INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
PRODUCTOS NATURALES
AUTORES:
Dr. GUSTAVO VALENCIA DEL TORO M. en C. MARÍA EUGENIA GARÍN AGUILAR
Primera Edición Enero 2010
CONTENIDO
PRÁCTICA NOMBRE PRESENTACIÓN REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE PRODUCTOS NATURALES I MÉTODOS BÁSICOS DE EXTRACCIÓN 1.1 Medidas de seguridad en el laboratorio y manejo de residuos 1.2 Análisis de compuestos puros 1.3 Operaciones básicas de separación de sustancias químicas para la obtención de productos naturales II SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS 2.1 Cromatografía en capa fina y en Papel 2.2 Cromatografía en columna III ANÁLISIS PRELIMINAR FITOQUÍMICO DE PLANTAS MEDICINALES Y HONGOS 3.1 Preliminar fitoquímico 3.2 Análisis espectroscópico infrarrojo y resonancia magnética. IV DETECCIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS DE TEJIDOS VEGETALES V ANÁLISIS DE PIGMENTOS FLAVONOIDES DE SEMILLAS DE Phaseolus spp. VI ANÁLISIS DE ACEITES ESENCIALES DE SEMILLAS DE Umbeliferaceas ANÁLISIS DE ALICINA EN Allium spp. VII VIII EXTRACCIÓN DE CAFEÍNA DE HOJAS DE TÉ NEGRO APÉNDICE 2. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Pag 3 4 6 10 15 23 27 31 37 40 43 46 49 52 55
2
PRESENTACIÓN El área de los Productos naturales se ha desarrollado ampliamente a lo largo de la existencia de la humanidad, iniciando con el interés de los pueblos indígenas por el uso empírico que le dieron a las plantas y otros organismos para satisfacer sus necesidades de alimentación y salud, así como, para el desarrollo de actividades religiosas. Con el paso del tiempo la confluencia de disciplinas científicas como la Botánica, Etnobotánica, Fitoquímica, Farmacología, etc. han dado soporte al estudio de los metabolitos de los productos naturales que se obtienen de las plantas y otros organismos. Asimismo, una gran cantidad de fármacos provienen de los productos naturales que generan los organismos vivos. Es por ello que surge la necesidad de que los futuros ingenieros Farmacéuticos conozcan los principales métodos procedimientos y técnicas de obtención de los metabolitos secundarios que conforman el basto campo de los productos naturales. En el presente manual se describen los experimentos básicos que permiten manejar los métodos y técnicas de obtención, caracterización y purificación de metabolitos secundarios presentes en los productos naturales. Es conveniente indicar que este manual de prácticas de productos naturales se utilizó para cubrir la parte práctica de la asignatura optativa de Productos Naturales del plan rediseñado de la Carrera de Ingeniería Farmacéutica. Las prácticas contenidas en este manual fueron impartidas al grupo 7FV1 durante el primer semestre del ciclo escolar 2009-2010. Los autores agradecen a los estudiantes su entusiasta participación durante el curso, ya que con ello se realizaron las modificaciones pertinentes a los desarrollos experimentales en el transcurso del semestre. También, estamos concientes que todo manual de prácticas elaborado requiere de su contínua adecuación e implementación en el laboratorio, por lo que tomaremos en cuenta todas las observaciones y modificaciones, que tanto alumnos como profesores nos indiquen, con la finalidad de mejorar éste manual. Esperando que el material didáctico elaborado cumpla con la función de introducir a los estudiantes en la disciplina de los productos naturales nos congratulamos en ponerlo a su disposición. ATENTAMENTE Los autores. Dr. GUSTAVO VALENCIA DEL TORO
M. en C. MARÍA EUGENIA GARÍN AGUILAR
3
Reglamento del laboratorio de Productos Naturales El objetivo del presente reglamento es contribuir a la instrumentación de medidas de seguridad básicas que prevengan y/o eliminen los accidentes en laboratorio. Responsabilidades: -
Los Profesores responsables de impartir el curso de laboratorio de Productos Naturales serán los responsables conocer y hacer cumplir las normas establecidas en el presente reglamento. Así como de su comunicación a los alumnos de sus grupos respectivos.
Normas generales del Laboratorio: Las normas incluyen reglas, recomendaciones o prohibiciones relacionadas con el conocimiento, el sentido común y la seguridad en el trabajo de laboratorio. • • • • •
•
• • • • • • •
Estará PROHIBIDO comer, beber, almacenar alimentos, correr, fumar, maquillarse o manipular lentes de contacto en el laboratorio. El área de trabajo deberá estar limpia y ordenada. No debe colocarse libros, abrigos o bolsas sobre las mesadas de trabajo. Se deberá verificar que la mesa de trabajo esté limpia al comenzar y al terminar el trabajo realizado. En el laboratorio de enseñaza se deberán almacenar la menor cantidad posible de drogas y reactivos. Los mismos deberán estar debidamente etiquetados y almacenados en forma segura y en el lugar adecuado. Se deberá usar vestimenta adecuada: bata con MANGA LARGA que cubra la ropa de calle, preferentemente de algodón, zapatos cerrados no huaraches o sandalias, asimismo, se deberá tener el pelo recogido. Es obligatorio el uso de ANTEOJOS DE SEGURIDAD, según sea lo que corresponda, durante la realización de los Trabajos Prácticos. Los ojos son órganos muy vascularizados que pueden absorber rápidamente algunos compuestos químicos. Las gafas deberán de uso personal y no pueden ser intercambiadas entre los alumnos. Los alumnos o docentes que realicen tareas experimentales en el laboratorio es de CARÁCTER OBLIGATORIO usar guantes apropiados acorde a los riesgos y los reactivos que se manipulen. Los guantes previenen el contacto con agentes tóxicos o biológicos, quemaduras por superficies calientes, frías o corrosivas y cortes por objetos punzantes. Cuando corresponda utilizar cubrebocas y gorro para el pelo. PROHIBIDO pipetear con la boca. Se podrán utilizar pipetas de vidrio o plástico con propipetas o pipetas automáticas. Los alumnos y docentes deberán estar familiarizados con los elementos de seguridad disponibles, salidas, extintores, duchas, lavaojos, etc. Toda herida, aún los pequeños cortes, que se produzca durante un trabajo práctico deben ser informados obligatoriamente al docente. Cuando el trabajo práctico involucre gases, vapores, humos o partículas, solventes, etc. deberá realizarse en la campana de extracción. No debe recibirse material de vidrio visiblemente defectuoso. Debe informarse al profesor responsable del grupo de las roturas de material o desperfectos detectados durante la operación de materiales y equipos. En el caso de que alguna sustancia química entre en contacto con la piel (manos, cara y sobre todo con los ojos), debe lavarse la zona afectada con abundante agua durante 15 minutos por lo menos. Avise a los profesores responsables.
