
0,2943
5,9098
22,64
22 Lampiran 3. Lanjutan Ulangan
Sampel G0
G20
G40 2 GF0
GF20
GF40
Ulangan
Sampel G0
G20
G40 3 GF0
GF20
GF40
A 550 nm 0,026 0,037 0,031 0,035 0,040 0,026 0,033 0,041 0,031 0,196 0,256 0,253 0,260 0,255 0,267 0,283 0,284 0,283 A 550 nm 0,027 0,039 0,028 0,047 0,032 0,045 0,045 0,042 0,043 0,235 0,237 0,235 0,262 0,266 0,244 0,282 0,284 0,277
Rata-Rata A 550 nm
Konsentrasi (mg/ml)
Kadar Protein (%)
0,0313
0,5212
2,08
0,0337
0,5690
2,28
0,0350
0,5693
2,39
0,2350
4,6947
18,78
0,2607
6,4706
25,88
0,2837
6,8873
27,55
Rata-Rata A 550 nm
Konsentrasi (mg/ml)
Kadar Protein (%)
0,0313
0,5212
2,08
0,0413
0,7261
2,90
0,0433
0,7671
3,07
0,2357
4,709
18,84
0,2573
5,1523
20,61
0,2810
5,6373
22,55
23 Lampiran 3. Lanjutan Ulangan
Sampel G0
G20
G40 4 GF0
GF20
GF40
A 550 nm 0,030 0,035 0,034 0,035 0,038 0,038 0,035 0,040 0,042 0,223 0,229 0,246 0,245 0,262 0,276 0,273 0,279 0,288
Rata-Rata A 550 nm
Konsentrasi (mg/ml)
Kadar Protein (%)
0,033
0,5553
2,22
0,037
0,6373
2,55
0,039
0,6783
2,71
0,2321
4,6469
18,59
0,2610
5,2275
20,91
0,280
5,618
22,47
Contoh Perhitungan Kadar Protein : Sampel G0 (ulangan 1) Absorbansi = 0,2660 y = 0,0488x + 0,0059 0,2660 = 0,0488 + 0,0059 , , x= = 5,329 , Kadar Protein (%) =
, /
x 20 x 100% = 21,32 %
24 Lampiran 4. Analisis Sidik Ragam Kadar Protein Terlarut Tepung Gaplek Kontrol (TGK) dan Tepung Gaplek Terfortifikasi (TGT)
% Protein Terlarut Ulangan G0
G20
G40
GF0
GF20
GF40
Tu
Xu
du
Wu
I
2,16
2,28
2,63
18,59
21,43
23,64
70,73
11,79
0,18
533,0082
II
2,08
2,28
2,39
18,78
20,88
22,77
69,18
11,53
-0,08
522,3214
III
2,08
2,09
3,07
18,84
20,61
22,55
69,24
11,54
-0,07
513,4574
IV
2,22
2,55
2,71
18,59
20,91
22,47
69,45
11,58
-0,03
511,1891
Tp
8,54
9,20
10,8
74,8
83,83
91,43
278,60
Xp
2,14
2,3
2,7
18,7
20,96
22,86
dp
-9,47
-9,31
-8,91
7,09
9,35
11,25
SD
0,0721
0,1892
0,2816
0,1294
0,3426
0,5308
SE
0,1374
0,3606
0,53667
0,2465
0,6531
1,023
Keterangan : G0 = Tepung Gaplek Kontrol 0 jam, G20 = Tepung Gaplek Kontrol 20 jam, G40 = Tepung Gaplek Kontrol 40 jam, GF0= Tepung Gaplek Terfortifikasi Tepung Kedelai 0 jam, GF20= Tepung Gaplek Terfortifikasi Tepung Kedelai 20 jam, GF40= Tepung Gaplek Terfortifikasi Tepung Kedelai 40 jam. Tu = Total Ulangan, Tp = Total Perlakuan, Xu = Purata Ulangan, Xp = Purata Perlakuan, X00 = purata SD = Simpangan Baku, SE = Standar Eror
