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Microbiologia de Anaeróbios Prof. Adj. Ary Fernandes Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências - UNESP Distrito de Ru...

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Microbiologia de Anaeróbios Prof. Adj. Ary Fernandes Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências - UNESP Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000/ Botucatu/ SP /Brasil Tel. 14 3880. 0412/0413 [email protected]

Aeração - Metabolismo energético

Aeróbio estrito Anaeróbio estrito (18-21% ) (<0,5%) P. aeruginosa, C.haemolyticum Mycobacterium

Microaerófilo Facultativo aeróbio (1-5%) (<0.5-21%) Enterobactérias Campylobacter, Neisseria

Microaerófilo anaeróbio (Aerotolerante) (2-8%) Bacteroides, Clostridium

Bactérias aeróbias e facultativas

O2

Metabolismo

Produtos tóxicos

Sistema de desintoxicação

Produtos não tóxicos

O2 + 2 e- + 2 H+  H2O2 O2 + e-  O-2 O2 + H2O2  OH* O-2 + H2O2  O2 + OH2- + OH* H2O2 + e- + H+  H2O + OH*

Ação das enzimas superóxido dismutase, catalase e peroxidase. Estas enzimas eliminam radicais tóxicos do oxigênio que são inevitavelmente gerados em sistemas vivos na presença de O2. A distribuição destas enzimas nas células determina a capacidade destas células existirem na presença de O2 .

Bactérias anaeróbias estritas

O2

Metabolismo

Produtos tóxicos

O2 + 2 e- + 2 H+  H2O2 O2 + e-  O-2 O2 + H2O2  OH* O-2 + H2O2  O2 + OH2- + OH* H2O2 + e- + H+  H2O + OH*

Ausência do sistema de desintoxicação

Morte bacteriana

Danos ao DNA, destroem componentes lipídicos, inativam enzimas

Teste da Catalase

Reação positiva produzida por Bacillus sp; Reação negativa produzida por Clostridium sp.

Visão geral das infecções por bactérias anaeróbias

Tétano

Toxinfecções Botulismo

Gangrena Gasosa Colite Pseudomembranosa

Determinam quadros clínicos específicos (infecções clássicas)

Bastonetes Esporulados Gram Positivos

Infecções Inespecíficas Cocos ou Bastonetes Gram Positivos ou Negativos

Principais bactérias anaeróbias de importância clínica Cocos

Bastonetes

Gram positivos

Peptococcus Peptostreptococcus

Gram negativos

Veilonella

Gram positivos não esporulados

Actinomyces, Propionibacterium

Gram positivos esporulados

Clostridium C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. perfringens

Gram negativos

Bacteroides fragilis, Prevotella, Fusobacterium, Porphyromonas

Anaeróbios predominantes da microbiota normal Pele Propionibacterium acnes, Peptostreptococcus

Trato genital feminino Bacteroides, Porphyromonas Peptostreptococcus; Clostridium; Lactobacillus

Cavidade oral e Trato respiratório superior Fusobacterium nucleatum Cocos anaeróbios Actinomyces

Intestino Grupo Bacteroides fragilis, Cocos anaeróbios, Clostridium; Eubacterium, Bifidobacterium

Bactérias anaeróbias e infecções associadas representativas Abscessos no cérebro -Peptostreptococos, Fusobacterium nucleatum e outros Infecções de orofaringe -Anaeróbios de orofaringe; Actinomyces, Prevotella melaninogenica, espécies de Fusobacterium Infecções de pleura e pulmões -Peptostreptococos, espécies de Fusobacterium, Prevotella melaninogenica, Bacteroides fragilis em 20 a 25% dos casos e outros

Infecções intra-abdominais -Abscesso de fígado: anaeróbios mistos em 40 a 90% dos casos, microrganismos facultativos -Abscessos abdominais: Bacteroides fragilis e outros da microbiota gastrintestinal Infecções do trato genital feminino

-Abscessos vulvares: Peptostreptococos e outros -Abscessos pélvicos e tubos ovarianos: Prevotella bivia e P. disiens, peptostreptococos, outros Pele, tecidos moles e infecções de medula -Microbiota anaeróbica mista; Propionibacterium acnes

Bacteriemia -Bacteroides fragilis; peptostreptococos; Propionibacterium; Fusobacterium; Clostridium e outros Endocardite -Bacteroides fragilis; Actinomyces

Localizações habituais de infecções causadas por bactérias anaeróbias Abscesso cerebral Infecções periodontais Abscesso pulmonar -pneumonia necrótica -empiema Infecções abdominais -pós-traumática ou pós-cirúrgica -posterior a ruptura visceral -tumor maligno Abscesso perirretal

Sinusite crônica

Bacteremia, septicemia, endocardite Abscessos subdiafragmático, hepático e sub-hepático