4
Considerar el siguiente letrero de una universidad española:
5
Práctica I
MÉTODOS BÁSICOS DE EXTRACCIÓN
1.- Medidas de seguridad en el laboratorio y manejo de residuos OBJETIVO El alumno comprenderá las medidas de seguridad, el manejo adecuado de los reactivos y disolventes, así como, el tratamiento de los residuos generados durante cada experimento. INTRODUCCIÓN. 1.1 Medidas de seguridad Al igual que los laboratorios de Química, Química Orgánica, Fisicoquímica, Bioquímica, etc, el laboratorio de Fitoquímica requiere de las precauciones de seguridad adecuadas. Es por ello que en todo laboratorio experimental se deben de seguir reglas generales de a comportamiento para el trabajo con los materiales, equipos y reactivos químicos del laboratorio. Entre las reglas básicas para el laboratorio de Fitoquímica están las siguientes: 1. Usar bata de algodón durante su estancia en el laboratorio. 2. Ubicar y tener en mente las de salidas de emergencia, extinguidores de fuego y botiquín de primeros auxilios. 4. Distinguir los códices de colores de tuberías y llaves de suministro de agua, aire, vacío y gas. 5. No poner objetos personales sobre la mesa de trabajo. 6. Trabajar en la campana de extracción o en un lugar bien ventilado, cuando se utilicen sustancias tóxica, solventes, o reactivos químicos que desprendan vapores. 7. No fumar en el laboratorio, ni ingerir alimentos. 8. Traer protección en los ojos durante su permanencia en el laboratorio. 9. No usar lentes de contacto en el laboratorio. 10. Informar inmediatamente sobre cualquier accidente que ocurriera, sea un daño físico como quemaduras, cortaduras o algún daño al equipo del laboratorio. 11. En caso de mancharse la bata con algún reactivo peligroso, quitársela lo más pronto posible. 12. Usar guantes adecuados para cada caso, cuando se manejen materiales corrosivos o tóxicos, objetos punzo-cortantes (vidrio, tubo, etc.) materiales muy calientes o muy fríos. 13. Usar una toalla para proteger sus manos cuando corte vidrio o inserte tubo de vidrio o termómetros en tapones. Lubricar las perforaciones de tapones antes de introducir el tubo o el termómetro. 14. Leer con cuidado las etiquetas en los frascos de reactivos que va a utilizar, y tomar en cuenta sus indicaciones. 15. Manipular adecuadamente los líquidos y sólidos de los frascos que los contienen, usando pipetas, probetas o espátulas. Para el caso particular de los líquidos, extraer con la perilla de extracción, pro pipeta o jeringa adaptada con un trozo de manguera, NUNCA CON LA BOCA. 16. Cuando se preparen soluciones ácidas, verter siempre el ácido al agua y nunca en forma inversa. 1 7. Si un ácido, base o cualquier reactivo corrosivo salpica su cuerpo, enjuagarse con abundante agua y llamar al profesor. 18. Antes de encender un mechero asegurarse de que no haya cerca vapores o líquidos flamables. 19. Nunca calentar un aparato que no esté abierto a la atmósfera. 20. Antes de verter o evaporar un líquido orgánico asegurarse que no haya una flama cerca. 6
21. Nunca calentar un líquido orgánico sobre la flama, utilice para ello parrilla o canastilla eléctrica. 22. No regresar sobrantes de reactivos a los envases originales y no pipetear en los frascos originales de los reactivos, colocar siempre una pequeña cantidad en un recipiente. 23. Usar siempre pipetas limpias para medir las diferentes sustancias. 24. Si no se conoce el manejo de un equipo, leer el instructivo antes de utilizarlo y si aún así no queda claro, preguntar al instructor. 25. Antes de verter los residuos al caño, asegurase de que es posible si son diluidos con agua, de lo contrario verterlos en recipientes adecuados para ello. 26. Antes de retirarse del laboratorio dejar limpio el material utilizado durante la práctica y el lugar de la mesa utilizada, asegurarse de que no quede ningún equipo encendido o conectado o una llave de agua o gas abierta. 1.2 Manejo de los residuos generados durante las prácticas. La seguridad en el laboratorio no termina al finalizar el trabajo experimental sino hasta que se coloquen adecuadamente los residuos generados, ya que debe de considerarse el impacto ecológico que pueden causar si son desechados irresponsablemente. Los residuos químicos son sustancias que fueron utilizadas en el laboratorio y no es posible regresarlas a su recipiente original, debido a que han sufrido cambios durante la experimentación y no son ya útiles para realizar nuevos experimentos, por lo que no tiene caso guardarlos en los anaqueles específicos para reactivos químicos. Asimismo, en ocasiones los compuestos o mezclas formadas pueden ser cancerígenos, mutágenos, infecciosos, teratológicos, o explosivos. Algunas acciones y actitudes que se deben de tener al trabajar los residuos químicos son: 1. Conocer la naturaleza de los residuos que se van a generar. 2. Utilizar la menor cantidad posible de reactivos, haciendo un escalamiento de los procedimientos, cuando el experimento así lo permita. 3. Identificar las sustancias que se pueden recuperar o regenerar. 4. Predeterminar los compuestos más peligrosos (cancerígenos, mutágenos, infecciosos, teratológicos, etc.). 5. Familiarizarse con las etiquetas de seguridad que tienen los reactivos. En el laboratorio debe de contar con varios recipientes para que los residuos que se generan durante las prácticas se depositen y posteriormente sean desechados de manera adecuada, dichos recipientes deben ser etiquetados y cumplir las funciones siguientes: A) Residuos acuosos. En este recipiente se colocan residuos acuosos de ácidos orgánicos (ácido acético) o ácidos inorgánicos (ácido nítrico, ácido sulfúrico, etc.). Para tratar estos residuos se diluyen aproximadamente de 1:5 con agua. Se neutralizan lentamente con hidróxido de sodio (en solución o escamas). Se diluye nuevamente de 1:10 con agua y se elimina por el drenaje, dejando correr el agua en abundancia. B) Residuos orgánicos. En este grupo podemos se encuentran los alcoholes, aldehídos, cetonas, éteres, ésteres. Si son solubles en agua diluir aproximadamente en 1:20 con agua y eliminar por el drenaje. Si no lo son, evaporar en pequeñas dosis en la campana de extracción. Las cetonas insolubles se incineran en 7
la campana a pequeñas dosis. Los aldehídos insolubles se oxidan agregando permanganato de potasio en solución o dicromato de potasio. Se diluyen 1:10 y se eliminan en el drenaje dejando correr agua en abundancia. C) Residuos halogenados. Como ejemplos el diclorometano, el cloroformo, el ácido trifluoracético. Se requiere de un procedimiento más elaborado que no es posible realizar en el laboratorio. Por ello se canaliza al organismo apropiado para su tratamiento. D) Residuos de fases estacionarias cromatográficas (sílica gel, alúmina, etc). Se requiere de un procedimiento más elaborado que no es posible realizar en esta escala en el laboratorio. Por ello se canaliza al organismo apropiado para su tratamiento. Dependiendo del tipo de reactivo deberá elegirse las características de los recipientes que serán utilizados para contenerlos. MATERIALES 1.- Frascos vacíos de vidrio o plástico limpios y secos con capacidad de 0.5 a 2 L con motivo de etiquetarlos para desechos, cinta adhesiva y marcadores (alumnos). 2.- Frascos con reactivos y disolventes que se emplearán durante el desarrollo del curso. 3.- Carteles que ilustran claves e instrucciones para trabajar con seguridad en el laboratorio. PROCEDIMIENTO Se hará un recorrido por el laboratorio para mostrar la ubicación de las salidas de emergencia, extinguidores, campanas de extracción, sitio para realizar el desecho de residuos, lugar para la limpieza del material utilizado durante las prácticas e instrucciones para su limpieza; asimismo se indicará la ubicación de reactivos y disolventes. Se revisarán las etiquetas de los disolventes y reactivos que se emplearán durante el desarrollo del curso, así como, de carteles existentes en el laboratorio que tienen que ver con el manejo adecuado de los mismos. Se colocarán etiquetas a los frascos de desechos clasificándolos en los cuatro rubros antes mencionados. REFERENCIAS Bernabei, D. 1994. Seguridad. Manual para el laboratorio. Merck. Alemania.233 pp. Luzón, S.G. 1992. Hazards in the chemical laboratory. 5th. Ed. RSC Cambridge. 675 pp.