25 Lanjutan Lampiran 4. W1 = (x)(dpG0) + (x)(dpG20) + …..(x)(dpGF40) = (2,16)(-9,47) + (2,28)(-9,31) + …..(18,59)(7,09) = 533,0082 W2 = (x)(dpG0) + (x)(dpG20) + …..(x)(dpGF40) = (2,08)(-9,47) + (2,28)(-9,31) + …..(18,78)(7,09) = 522,3214 W3 = (x)(dpG0) + (x)(dpG20) + …..(x)(dpGF40) = (2,08)(-9,47) + (2,09)(-9,31) + …..(18,84)(7,09) = 513,4574 W4 = (x)(dpG0) + (x)(dpG20) + …..(x)(dpGF40) = (2,22)(-9,47) + (2,55)(-9,31) + …..(18,59)(7,09) = 511,1891 N = (W1)(du1) + (W2)(du2) + …..(W4)(du4) = (533,0082)(0,18) + (522,3214)(-0,08) +….. (511,1891)(-0,03) = 2,87 ∑ du2 = (0,18)2 + (-0,08)2 + …..(-0,03)2 = 0,0446 ∑ dG20 = (-9,47)2 + (-9,31)2 + …..(7,09)2 = 519,9982 FK = ∑
( ..)^
, ^
=
= 3234,08
JK total = ((2,16)2 + (2,28)2 + (2,63)2 + …..(22,47)2 – FK )= 2081,59 JK ulangan = ∑
∑(
)^
- FK
,
= JK Perlakuan =
∑(
– 3234,08 = 0,27 )^
=
- FK ,
– 3234,08 = 2079,96
JK Galad Acak = JK Total – JK Ulangan – JK Perlakuan = 2081,59 – 0,27 – 2079,96 = 1,36 JK Non Additivitas =
^
= 0,35
26 Lanjutan Lampiran 4. D = (∑du2)(∑dG20) = (0,0446)(519,9982) = 23,19 KV = SX =
√
.
x 100% = √ .
=
,
x 100% = 2,67%
,
,
= 0,151
Tabel Q = 4.59 BNJ 5% = SX x Tabel Q = 0,693 Dasira Uji Additivitas Sumber Ragam Ulangan Perlakuan Galad Acak Non Additivitas Sisa
Db JK KT F hitung 3 0,27 5 2079,96 15 1,36 0,0906 1 0,35 0,35 4,85 14 1,01 0,072
F Tabel 5% 1%
4,60
8,86
F Tabel 5% < F Hit < F Tabel 1% Data aditif
Daftar Sidik Ragam Sumber Ragam Ulangan Perlakuan Galad Acak Total
Db Jk 3 0,27 5 2079,96 15 1,36 23
KT 0,09 415,99 0,0906
F Hitung 0,989 4571,32**
Fhit perlakuan > F tabel 5% dan 1% Kesimpulan : Antar perlakuan terdapat beda amat sangat nyata
F Tabel 5% 1% 3,29 5,42 2,90 4,56
27 Lanjutan Lampiran 4. Uji BNJ 5% Kadar Protein tiap Perlakuan G0
G20
G40
GF0
GF20
GF40
Purata (%)
2,14
2,30
2,70
18,70
20,96
22,86
±
±
±
±
±
±
±
SE
0,1374
0,3606
0,5367
0,2465
20,96
22,86
W = 0,3551
(a)
(a)
(a)
(b)
(c)
(d)
Keterangan : G0 = Tepung Gaplek Kontrol 0 jam, G20 = Tepung Gaplek Kontrol 20 jam, G40 = Tepung Gaplek Kontrol 40 jam, GF0= Tepung Gaplek Terfortifikasi Tepung Kedelai 0 jam, GF20= Tepung Gaplek Terfortifikasi Tepung Kedelai 20 jam, GF40= Tepung Gaplek Terfortifikasi Tepung Kedelai 40 jam.