Na mulher, abscesso pélvico, endometrite, infecção pós-aborto, abscesso tubo ovariano

Celulite necrótica

Infecção vascular ou gangrena gasosa

Locais da infecção

Tipo de infecção

Sistema Nervoso Central

Abscessos cerebrais

Cabeça e Pescoço

Abscesso periodontal Outras infecções orais

Pleuro pulmonar

Pneumonia por aspiração Abscessos pulmonares Pneumonia necrosante

Intra-abdominais

Peritonites e abscessos

Trato genital feminino

Abscessos tubo-ovarianos Abscessos vulvo-vaginais Aborto séptico

Tecidos moles

Gangrena gasosa (mionecroses) Celulite crepitante Fascite necrosante

Características importantes das infecções inespecíficas por bactérias anaeróbias  Geralmente são infecções endógenas

 Geralmente são infecções mistas Geralmente o patógeno não apresenta fatores de virulência evidentes Geralmente existem fatores predisponentes característicos Geralmente existem dados clínicos sugestivos

Fatores predisponentes das infecções por anaeróbios  Isquemia tecidual  Presença de destruição tecidual

 Presença de tecidos desvitalizados  Presença de tecidos necrosados  Infecção prévia por outras bactérias

Insuficiência vascular periférica “Traumas”

“Cirurgias”

 Presença de corpo estranho nos tecidos  Mordidas de animais ou humanas  Processos obstrutivos (vias respiratórias ou biliares, trato intestinal)

Dados clínicos sugestivos  Odor fétido (ácidos graxos e aminas)  Necrose tecidual intensa e desproporcional a lesão  Produção de gás em abscessos  Produção de gás em tecidos moles (celulite crepitante);  Próximo a superfície de mucosas (anaeróbios fazem parte da microbiota de mucosas);

 Coloração negra em secreções contendo sangue;

Dados clínicos sugestivos  Infecção depois de mordidas;

 Infecção associada a tumor maligno, cirurgia intestinal ou ginecológica  Endocardite com hemoculturas negativas  Uso de aminoglicosídeos sem resultado terapêutico  Visto na lâmina de microscopia e não cresceu no meio de cultura em cultivos normais;

BACTÉRIAS ANAERÓBIAS (Isolamento) Amostras  Exsudato de abscessos profundos, biópsias teciduais;

Coleta  Descontaminar adequadamente a superfície (sabão, álcool iodado, iodo polvidona ou clorexidina) (Aspiração com agulha e seringa) Transporte adequado  Sem ou com mínima exposição ao oxigênio atmosférico Obs: Swab– devem ser, sempre que possível, rejeitados - São susceptíveis de serem contaminados, - ficam mais expostas ao O2 ambiente e à dissecação, - colhem pequenos volumes de produto para amostra, - não permitem a preparação de um bom esfregaço.

BACTÉRIAS ANAERÓBIAS (Tratamento de doenças inespecíficas) Seleção de agentes antimicrobianos apropriados Remoção de bactérias por drenagem de abscessos Eliminação de corpos estranhos Desbridamento de tecido necrótico

Bacilos anaeróbios Gram Positivos não esporulados Actinomyces (A. israelli); Propionibacterium; Eubacterium (E. lentum, E. timidum, E. brachy), Bifidobacterium (B. longum, B. breve) ; Arachnia; Rothia; Lactobacillus. -Membros da microbiota da pele e superfícies mucosas (boca, intestino, genitais) do Homem e animais -Muitas espécies são consideradas oportunistas -Crescimento lento: 3 ou + dias; Actinomyces (2 ou mais semanas)

Actinomyces Semelhante fungos (filamentos “ramificados”) Actinomyces israelli  Agente da Actinomicose (60% cervicofacial, 15% torácica, 20% abdominal, 5% outros tipos ex. DIU)

Raramente isolado em cultura pura (crescimento lento) Típicos “grãos de enxofre” na descarga da lesão

Actinomyces

Actinomicose cervicofacial

Bifidobacterium sp

Propionibacterium acnes habitante da pele e cólon implicado em quadros de endocardite (próteses valvulares), septicemias acne em adolescentes

Bacilos anaeróbios Gram negativos Bacteroides; Fusobacterium; Prevotella; Porphyromonas; Wolinella; Leptotrichia; Desulfomonas; Butyrivibrio; succinivibrio, Anaerovibrio, Anaerobiospirillum, Selenomonas. Membros da microbiota normal de animais e humanos -boca - trato respiratório superior - intestino - aparelho genital Encontrados em mais de 50% das amostras clínicas que contêm anaeróbios