8
INFORME SESIÓN 1 TITULO DE LA PRÁCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados: 1.- Mencione 3 medidas de seguridad que protejan su integridad física cuando trabaje en el laboratorio: 2.- Realice la búsqueda en Internet de los principales símbolos de peligrosidad (pictogramas) que son usados para los reactivos químicos y áreas de laboratorios. Hacer una descripción de cada unos de ellos y decir cuales son las diferencias entre los símbolos usados en los Estados Unidos y en la Unión Europea. 3.- Además de los pictogramas antes indicados, las etiquetas de los reactivos cuentan con un código adicional (con letras) sobre riesgos específicos y consejos de prudencia. Indique para al menos 5 reactivos químicos que se encuentran en su mesa cuáles son dichas indicaciones. No olvides reportar la bibliografía consultada, recuerda que para páginas Web se debe de escribir de la siguiente forma: El patrón básico para una referencia electrónica es: Autor, inicial(es) de su nombre (año). Título. Mes, día, año, dirección en Internet. Ejemplo: Bancos, I. (n.d.). Los NHS marcan la pauta del cuidado de la salud. Obtenida el 29 de agosto de 2001, de http://www.healthcareguide.nhsdirect.nhs.uk/ Si no consigue identificar la fecha en que el documento fue publicado, utilice la abreviatura n.d. (no date [sin fecha]). Si no consigue identificar al autor, empiece su referencia con el título del documento. Si el documento se ubica dentro de una página institucional, como la de alguna universidad o departamento gubernamental, primero cite el nombre de la organización o del departamento en cuestión, antes de dar la dirección electrónica, ver ejemplos: 1.- Alexander, J., & Tate, M. A. (2001). Evaluando las Fuentes Electrónicas. Consultado el 21 de agosto de 2001, Widener University, página web conmemorativa de la biblioteca Wolfgram: http://www2.widener.edu/Wolfgram-Memorial- ibrary/webevaluation/webeval.htm 2.- Decidiendo su futuro. (2000). Consultado el 5 de septiembre de 2001, Portsmouth University, página web de Servicios Profesionales: http://www.port.ac.uk/departments/careers/plancareer/deciding-your-future.htm
9
2.- Análisis de compuestos puros OBJETIVO El alumno determinará los puntos de fusión y ebullición de mezclas y sustancias puras y relacionará las propiedades fisicoquímicas con la pureza de los compuestos químicos. INTRODUCCIÓN: Un problema que con frecuencia se encuentra en las investigaciones con productos naturales es la identificación de sustancias y la determinación de su pureza. Una primera aproximación para determinar la pureza de los compuestos químicos es la determinación de constantes físicas como punto de fusión, punto de ebullición, densidad, índice de refracción, etc. Los puntos de fusión y ebullición son especialmente útiles para la identificación de compuestos orgánicos. Actualmente para caracterizar substancias se emplean técnicas modernas de análisis, tales como espectroscopia en sus diversas modalidades Ultravioleta-Visible (UV-Vis), Infrarrojo (IR), Resonancia Nuclear Magnética (RNM)), Espectrometría de masas (EM), cromatografía de gases (CG) y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). a).-PUNTO DE FUSIÓN. El punto de fusión de un compuesto se puede definir, como la temperatura a la cual un sólido pasa al estado líquido y por lo tanto en el punto de fusión el estado sólido y líquido están en equilibrio. Se usa en la identificación de compuestos desconocidos y también como un criterio de pureza. Los compuestos puros tienen un punto de fusión definido con un intervalo de 0.5 a 1 °C. La presencia de impurezas abate el punto de fusión y amplia dicho rango en ocasiones en más de 4 ºC. Para el caso de los compuestos orgánicos sólidos, la determinación del punto de fusión del compuesto (Tf) es una técnica muy utilizada. Varias razones prácticas la justifican: es rápida y requiere temperaturas moderadas (100-200 oC), los cambios de Tf con la presión son muy pequeños, Tf es muy fácil de detectar experimentalmente, y se utiliza muy poca cantidad de muestra. b).-PUNTO DE EBULLICIÓN. El punto de ebullición se define como la temperatura a la cual la fase vapor y la fase líquida coexisten. En cualquier combinación de presión y temperatura, una cierta fracción de moléculas del líquido escapan o se evaporan de su superficie como vapor. Este proceso se llama vaporización o evaporación y el proceso opuesto se denomina condensación. La presión ejercida por este vapor que escapa se denomina presión de vapor de un líquido y su valor aumenta con el aumento de temperatura. La temperatura a la cual la presión de vapor es igual a la temperatura externa se llama punto de ebullición del líquido. El más familiar es el del agua, que ocurre a 100 ºC y una atmósfera de presión y se conoce como punto de ebullición normal del agua. Las moléculas de agua están unidas en la fase líquida por fuerzas de atracción moderadamente fuertes llamadas puentes de hidrógeno. El calentamiento es necesario para romper estas fuerzas y permitir que el líquido pase a la fase gaseosa. Al igual que el punto de fusión, la temperatura de ebullición de una sustancia impura no es un punto fijo y preciso como el punto de ebullición de un líquido puro, pero el análisis de pureza por medio del punto de ebullición es menos exacto, pues los intervalos de temperatura que se obtienen dependen del aparato utilizado. El punto de ebullición de un compuesto se define como la temperatura a la que la presión de vapor del líquido iguala la presión atmosférica. Los líquidos puros tienen puntos de ebullición constantes. Mezclas de líquidos muestran un intervalo de ebullición, excepto casos especiales que incluyen una mezcla con un punto de ebullición constante llamada azótropo. c).- PUNTO DE SUBLIMACIÓN. Una técnica muy usada para purificar sólidos es la sublimación. El punto de sublimación de una sustancia es aquella temperatura a la cual dicho compuesto pasa de la fase sólida a la fase gas 10
directamente, sin pasar por la fase líquida, mediante el mecanismo de sublimación. Algunos sólidos, como el iodo o la quinina, experimentan dicha transición de fase. Termodinámicamente suele ser una transición favorable debido al gran incremento de entropía que conlleva. La sublimación de un sólido se lleva a cabo cuando se igualan la presión de vapor del sólido con la presión externa. Consiste en que un sólido se calienta y se convierte en vapor sin pasar por el estado líquido, y el vapor se vuelve a solidificar en contacto con una superficie fría. Si este proceso sólo lo sufre el sólido que se quiere purificar y no sus impurezas, el resultado puede ser altamente satisfactorio. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Ácido benzóico, glucosa, sal común, alcanfor, acetona, fármaco ibuprofeno, Hexano, metanol, etanol, glicerol MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO: 4 Tubos capilares para determinar punto de ebullición 1 Termómetro 1 Aparato para la determinación del punto de fusión 1 Mechero Bunsen 1 Embudo 1 Mortero con pistilo 1 Liga