28 Lampiran 5. Kadar Protein Terlarut Kedelai, Gaplek, Ragi, dan Tepung Terigu “X” Sampel
Ulangan
1
2 Kedelai 3
4
Sampel
Ulangan
1
2 Gaplek 3
4
A 550 nm 0,459 0,440 0,402 0,457 0,437 0,408 0,438 0,423 0,440 0,450 0,399 0,454
A 550 nm 0,028 0,031 0,027 0,033 0,020 0,018 0,023 0,024 0,026 0,021 0,014 0,014
Rata-Rata A 550 nm
Konsentrasi (mg/ml)
Kadar Protein (%)
0,4337
8,7657
35,06
0,4340
8,7725
35,09
0,4337
8,7657
35,06
0,4343
8,7794
35,12
Rata-Rata A 550 nm
Konsentrasi (mg/ml)
Kadar Protein (%)
0,0287
0,4665
1,87
0,0237
0,3641
1,46
0,0243
0,4028
1,61
0,0163
0,2361
0,94
29 Lampiran 5. Lanjutan Sampel
Ulangan
A 550 nm 0,050 0,047 0,051 0,050 0,052 0,050 0,051 0,050 0,051 0,052 0,053 0,054 0,272 0,240 0,247
1
2 Ragi 3
4
Tepung Terigu X
Rata-Rata A 550 nm
Konsentrasi (mg/ml)
Kadar Protein (%)
0,0493
0,9236
3,69
0,0507
0,9514
3,80
0,0507
0,9514
3,80
0,053
0,9652
3,86
0,253
5,0635
20,25
Contoh Perhitungan Kadar Protein : Kedelai (ulangan 1) Absorbansi = 0,4337 y = 0,0488x + 0,0059 0,4337 = 0,0488 + 0,0059 , , x= = 8,766 , Kadar Protein (%) =
,
/
x 20 x 100% = 35,06%
30 Lampiran 5. Lanjutan Pengulangan
Kadar Protein Sampel Kedelai 35,06 35,09 35,06 35,12 35,0825 0,0287 0,0547
1 2 3 4 X SD SE
Ragi 3,8056 3,8056 3,8608 3,6944 2,7781 0,0715 0,1364
Gaplek 1,87 1,46 1,61 0,94 1,47 0,3918 0,7468
Keterangan : X = Purata, SD = Simpangan Baku, SE = Standar Eror
Ʃ(x-X)2 Kedelai = (35,06-35,0825)2 + ( 35,09-35,0825)2 + ... + (35,12-35,0825)2 = 2,475 x 10-3 SDKedelai = √
)
Ʃ(
,
=
= 0,0287
∝
,
SEKedelai = t x √ = 3,812 x
√
= 0,0547
Ʃ(x-X)2 Ragi = (3,8056-3,7781)2 + (3,8056-3,7781)2 + ... + (3,6944-3,7781)2 = 0,01535 SDRagi = √
)
Ʃ(
,
=
= 0,0715
∝
SERagi = t x √ = 3,812 x
,
= 0,1364
√
Ʃ(x-X)2 Gaplek = (1,87-1,47)2 + (1,46-1,47)2 + ... + (0,94-1,47)2 = 0,4606 SDGaplek = √
Ʃ(
∝
)
=
,
SEGaplek = t x √ = 3,812 x
= 0,3918 , √
= 0,7468
31 Lampiran 6. Kromatogram Asam Amino Standar 31,25 ppm, 50 ppm, 62,5 ppm, 125 ppm, 500 ppm, Gaplek , G40 , GF0 , GF20 dan GF40.
Kromatogram Standar Asam Amino 31,25 ppm Keterangan : Standar dianalisa pada fase diam kolom Licrospher ® 100 RP 18 (125 x 4 mm,5 µm ) dan fase gerak adalah Eluent A : metanol : 50 mM natrium asetat : Teterahidrofuran (THF) dan Eluent B :65 % metanol. Suhu analisa adalah 27 0C dengan kecepatan alir 1 ml/menit serta dideteksi dengan detektor fluorosen pada panjang gelombang 360 dan 460 nm.