Bacteroides Grupo dos Bacteroides pigmentados e Porphyromonas (colônias pigmentadas) (B. corporis, B. denticola, P. asaccharolytica, P. gingivalis,, P. endodontalis:

-Microbiota normal da boca, aparelho intestinal e urogenital -São agentes frequentes de infecções: • dentárias • pescoço e cabeça • após mordedura

Bacteroides Grupo dos Bacteroides não pigmentados (bile sensíveis) Atualmente inclui Prevotella (P. melaninogenica) e B. bivius, B. disiens, B. oris, B. buccae, B. oralis Implicados em situações idênticas às referidas para os Bacteroides pigmentados

Bacteroides Grupo do Bacteroides fragilis (bile resistentes) Inclui, entre outros: B. fragilis; B. tethaiotaomicron, B. distasonis -Implicados em situações de infecções e sepsis com ponto de partida abdominal

Fusobacterium Fusobacterium longos, finos, pontas afiladas F. nucleatum  Microbiota normal da boca, trato respiratório superior, intestino e aparelho genital; implicado no mesmo tipo de infecção que os Bacteroides pigmentados F. necrophorum  Altamente virulento; em crianças e jovens: pode causar faringoamigdalite, complicações locais (abscesso periamigdalino, abscesso periapical, tromboflebite séptica veia jugular. Complicações à distância: abscessos metastáticos, pós bacteriemia  pulmão, pleura, fígado, articulações. F. ulcerans  (isolado a partir de lesões ulceradas )

Bacilos anaeróbios Gram negativos

3

1 - Fusobacterium nucleatum - microscopia eletrônica de transmissão; 2 - Bacteroides fragilis - microscopia eletrônica de transmissão; 3 - Fusobacterium nucleatum - coloração de Gram; 4 - Bactérias produtoras de pigmento negro - Porphyromonas e Prevotella.

Prevotella sp

Cocos anaeróbios Gram positivos  Relevância clínicas  Gêneros Peptostreptococcus (P. magnus, P. asaccharolyticus, P.prevotti, P.micros e P. anaerobius); Peptococcus (P. niger) Normalmente colonizam a cavidade oral, trato gastrintestinal, trato genito-urinário e a pele; Quando estes microrganismos se disseminam para locais normalmente estéreis eles causam infecções; -É necessário evitar a contaminação de amostras clínicas por peptostreptococos que existem na microbiota da mucosa; -A amostra colhida deve ser transportada num recipiente livre de oxigênio para impedir a perda dos microrganismos; -Os microrganismos necessitam de ser cultivados em meios enriquecidos e por um período longo, entre 5 a 7 dias.

Gênero Clostridium (* 202 espécies) * Euzéby (2012) www.bacterio.cict.fr/c/clostridium.html

 Bastonetes Gram positivos (0,2 a 4 m por até 20m)

Endósporos (método

de Wirtz)

Endósporos Microscopia eletrônica

C. tetani

C. botulinum

C. difficile

Gênero Clostridium Normalmente móveis (peritríqueos)

cápsula

Cápsula (C. perfringens)

Cultivo em anaerobiose (Técnicas especiais)

Gênero Clostridium  Patogênicos  Meios Complexos e Enriquecidos (AS)

 pH próximo do neutro; Incubação em torno de 37oC  Colônias (1 ou 2 dias, Contornos Irregulares)

 Maioria hemolíticos

C. perfringens

Gênero Clostridium Meio líquido (Tioglicolato ou Fragmentos de Tecidos) Odor pútrido em culturas ou lesões Produtos do Metabolismo  Identificação de espécies Sensíveis ao estresse ambiental e desinfetantes

Espécies Patogênicas  Exotoxinas (Neurotrópicas e Necrozantes)

Gênero Clostridium Não Invasivos  Toxinfecção (C. tetani e C. botulinum) Invasivos  Manifestações Regionais ou Sistêmicas

C. perfringens (Enterotoxemias; Infecções de Feridas)

C. septicum (Infecções de Feridas Edema maligno) C. difficile (Enfermidades diarrêicas em HO)

C. novyi (GG em HO) C. chauvoei , C. haemolyticum (Anaeróbio estrito), C. piliforme, C. sordelli , C. colinum , C. spiroforme,

Clostridium tetani (10 tipos sorológicos - Ag H) Solo ( Doença Telúrica) Transitório no intestino; Todos os mamíferos são susceptíveis

Período de Incubação x Mortalidade (incubação 3-5 dias  mortalidade 90%) (incubação ± 20 dias  mortalidade 3%)

Clostridium tetani Patogenia  Toxinas (Tetanolisina e Tetanospasmina) Esporo (Lesão)  Forma Vegetativa  Toxina (Tetanospasmina)  SNC  Impede liberação Glicina e/ou Ácido Gama-Aminobutírico  Paralisia Espástica  Morte Som e Luz x Liberação de Glicina;