1 1 1 1 1 1 1 1 1
Cápsula de porcelana Vaso de precipitado de 300 mL Parrilla eléctrica Tubo de ensayo cristalizador cápsula espátula vidrio de reloj Balanza analítica
11
PROCEDIMIENTO: DETERMINACIÓN DEL PUNTO DE FUSIÓN a) En este experimento se determinarán los puntos de fusión del ácido benzóico y de la glucosa puros (p.f. 121 – 123 y 146 °C, respectivamente), así como de una mezcla 50:50 de ambos compuestos. Para ello colocar una pequeña cantidad del compuesto en el portaobjetos circular de la platina de calentamiento del aparato Fisher, iniciar el calentamiento, en el momento en el cual se funda la sustancia registrar la temperatura, hacer lo mismo para las demás sustancias. Para ilustrar el abatimiento en el punto de fusión, determina el punto de fusión de la mezcla de benzóico-glucosa. b) En esta parte del experimento se determinará el punto de fusión del principio activo de un fármaco y de su excipiente. Preparación de la muestra: 1. Pesar 1 tableta de ibuprofeno (400 mg) y calcular la cantidad equivalente a 0,5 g de ibuprofeno (se recomienda hacerlo un día antes de la práctica). 2. Triturar en un mortero las tabletas necesarias, pesar la cantidad equivalente antes calculada de material pulverizado, guardar cantidad sobrante para determinar punto de fusión, disolver el equivalente a los 0.5 g de ibuprofeno en 10-20 mL de acetona agitar y filtrar, evaporar el filtrado hasta sequedad sin calentarlo. Cristalizar el residuo con 10 mL de acetona, separar los cristales, dejar secar al aire y utilizar el residuo como sustancia problema, determinarle el punto de fusión a la pastilla completa (sustancia problema 1-2), al residuo del papel filtro (sustancia problema 2) y a los cristales obtenidos (sustancia problema 1). DETERMINACIÓN DEL PUNTO DE EBULLICIÓN Con ayuda del mechero Bunsen fabricar algunas campanitas de ebullición cerrando un extremo de los capilares. Colocar sobre la placa de calentamiento o parrilla el vaso de precipitados, un agitador magnético y el aceite mineral o glicerol que servirá como baño caliente. Añadir 2 mL del líquido problema a un tubo de ensayo pequeño y deja caer una campanita de ebullición con el extremo cerrado hacia arriba, de modo que quede sumergida en el líquido. Fijar el tubo de ensayo al termómetro con la banda de hule e iniciar el calentamiento. Cuando una corriente de burbujas rápida, ascendente y continua salga del capilar, anotar la temperatura y desconectar la placa, Cuando las burbujas dejen de salir del capilar y el líquido empiece a entrar en él, vuelve a registrar la temperatura. Promediar ambas temperaturas para obtener la temperatura de ebullición del líquido. Seguir el mismo procedimiento para los otros líquidos. Determine el punto de ebullición de los siguientes compuestos: Hexano. Metanol, Etanol y mezcla de metanol-etanol 50:50. SEPARACIÓN DE SÓLIDOS POR SUBLIMACIÓN En este experimento se trata de purificar alcanfor que está contaminado con sal común. Se realiza con la finalidad de practicar la técnica de la sublimación y comprobar su utilidad. El alcanfor es un sólido bastante volátil, que si se calienta puede convertirse en vapor todavía muy por debajo del punto de fusión. En contraste, el cloruro de sodio no es volátil, dado que es una sustancia iónica Colocar en el cristalizador una muestra de la mezcla de alcanfor y sal común. La masa de la muestra debe ser aproximadamente 1 g, pero ha de ser pesada con exactitud. (Anotar el valor de esta pesada). Pese también el vidrio de reloj. Ponga el vaso con la muestra sobre la parrilla de calentamiento. Enfriar una cápsula colocando en ella trozos de hielo machacado y colocarla sobre la boca del cristalizador. Graduar la calefacción de la parrilla de manera que el vaso se caliente suavemente. Observar conforme se calienta el vaso se deposita el alcanfor sólido en la base de la cápsula. Cuando ya no se aprecie que aumenta la cantidad de alcanfor sublimado, desconectar la parrilla y dejar 12
enfriar. Retirar con cuidado la cápsula de porcelana, retirar con cuidado el agua y el hielo de la cápsula y secarla con papel absorbente. Colocar sobre la mesa una hoja de papel y sobre ella el vidrio de reloj que ha pesado. Con ayuda de una espátula, raspe con cuidado el fondo de la cápsula para separar el alcanfor, dejándolo caer sobre el vidrio de reloj. Pese el vidrio con el alcanfor recuperado. Calcule el porcentaje de alcanfor en la mezcla inicial. RESIDUOS Y SU MANEJO: Tubos capilares cerrados por un extremo. Se lavan y guardan para posteriores experimentos. Solventes hexano, metanol y etanol, y mezcla metanol-etanol Se colocan en el recipiente por separados para su destilación y re-uso, excepto la mezcla. Glicerol. Se enfría y se guarda para su uso posterior. Alcanfor Entregue el alcanfor obtenido al profesor para su re-uso Residuo de salino Disolver en agua y verter en el drenaje REFERENCIAS: Pavia D.L., Lampman, G.L., Kriz G.S. Jr. 1976. Introduction to organic laboratory Techniques: A contemporary Approach. Saunders Co. Filadelfia. 699 p. Brieger, G. 1970. Química Orgánica Moderna. Curso Práctico de Laboratorio Harper Rovc Pubs. Inc. New York, 243 p.
13
INFORME sesión 2. TITULO DE LA PRÁCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados 1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos de Punto de fusión: Sustancia
Punto de fusión *Tf (teórico) Tf (experimental)
Observaciones
Ac. Benzóico Glucosa Mezcla Glucosa-Benzóico Problema 1 Problema 2 Mezcla problema 1-2 *Buscar en bibliografía 2- Escribe en el siguiente cuadro tus datos obtenidos de Punto de ebullición: Sustancia
Punto de ebullición Observaciones *Tb (teórico) Tb (experimental)
Hexano Metanol Etanol Mezcla Metanol-etanol *Buscar en bibliografía 3.- Discute los resultados obtenidos en tu experimento con los datos reportados en la bibliografía, explica las diferencias o semejanzas. 4.- Para el caso de las muestras problema, en el punto de fusión, explica a que se deben los valores obtenidos. 5.- Para el caso de las muestras problema, en el punto de ebullición, explica a que se deben los valores obtenidos.