Kromatogram Asam Amino 50 ppm Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
32 Lampiran 6. Lanjutan
Kromatogram Asam Amino 62,50 ppm Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
Kromatogram Asam Amino 125 ppm Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
33 Lampiran 6. Lanjutan
Kromatogram Asam Amino 500 ppm Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
Kromatogram Sampel Gaplek Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
34 Lampiran 6. Lanjutan
Kromatogram Sampel G40 Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
Kromatogram Sampel GF0 Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
35 Lampiran 6. Lanjutan
Kromatogram Sampel GF20 Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
Kromatogram Sampel GF40 Keterangan : Kondisi analisa sampel gaplek sama dengan kondisi yang digunakan pada kromatogram asam amino 31,25 ppm
36 Lampiran 7. Perbandingan Waktu Retensi Sampel Gaplek, G40, GF0, GF20, dan GF40 terhadap Asam Amino Standar TR ASAM Amino Standar No
Gaplek
1
A.A Standar Asp
31,25 ppm 2,990
50,00 ppm 4,600
62,50 ppm 2,947
125,00 ppm 3,104
500,00 ppm 4,411
TR 1,155
2
Glu
5,462
8,545
5,399
5,399
8,208
3,011
3
Ser
13,741
14,968
13,851
13,059
14,551
4
His
16,208
16,239
16,243
15,117
5
Glis
18,633
19,653
18,670
6
Arg
21,341
21,378
7
Ala
23,571
8
Tyr
9
G40
A.A
GF0
TR
A.A
2,974
Asp
3,060
Asp
5,369
Glu
5,412
Glu
6,200
16,036
6,308
-
17,630
19,199
13,823
21,274
20,128
21,089
24,675
23,658
22,750
26,450
27,611
26,589
Met
33,997
35,483
10
Val
34,544
11
Phe
12
GF20
GF40
TR
A.A
TR
A.A
Asp
2,986
Asp
3,088
Asp
5,495
Glu
5,417
Glu
4,300
-
-
13,898
Ser
13,819
Ser
5,449
Glu
13,780
Ser
16,308
His
16,151
His
13,799
Ser
Ser
17,127
-
18,678
Glis
17,032
-
16,054
His
18,628
Glis
18,570
Glis
19,333
-
18,644
Glis
17,066
-
24,244
19,162
-
19,200
-
21,362
Arg
19,250
-
18,562
Glis
25,625
26,957
21,317
Arg
21,176
Arg
23,729
Ala
21,367
Arg
21,067
Arg
34,048
33,600
35,249
23,639
Ala
23,730
Ala
26,744
Tyr
23,653
Ala
23,295
Ala
36,118
34,562
34,074
35,850
25,117
Tyr
26,577
Tyr
34,975
Val
26,538
Tyr
25,200
-
36,408
37,896
36,487
36,078
37,688
33,272
-
33,400
-
36,689
Fenil
34,717
Val
26,052
Tyr
Isoleu
38,473
40,095
38,543
38,029
39,889
34,323
Val
34,592
Met
38,972
-
36,596
Fenil
33,989
Met
13
Leu
39,487
41,064
39,526
39,376
40,833
36,137
-
36,434
Fenil
39,899
Iso
38,732
-
35,878
val
14
Lys
44,674
45,827
44,658
44,821
45,847
38,150 39,200
Iso Leu
38,615 39,647 44,869
Iso Leu Lys
39,739 44,820
Iso Lys
38,083 39,100 44,489
Iso Leu Lys
37 Lampiran 8. Kurva Standar Asam Amino
Konsentrasi (ppm) aspartat Glutamat Serin Histidin Glisin Arginin Alanin Tirosin Metionin Valin Fenilalanin Isoleusin Leusin Lisin
Luas Area A. A standar 31,25 50 62,5 320242 351719 456382 145504 535435 227964 437850 218236 221106 514635 262720 3242491 329264 90520