Riso Sardônico ou Trismo

Neurotoxinas de Clostridium Polipeptídeo 50 k Da (Pré-Toxina) Fração A (Active) (Leve) (50 kDA) - Efeito Tóxico Fração B (Binding) (Pesada) (100 kDA) - Fixação

Ativação quando quebra desta ligação bissulfeto Proteases-Tétano Tripsina - Botulismo

Ação da toxina tetanospasmina (Neurotoxina)

Glicina

Interneurônio inibitório Inibição Sinais excitatórios do Sistema Nervoso Central

Acetilcolina

Músculo

Toxina tetânica

Clostridium tetani -DiagnósticoClínico, Bacterioscopia, Cultura, Inoculação em Animais Sensíveis. -Tratamento  Antitoxina (Soro antitetânico) (para Toxina livre) (Tratamento de suporte) -Sensibilidade a drogas  Penicilinas, Cefalosporinas, Metronidazol -Imunização Toxóide Tetânico (Neurotoxina tratada)

Patogenia do

C. tetani

Paralisia Espástica

Opistótono A severe case of tetanus. muscles, back and legs are rigid muscle spasms can break bones can be fatal (e.g respiratory falure falure))

Paralisia Espástica

Clostridium botulinum

(Toxina potente x termolábil) Botulismo (Botulus = Salsicha)

Patogenia Esporo no alimento  Forma Vegetativa  Toxina (Tipos = A, B, C1, C2, D, E, F, G e H)  Intestinos  Circulação  Nervos (Placa Mioneural)  Inibe liberação de Acetilcolina  Paralisia flácida  Morte (18 a 36 horas) Resistente à Pepsina e HCL Sensível à Tripsina (Ativação da Toxina) Secura na boca e diplopia

Ação da toxina Botulínica(Neurotoxina) Sinais excitatórios do Sistema Nervoso Central

Músculo

Mecanismo da Toxina Botulínica

Patogenia do Botulismo

Botulismo Clássico ou por alimentos: Resulta da ingestão de toxina pré-formada em alimentos contaminados Os alimentos caseiros estão mais envolvidos do que os alimentos industrializados É observado tipicamente em adultos Botulismo infantil: Resulta da multiplicação in vivo de C. botulinum, com produção de neurotoxina no intestino do lactente Os lactentes ingerem esporos (do solo ou da poeira caseira), mas não a toxina pré-formada É a forma mais comum Dificuldade em sugar e deglutir, choro alterado, hipotonia e fraqueza muscular

Botulismo de feridas: Resulta da produção de toxina botulínica in vivo após multiplicação do C. botulinum numa ferida infectada É a forma mais rara

Ferida botulínica

Botulismo indeterminado: Não é possível implicar uma origem de C. botulinum alimentos ou feridas É observado em indivíduos com mais de 12 meses de idade

em

Clostridium botulinum -Diagnóstico  Clínico Toxina no plasma ou em tecidos antes da morte

-Tratamento  Soroterapia (Para toxina livre) Guanidina e Aminopiridina ( liberação de Acetilcolina)

-Imunização  Toxóide (Necessário elevada quantidade da toxina)

Clostridium perfringens (Tipos A - E) (Clostridio Invasivo) Ocorre no trato intestinal de humanos, animais e solo. Capsulado

Manifestação Clínica Intoxicação (Enterotoxemias) (Rápida Multiplicação) Infecção com Gangrena Gasosa (Destruição Tecidual)

C. perfringens

Clostridium perfringens Patogenia Esporo  Tecido (Lesão ou Via Digestiva)  Toxinas e Enzimas Necrozantes (Forma Vegetativa)  Necrose

 Bacteremia (Linfáticos e Sanguíneo)  Toxemia  Morte do Indivíduo.

Clostridium perfringens -Toxinas (14 tipos) (Toxina alfa ou fosfolipase C) (Age sobre Lecitina do Tec. Conj. Necrose local)

-Diagnóstico  Bacterioscopia, Pesquisa da toxina, (cultivo) -Tratamento  Enterotoxemia  Antitoxina

Penicilina G, Metronidazol, Macrolídeos, Ampicilina Oxigênio Hiperbárico

Toxinas de Clostridium perfringens

FERMENTAÇÃO TUMULTUOSA- STORMY FERMENTATION

IRON MILK O Clostridium perfringens É O ÚNICO MICRORGANISMO QUE PRODUZ ESTA REAÇÃO

Toxina alfa - lecitinase (fosfolipase C)

C. perfringens

enterotoxigênico

Gangrenas

Gangrenas

Gangrenas

Clostridium septicum Edema maligno

Celulite por

Clostridium

Colite (Clostridium difficile)