14
3.- Operaciones básicas de separación de sustancias químicas para la obtención de productos naturales OBJETIVO El alumno utilizará las técnicas de filtración, decantación y cristalización para la separación de un principio activo de un fármaco comercial. Y aplicará las técnicas de separación; destilación por arrastre con vapor y extracción continua con disolventes orgánicos (en Soxhlet y a reflujo) para aislar el aceite esencial de un producto natural. INTRODUCCIÓN: a) Procedimientos físicos. La decantación, la filtración y la centrifugación son procedimientos físicos de separación de sustancias químicas que permiten la separación de algún producto sólido que se encuentra mezclado con algún líquido. Decantación: Cuando en una solución, una sustancia sólida se precipita o es depositado en el fondo del recipiente, el líquido puede retirarse cuidadosamente inclinando ligeramente el recipiente y llevando la fase líquida a otro recipiente, de tal forma que se logre la separación de las dos fases, a este proceso se le llama decantación. Cuando se tienen dos líquidos inmiscibles que forman 2 fases se utiliza un embudo de separación para realizar la separación de fases. Filtración: El proceso de filtración consiste en separar una sustancia sólida que no precipita y por tanto se encuentra suspendida en el seno del líquido, para ello se utiliza un filtro que generalmente es de papel y con ayuda de un embudo normal se vierte el líquido sobre el papel filtro previamente colocado sobre el embudo y el líquido es obtenido en un recipiente limpio. También puede utilizarse vacío para realizar la filtración, y generalmente se requiere un embudo Büchner, el cual se coloca sobre un matraz Kitazato. Se coloca un círculo de papel filtro (de poro adecuado a lo que se va a filtrar) en la base del embudo, el cual debe de quedar perfectamente ajustado, de tal forma que cubra todos los orificios del embudo. Se humedece el papel con un poco del líquido de la mezcla que va a ser filtrada. Se enciende el sistema de succión (de agua o bomba para vacío). Se agrega la mezcla a ser filtrada. Después que ha pasado todo el líquido a través del embudo al matraz, se apaga el sistema de vacío y se desconecta. Centrifugación: Una centrífuga es un equipo que es capaz de aplicar una fuerza centrífuga sostenida, esto es, la fuerza generada a través de la rotación. La presencia de una fuerza que tiende hacia una dirección exterior siempre que una masa cambia su dirección, fue demostrada por Sir Isaac Newton en el siglo XVII, quien mostró en sus leyes del movimiento, que cuando un cuerpo moviéndose libremente en una línea recta, cambia y es dirigido en una curva, a través de una cuerda por ejemplo, entonces el cuerpo ejercerá una fuerza exterior en contra de la cuerda. La intensidad de esta fuerza puede ser incrementada, aumentando: a) la velocidad de rotación, b) la masa del cuerpo, c) el radio o la distancia del cuerpo al centro de la curva. Por lo tanto, incrementando la masa o el radio, se intensifica la fuerza centrífuga proporcionalmente, pero aumentando la velocidad de rotación se incrementa en proporción al cuadrado de la velocidad. La fuerza centrífuga se expresa por la 2 relación básica de: F = m ⋅ v que equivale a F = 4π 2 ⋅ m ⋅ n 2 ⋅ R , donde F = fuerza centrífuga m = R masa, R = radio, v = la velocidad y n = el número de revoluciones por segundo. La fuerza centrífuga 15
es expresada como un múltiplo de g (aceleración debida a la gravedad). Con las centrífugas de laboratorio se pueden generar campos centrífugos de 1x 109 g. En los procesos de separación de productos secundarios se utiliza para la concentración y purificación de materiales en suspensión, disueltos en fluidos. Cristalización. Es la técnica más simple y eficaz para purificar compuestos orgánicos sólidos. Consiste en la disolución de un sólido impuro en la menor cantidad posible del disolvente adecuado en caliente. En estas condiciones se genera una disolución saturada que al enfriar se sobresatura produciéndose la cristalización. El proceso de cristalización es un proceso dinámico, de manera que las moléculas que están en la disolución están en equilibrio con las que forman parte de la red cristalina. El elevado grado de ordenación de una red cristalina excluye la participación de impurezas en la misma. Para ello, es conveniente que el proceso de enfriamiento se produzca lentamente de modo que los cristales se formen poco a poco y el lento crecimiento de la red cristalina excluya las impurezas. Si el enfriamiento de la disolución es muy rápido las impurezas pueden quedar atrapadas en la red cristalina. Para la cristalización de debe de considerar lo siguiente: 1) Deberá disolver al compuesto en caliente y no en frío; 2) Las impurezas deben ser completamente solubles o insolubles en el disolvente; 3) No deberá reaccionar con el material por purificar. Destilación: a) Destilación simple La destilación es un método comúnmente usado en la separación y purificación de líquidos. Esencialmente consiste en la vaporización de la sustancia seguida por la condensación de vapores y recolecta de ellos en otro recipiente. Diferentes tipos de destilación se usan dependiendo de los compuestos a separar. Un aparato de destilación simple se usa para destilar una sola sustancia o para separar líquidos con un intervalo amplio en el punto de ebullición. La mezcla por separar se coloca en el matraz de destilación al que previamente se le han colocado perlas de ebullición o pequeños trozos de tezontle lavados y secados en la estufa a 100 ºC, se ensambla el aparato (como indica la figura) y se procede a calentar el matraz; el componente más volátil hierve primero y más rápidamente; consecuentemente los vapores de la mezcla son más ricos en este componente, que al pasar por el refrigerante, se condensan y recolectan. Cuando disminuye la proporción de este componente en la mezcla, el vapor se enriquece con el componente menos volátil; la temperatura del termómetro se incrementa y se utiliza otro matraz para recolectar este componente.
Figura 1. Equipo de destilación simple b) Destilación fraccionada 16
En cuando los componentes de la mezcla líquida tienen puntos de ebullición cercanos, se utiliza una la destilación fraccionada, un columna de fraccionamiento se empaca con un material inerte (perlas de vidrio, fibra de vidrio o acero etc.) y se coloca en forma vertical al refrigerante, (ver figura 2). El calentamiento de la mezcla en e matraz causa que los vapores ricos en el componente más volátil pasen a través de la columna de fraccionamiento, el vapor al tocar el material de relleno frío, se condensa y regresa hasta que toca una parte de la columna que ha elevado su temperatura, entonces vuelve a re-evaporizarse. El nuevo vapor es más rico en el componente menos volátil. Este proceso de condensación-revaporización se efectuará varias veces a lo largo de la columna y se condensa en el refrigerante. Se observa que una destilación fraccionada es equivalente a varias destilaciones simples.
Figura 2. Aparato de destilación fraccionada c) Destilación a presión reducida Muchos de los productos naturales no pueden ser destilados a presión atmosférica debido a que se descomponen al acercarse a su punto de ebullición. Este problema puede ser resuelto a través de una destilación a baja presión ya que con ello se evita la descomposición de la muestra. La presión de vapor de cualquier sustancia es una función directa de la temperatura, así, al disminuir la presión dentro del aparato de destilación se abatirá el punto de ebullición. La destilación a presión reducida puede realizarse con el rotaevaporador o bien con un equipo para destilación adaptado a una bomba de vacío. d) Destilación por arrastre de vapor La destilación por arrastre con vapor es una técnica que se emplea para separar sustancias que son insolubles en agua y volátiles, de otras sustancias no volátiles. Es una técnica aplicada en la separación de sustancias poco solubles en agua. La destilación por arrastre de vapor se emplea para separar una sustancia de una mezcla que posee un punto de ebullición muy alto y que se descomponen al destilar. También se emplea para purificar sustancias contaminadas por grandes cantidades de impurezas resinosas y para separar disolventes de alto punto de ebullición de sólidos que no se arrastran. Este tipo de destilación se emplea principalmente para la separación de aceites esenciales (ver figura 3).
17
Figura 3. Aparato para destilación por arrastre de vapor d) Extracción contínua en Soxhlet Esta forma de separación de metabolitos secundarios no es propiamente una destilación pero implica el calentamiento de un solvente de tal forma que entre en contacto con el material biológico repetidas veces y permite la extracción de sustancias de interés una vez que el solvente que esta en contacto con el material biológico ya no presenta coloración, se considera que se ha llevado a cabo la extracción total y se termina el proceso, en la figura 4 se muestra el equipo Soxhlet.