868262 964257 1242292 430979 1400397 652997 1255455 624291 779201 1151315 618965 935390 785774 213418
847677 989579 1224194 482543 1524497 636830 1198261 602562 552077 1250623 654050 827016 810776 235718
Aspartat 6100000
y = 13115x + 48593 R² = 0.998
4100000 2100000 100000 0 100 200 300 400 500 600
500 6600678 8807475 12414626 4501609 16594865 7059803 11711212 6455774 8058306 9968835 5964575 8245041 7474275 2293374
Glutamat
y = 17794x - 85400 R² = 0.999
8100000 7100000 6100000 5100000 4100000 3100000 2100000 1100000 100000 0
200
400
600
38 Lampiran 8. Lanjutan
Serin
Histidin
12400000 10400000
4100000
8400000 6400000
3100000 2100000
4400000
y = 25308x - 23860 R² = 0.999
2400000 400000
y = 9182.x - 87719 R² = 0.999
1100000 100000
0
500
1000
0
Glisin 15500000
7200000 6200000 5200000 4200000 3200000 2200000 1200000 200000
10500000 5500000 500000 200
400
600
0
600
4400000
2200000
2400000 400000
1200000 200000 400
y = 13214x - 15140 R² = 0.999
5200000 4200000 3200000
200
400
6200000
8400000 6400000
0
200
Tirosin
y = 23780x - 17634 R² = 0.999
10400000
600
y = 14495x - 18838 R² = 0.999
Alanin 12400000
400
Arginin
y = 34152x - 48250 R² = 0.999
0
200
600
0
200
400
600
39 4 Lampiran 8. Lanjutan
Valin
Metionin 8200000
10500000
y = 16665x - 27942 R² = 0.997
6200000
y = 19915x + 16314 R² = 0.999
8500000 6500000
4200000
4500000
2200000
2500000
200000
500000 0
200
400
0
600
Fenilalanin 5200000
400
600
Isoleusin
y = 12064x - 66524 R² = 0.999
4200000
200
y = 14241x + 1E+06 R² = 0.862
6700000 4700000
3200000 2200000
2700000
1200000 200000
700000 0
200
400
600
0
Leusin
200
400
600
Lisin 2480000
7250000
y = 15116x - 82745 R² = 0.999
6250000
y = 4675.x - 44188 R² = 0.999
2080000
5250000
1680000
4250000
1280000
3250000
880000
2250000 1250000
480000
250000
80000 0
200
400
600
0
200
400
600
58 40 Lampiran 9. Konsentrasi Asam Amino pada Sampel Gaplek, G40, GF0, GF20, dan GF40. No
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Gaplek AA Kons (ppm) Asp* Glu 5,692 Ser 9,732 Glis 14,345 Arg 13,205 Ala 8,130 Tyr 12,350 Val* Iso* Leu 5,752
G40 AA Asp Glu Ser Glis Arg Ala Tyr Met Fenil Iso* Leu Lys
Kons (ppm) 8,809 14,726 13,219 17,155 16,359 13,988 14,905 22,562 9,855 12,512 14,375
GF0 AA Kons (ppm) Asp 119,050 Glu 149,241 Ser 44,483 His 21,670 Glis 34,914 Arg 51,745 Ala 39,449 Tyr 29,120 Val 29,795 Fenil 43,318 Iso* Lys 63,129
Ket : * menandakan bahwa asam amino tidak terkuantifikasi
GF20 AA Kons (ppm) Asp 103,323 Glu 126,641 Ser 41,908 His 27,666 Glis 35,444 Arg 57,246 Ala 53,503 Tyr 34,747 Val 28,244 Fenil 40,109 Iso* Lys 74,029
GF40 AA Kons (ppm) Asp 272,151 Glu 288,071 Ser 93,477 His 61,381 Glis 129,596 Arg 104,325 Ala 147,923 Tyr 68,287 Met 108,152 val 47,082 Iso 14,957 Leu 148,557 Lys 151,747