Figura 4. Aparato Soxhlet para extracción de componentes orgánicos
18
REACTIVOS Y DISOLVENTES: Acetona, pastillas de ibuprofeno, hojas de eucalipto, u hojas de te de limón, o canela (alumnos), piedras de ebullición, acetato de etilo, Papel aluminio sulfato de de sodio anhidro, Papel filtro. Materiales y equipo 1 Cristalizador 1 Vaso de precipitados de 50 mL 2 Parrillas eléctricas 1 Equipo para determinar el punto de fusión 1 Termómetro 1 Equipo Soxhet 1 Equipo para destilación a presión reducida o rotavapor 1 Equipo de destilación por arrastre con vapor 1 Equipo de destilación simple 3 Matraces Erlenmeyer de 25 mL 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL
2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL 1 Probeta graduada de 25ML 1 Probeta graduada de 100 mL 2 Pipetas Pasteur con bulbo 1 Bomba para vacío Mechero Bunsen 3 Embudo de separación 2 Frasquito con tapa 1 Embudo de tallo recto 1 Matraz bola de 250 mL Piedras de ebullición 1 Embudo de tallo corto 1 Espátula
PROCEDIMIENTO CRISTALIZACIÓN Para la cristalización de sustancias orgánicas se hace lo siguiente: el sólido impuro se disuelve en la mínima cantidad de disolvente caliente. Las impurezas insolubles se eliminan por filtración de la solución caliente. Se deja enfriar la solución lentamente a temperatura ambiente y luego en un baño de hielo o en el refrigerador. En este lapso el material purificado se separa como cristales mientras que las impurezas solubles permanecen en solución. Los cristales purificados se colectan por filtración. Cuando hay trazas de contaminantes coloridos, se eliminan añadiendo carbón activado a la solución caliente antes de filtrar. Para llevar a cabo la cristalización de la sustancia activa del fármaco se realizará el procedimiento indicado en la práctica anterior y que se describe a continuación, utilizando paracetamol en lugar de ibuprofeno: 1. Pesar 1 tableta de fármaco comercial y calcular la cantidad equivalente a 0,5 g de paracetamol. 2. Triturar en un mortero las tabletas necesarias, pesar la cantidad equivalente antes calculada de material pulverizado, guardar cantidad sobrante para determinar punto de fusión, disolver el equivalente a los 0.5 g de paracetamol en 10-20 mL de etanol agitar y filtrar, evaporar el filtrado hasta sequedad calentando en baño maría. Cristalizar el residuo con 10 mL de acetona, separar los cristales, dejar secar al aire y utilizar el residuo como sustancia problema, determinarle el punto de fusión a la pastilla completa (sustancia problema 1-2), al residuo del papel filtro (sustancia problema 2) y a los cristales obtenidos (sustancia problema 1).Determine el punto de fusión del compuesto impuro y del recristalizado. DESTILACIÓN: a).- Por Arrastre de vapor. Montar el aparato de destilación por arrastre de vapor, de acuerdo a al figura 3, colocar 700 mL de agua destilada en el matraz no. 1: generador de vapor y agregue cuerpos de ebullición. En el matraz no. 2 coloque 65 g del hojas cortadas en trozos pequeños o la cantidad 19
equivalente para que se cubran las 3/4 partes del matraz. Al tapar este matraz, cuide que la conexión de vidrio no se obstruya con los trozos del material biológico; pues de ser así, no habrá paso de la corriente de vapor. Caliente con el mechero el matraz no. 1 hasta ebullición, con el fin de generar el vapor que pasará al matraz no. 2, extrayéndose de esta manera el aceite esencial de material biológico utilizado; el cual es inmediatamente arrastrado por el vapor de agua en un proceso de codestilación. Suspenda el calentamiento cuando el volumen del destilado sea de 100 o 150 mL aproximadamente; de este codestilado, extraiga totalmente el aceite esencial, mediante extracciones con acetato de etilo en un embudo de separación, las fases acuosas se desechan y los extractos orgánicos se colectan en un matraz Erlenmeyer o vaso de precipitados, agregue entonces la cantidad necesaria de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua remanente. Elimine el disolvente con el rotavapor, determine el volumen obtenido y el rendimiento. Conservar la muestra obtenida en refrigeración perfectamente tapada. Con este extracto y los otros que obtenga de los siguientes experimentos, haga una cromatografía en capa fina (c.c.f.) para comparar resultados. b).- Extracción continua con equipo Soxhlet. Monte el equipo se la figura 4, en el matraz redondo de 500 mL coloque 300 mL de acetato de etilo. Llene el cartucho de celulosa con 6.5 g de té limón cortado en pequeños trozos y colóquelo en la cámara de extracción. Caliente cuidadosamente hasta la ebullición del acetato de etilo, cuyos vapores deberán condensarse en el refrigerante para caer sobre el material biológico, se considera que una gota por segundo es en el condensado es idónea para la extracción. En el momento en que la cámara de extracción se llena con el acetato de etilo, éste cae por diferencia de presiones al matraz. Este proceso se repite continuamente de tal manera que cada vez se extrae mayor cantidad del aceite esencial. El número de descargas del extracto puede variar en función de la cantidad y calidad de la muestra, suspenda el calentamiento cuando ya no observe coloración del destilado en la cámara de calentamiento, se dará por terminada la extracción. Al finalizar, desmonte el equipo, pase a un vaso de precipitados de 500 mL, por medio de decantación y filtración el extracto obtenido y séquelo con sulfato de sodio anhidro, decante el solvente, concentre a presión reducida con ayuda del rotavapor, hasta que ya no tenga solvente, colóquelo en un vial y utilícelo para la c.c.f. comparativa. c).- Extracción continua directa. Montar el equipo para destilación simple, con el refrigerante colocado en forma vertical, agregar en el matraz redondo de 500 mL, 300 mL de acetato de etilo y 65 g de té limón cortado en trozos, agregue cuerpos de ebullición. Caliente a reflujo durante 30 minutos para extraer el aceite esencial (el tiempo de reflujo empieza a partir de que cae la primera gota de disolvente condensado). Desmonte el equipo, decante y filtre el extracto obtenido. Séquelo con sulfato de sodio anhidro y decántelo en un matraz limpio y seco. Concentre a presión reducida con ayuda del rotavapor, dejando aproximadamente 5 mL del solvente concentrado. Colóquelo en un vial y utilícelo para la cromatografía en capa fina (c.c.p.) comparativa. RESIDUOS Y SU MANEJO Enfriar los trozos de material biológico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgánicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. REFERENCIAS: Enciclopedia Británica. 2002. Reino Unido Vol. 3. pp 31-33 Ávila, Z. J., García, C. M., Gavilán, I. C. G., León, F. C., Méndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodríguez, P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Química Orgánica. Experimentos con enfoque ecológico. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 622 p. Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988 20
Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Química Orgánica Experimental Alambra, Madrid, 1974. Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA, 1976 Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and Bacon, Inc. USA. 334p.
21
INFORME sesión 3. TITULO DE LA PRÁCTICA NOMBRE DE INTEGRANTES FECHA Resultados 1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos para el principio activo del fármaco trabajado Sustancia
Punto de fusión *Tf (teórico) Tf (experimental)
Observaciones Rendimiento
Paracetamol Excipientes Pastilla completa *Buscar en bibliografía 2.- Escribe en la siguiente tabla los datos de rendimiento obtenido al utilizar los tres métodos de obtención aceite esencial: Método
Punto de fusión g de material g aceite esencial
Rendimiento
Arrastre de vapor Extracción en Soxhet Extracción destilacion Con los tres tipos de extractos obtenidos realiza una cromatografía en capa fina y discute la calidad de los componentes obtenidos. CUESTIONARIO: 1. En una destilación a) ¿Cuál es la función de los cuerpos de ebullición? b) ¿Por qué no se debe poner más de la mitad del líquido en el matraz de destilación? c) ¿Por qué debe colocarse el bulbo del termómetro a la altura del brazo lateral de la T de destilación? d) En el refrigerante ¿Por qué entra el agua por abajo y sale por arriba? e) ¿Qué precauciones se deben tomar al destilar líquidos muy flamables y volátiles? 2. ¿En qué casos es conveniente aplicar la decantación para la separación de fases? 3. ¿Para qué casos aplicaría una filtración por gravedad y cuando es necesario aplicar una filtración por succión? 4. ¿Qué criterios aplicaría para seleccionar el poro del papel filtro que va a emplear en una filtración? 5. ¿Para qué caso(s) sustituiría la filtración por la centrifugación?
22
Práctica II.- SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS 2.1.- Cromatografía en capa fina y en papel.
OBJETIVOS: 1.- Determinar por cromatografía en capa fina (TLC por sus siglas en inglés: Thin Layer Chromatography) la composición de algunos medicamentos analgésicos para determinar los principios activos presentes. 2.- Determinar por cromatografía en papel y en capa fina los pigmentos presentes en los cloroplastos. INTRODUCCIÓN: La cromatografía en varias de sus modalidades (papel, capa fina, columna, etc.) es un método de separación y purificación de compuestos orgánicos que depende de la distribución de ellos en la fase estacionaria. Para efectuar una separación cromatográfica se requiere de una fase estacionaria sólida (material adsorbente como alúmina, gel de sílice, carbón o celulosa) y de una fase móvil (eluyente). Se elige el adecuado para efectuar la separación considerando las solubilidades relativas de los componentes de la mezcla. La muestra se aplica en el adsorbente (en la columna, placa o tira de papel) y luego se deja que pasen a través del adsorbente los componentes de la mezcla, que se desplazarán dependiendo de su solubilidad relativa en el eluyente y en el adsorbente. Aquellos que son más solubles y que son menos atraídos por la fase estacionaria se desplazarán más rápido, mientras que componentes insolubles quedan en el punto de aplicación. Para el caso del papel y placa fina, después del proceso se tiene como resultado un cromatograma en el cual los componentes separados se revelan, ya sea por su color inherente o por medio de un método físico o químico. La cromatografía generalmente se usa como un método cualitativo, pero también se puede usar para efectuar análisis cuantitativo. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Metanol, cloroformo, éter etílico, ácido acético, hexano, acetato de etilo, pastillas de analgésicos, cafeína, ácido acetilsalicílico, iburofeno, paracetamol, hojas de espinaca y acelga, Papel filtro, placas de sílica gel para cromatografía con indicador. Materiales y equipo 2 Vaso de precipitados de 50 mL 2 Pipetas Pasteur 1 mortero con pistilo 2 Vidros de reloj 4 tubos de ensaye de 10 mL 10 tubos de ensaye de 5 mL 1 Pipeta de 5 mL 1 Gradilla para tubo de ensaye 1 Pipeta 10 mL 1 Pipeta 1 mL
2 Sopote universal con anillo 2 Vial con tapa 4 Tubos capilares 2 Pinzas para tubo de ensaye 2 Embudo de tallo recto 1 Embudo de tallo corto 1 Espátula 1 Caja Petri de vidrio de 10-15 cm diam. 1 Lámpara de UV
23
PROCEDIMIENTO: 1.- CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (ANÁLISIS DE PASTILLAS DE ANALGÉSICOS) Los analgésicos comerciales tales como Aspirina, Gelocatil, Neobrufen, Dalsi, Apiretal, Frenadol, Termalgin etc. contienen uno o más de los siguientes principios activos: Acido acetilsalicílico, ibuprofeno, 4-acetamidofenol (paracetamol) y cafeína.
La presencia de alguna de estas moléculas se detectará por comparación con patrones de las sustancias puras. Cada equipo analizará dos pastillas distintas a las que denominará como X e Y, tomar aproximadamente una octava parte de una pastilla y triturarla bien con ayuda del mortero. Introducir el polvo obtenido en un vial. Añadir 1 mL de metanol, agitar con ayuda de una espátula durante un par de minutos y dejar reposar. En una placa de sílica gel de 2x5 cm trazar una línea a lápiz 0.5 cm por encima del borde inferior de la placa (figura 1).
Figura 1. Marcado y colocación de las muestras en la placa de sílica gel.
Sobre la línea hacer marcas equidistantes etiquetándolas X, A, C, I, P, según sea las sustancias disponibles. En cada una de esas marcas se agregará independientemente la siguientes substancias: X, el compuesto desconocido; y A, C, I, P las disoluciones patrón de Ácido acetilsalicílico, Cafeína, Ibuprofeno y Paracetamol respectivamente. Utilizar un capilar para realizar la colocación de la muestra, es importante limpiar el capilar después de cada muestra introduciéndolo en un vial con metanol y vaciando su contenido sobre un papel de filtro varias veces. En un vaso de precipitados de 50 mL (cámara cromatogáfica) agregar la Mezcla eluyente: Acetato de etilo: Hexano: Ácido acético, 80:20:1, teniendo cuidado que el nivel del eluyente en la cámara debe de ser menor que la distancia entre el borde inferior de la placa de cromatografía y la línea trazada con lápiz, introducir cuidadosamente la placa de sílica en el vaso de precipitados y taparlo con un vidrio de reloj. Una vez que el eluyente haya alcanzado casi el final de la placa, extraer la placa de la cubeta y trazar una línea con lápiz señalando el frente del eluyente. Dejar que el eluyente se evapore. Visualizar las manchas con la lámpara de luz ultravioleta (UV). Marcar los contornos de las manchas obtenidas con lápiz. Repetir la operación para la pastilla Y. Una vez analizadas ambas pastillas completar la tabla siguiente (pregunta al profesor los nombres comerciales de los analgésicos que has analizado) y calcula los Rf de las cuatro sustancias. 24
2.- CROMATOGRAFÍA EN PAPEL (ANÁLISIS DE PIGMENTOS DE CLOROPLASTOS) Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a (verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes proporciones. Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o más, dependiendo del material utilizado) que estarán más o menos alejados de la disolución alcohólica según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseerán diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución. Colocar en un mortero trozos de hojas de espinacas lavadas o acelgas por separado, quitando las nervaduras más gruesas, junto con 10 o 15 mL de éter etílico. Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa (utilizar campana de gases a lo largo de toda la práctica). Filtrar en un embudo con papel filtro y recoger en un tubo de ensayo (es suficiente con 2 o 3 mL. de solución de pigmentos). Colocar en un frasco de de vidrio metanol absoluto hasta una altura de 0.5 a 1.0 cm. Cortar una tira de papel de filtro para cromatografía, Whatman No. 3, de unos 8 cm de ancho y unos 10 a 15 cm de alto, poner con el capilar en el papel de cromatografía entre 5 y 10 gotas de solución de pigmentos, espaciadas en el tiempo con el fin de que vaya secándose el éter etílico y aumente la cantidad de pigmentos. Las gotas se pondrán siempre en el mismo punto (marcar con un lápiz), situado a 2 cm por encima del borde inferior del papel. Doblar el papel cromatográfico a lo largo y colocarlo en la placa de Petri con la mancha de pigmento a 1 cm. de la superficie del eluyente. Cuando el frente del solvente esté aproximadamente a 1 cm. del borde superior del papel filtro, retirar el papel y marcar el frente del solvente con lápiz. Determinar el Rf de cada mancha obtenida. También se deberá hacer una cromatografía en capa fina, siguiendo las instrucciones dadas en la primera parte de ésta práctica. RESIDUOS Y SU MANEJO Retirar los trozos de material biológico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgánicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. Residuos de los fármacos, dejar en el papel filtro y depositar en la basura. Minicolumnas utilizadas, dejar que se seque completamente la sílica gel y retirarla de la pipeta Pasteur, la cual deberá conservarse en un frasco de residuos para su posterior limpieza. Las pipetas Pasteur pueden se lavan para utilizarse posteriormente. REFERENCIAS: Enciclopedia Británica. 2002. Reino Unido Vol. 3. pp 31-33 Ávila, Z. J., García, C. M., Gavilán, I. C. G., León, F. C., Méndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodríguez, P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Química Orgánica. Experimentos con enfoque ecológico. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 622 p. Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988 Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Química Orgánica Experimental Alambra, Madrid, 1974. Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA, 1976 Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and Bacon, Inc. USA. 334p. 25
INFORME sesión 4. TITULO DE LA PRÁCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados 1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos para el principio activo del fármaco trabajado Sustancia *teórico
RF experimental
Observaciones
Muestra X Muestra Y Paracetamol Ibuprofeno Cafeína Acetilsalicílico *Buscar en bibliografía De acuerdo con los valores de Rf obtenidos y el número y tipo de manchas, discute tus resultados. 2.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los pigmentos detectados para hojas de espinaca y de acelga, da los valores de Rf. Pigmento
Color del pigmento Espinaca Acelga
Valor de Rf
De acuerdo al tipo de machas obtenido y a los valores de Rf, discute tus resultados. CUESTIONARIO: 1. La solubilidad en alcohol de los pigmentos es de mayor a menor: carotenos, clorofila a, clorofila b y xantofila. Indicar qué pigmento corresponde a cada banda. 2. ¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila? 3. ¿Qué pigmentos son los más abundantes? 4. Por encima de las clorofilas aparece más de una banda, ¿qué significado tiene?
26
2.
SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS
2.2.- Cromatografía en columna
La cromatografía en columna (CC) es el método más utilizado para la separación y purificación de compuestos orgánicos, sólidos o líquidos, a escala preparativa. La fase estacionaria (adsorbente) se coloca en una columna de vidrio que termina en un estrechamiento con una llave y se impregna con el eluyente (fase móvil). La mezcla a separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase móvil atraviesa el sistema (Figura 3). Los compuestos se van eluyendo disueltos en el eluyente, se van recogiendo ordenadamente en fracciones de pequeño volumen (1,2,.....) y se analizan por cromatografía en capa fina (CCF). Los productos van saliendo de la columna según su polaridad, primero salen los menos polares que son los menos retenidos por el adsorbente y los últimos los más polares por su mayor retención en la fase estacionaria. El adsorbente más utilizado para este tipo de cromatografía es gel de sílice y en segundo lugar la alúmina. El tamaño de partícula del adsorbente es importante para la separación y su elección depende en gran medida de que la elución de la cromatografía se realice por gravedad o a media presión (flash chromatography). En una elución a media presión se pueden emplear tamaños de partícula más pequeños, que permiten una separación más eficaz. Sin embargo, en una elución por gravedad el uso de tamaños de partícula pequeños impediría el flujo del disolvente. Antes de realizar una separación en cromatografía de columna hay que elegir adecuadamente el disolvente haciendo ensayos en CCF.
Figura 3. Montaje de una columna cromatográfica PROCEDIMIENTO: 4.- CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (OBTENCIÓN DE CAROTENOIDES Y PIGMENTOS) Separación de carotenoides Pesar 1.0 g de chile guajillo seco, eliminando las semillas, cortarlo en trozos pequeños y agregar 10 mL de una mezcla de tolueno-éter de petróleo 1:1; macerar en el mortero y dejar reposar por 10 minutos; decantar el extracto orgánico y concentrar en baño María hasta un volumen de 1 mL (en campana de extracción). Durante el periodo de reposo de la muestra empacar la columna. Para la preparación de la columna: se toma una una columna de vidrio de 20 cm de longitud por 1.5 cm de diámetro (en caso extremo se puede sustituir por una bureta), se sujeta en el soporte con las pinzas. Se revisa que la llave y funcione correctamente (que no halla fugas) y se mantiene en posición de 27
cerrado. Se introduce hasta el fondo un pequeño trozo de algodón ayudándose con la varilla de vidrio, se agregan 3 mL de la mezcla eluyente (Tolueno-éter de petróleo, 1:1), se presiona suavemente el algodón para que quede bien colocado y sin burbujas, se prepara una suspensión de 8 g de gel de Sílice 60, 63-200 micras en 50 ó 60 ml de mezcla eluyente y se agita durante 5 minutos para eliminar las burbujas. A través del embudo se vierte la suspensión en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme. Se abre la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la gel de Sílice. Se podría haber empaquetado en seco, pero teniendo cuidado de que no queden espacios vacíos, y luego pasarle disolvente. Abriendo la llave de paso al mismo tiempo; dejar que pase el eluyente hasta que quede un nivel de 1 mL arriba del adsorbente, cerrar la llave y agregar el extracto de Capsicum con ayuda de pipeta Pasteur. Abrir la llave y drenar la columna con Tolueno-éter de petróleo (1:1). Observar la separación de los pigmentos a medida que se eluye la columna, y recolectarlos en tubos de ensayo o matraces Erlenmeyer de 25 mL para su posterior análisis cromatográfico. La separación del extracto también se puede hacer por cromatografía en capa fina, usando en este caso una placa de silica gel de 20 x 20, se aplica el extracto en forma de banda Hacer el mismo procedimiento en otra columna utilizando los extractos de espinaca o acelga obtenidos en la sesión práctica anterior. Debes de re-disolver previamente tu extracto seco en éter etílico. Análisis cromatográfico. Una vez que se tiene las fracciones de cada columna, se corren cromatografías en capa fina para identificar los componentes obtenidos, se determinan los valore de Rf. RESIDUOS Y SU MANEJO Retirar los trozos de material biológico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgánicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. Sílica gel. Se retira de la columna empleando una corriente de aire y recibiéndolas sobre una toalla de papel se depositan en el recipiente de los residuos de soportes cromatográficos para su posterior limpieza. Extractos vegetales obtenidos. Se agrega un poco de la mezcla eluyente a los tubos que los contienen y se depositan en frascos etiquetados. Serán utilizados en otras prácticas. REFERENCIAS: Ávila, Z. J., García, C. M., Gavilán, I. C. G., León, F. C., Méndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodríguez, P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Química Orgánica. Experimentos con enfoque ecológico. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 622 p. Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and Bacon, Inc. USA. 334p. Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Química Orgánica Experimental Alambra, Madrid, 1974. Elder, J.W., Abbruzzese, J., Murray, J. y Zielski, M. 1976. Separation of Paprika pigments J. Chem. Ed. 53 (1): 43. 28
Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA, 1976 Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988
29
INFORME sesión 5. TITULO DE LA PRÁCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados 1.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los pigmentos y caraotenoides detectados para hojas de espinaca y de acelga, da los valores de Rf. Pigmento
Color del pigmento Carotenoide Espinaca o Acelga
Valor de Rf
Menciona el número de fracciones obtenidas tanto para el guajillo como para la espinaca o acelga, según corresponda. De acuerdo al tipo de machas obtenido y a los valores de Rf, discute tus resultados. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué ventajas tienen las separaciones cromatográficas (cromatografía en capa fina y columna) comparadas con otros métodos de separación y cuáles son sus desventajas? 2. ¿En que otras fuentes se pueden encontrar carotenoides además de las plantas superiores ¿Cuál es su función en el cuerpo humano?
30
Practica III.- ANÁLISIS PRELIMINAR FITOQUÍMICO DE PLANTAS MEDICINALES Y HONGOS 3.1.- Preliminar fitoquímico
OBJETIVOS 1.- Realizar el análisis cualitativo de las sustancias químicas que se obtienen a partir de vegetales y cuerpos fructíferos de macromicetos. 2.- Identificar los principales metabolitos secundarios presentes en plantas y hongos. INTRODUCCIÓN Este análisis se efectúa para determinar los principales grupos de metabolitos presentes en plantas y hongos, los extractos obtenidos se ponen en contacto con diferentes reactivos químicos y se observan las reacciones de coloración y/o precipitación que se obtengan y a partir de ellas se determina la presencia o ausencia de los diferentes metabolitos. Como ciencia, la fitoquímica estudia multitud de compuestos químicos que se encuentran en la complejidad de las células vegetales, pero no sólo como entidades químicas, sino también como productos de una serie de mecanismos que intervienen en su biogénesis, es decir que aporta elementos importantes para el estudio de la relación entre estructura química y la acción fisiológica de los metabolitos secundarios. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Metanol, cloroformo, éter etílico, éter de petróleo, tolueno, placas de sílica gel para cromatografía, placas de sílica gel con indicador. Materiales y equipo Matraz fondo plano de 250 mL Refrigerante 1 mortero con pistilo 20 tubos de ensaye de 10-15 mL 1 Gradilla para tubo de ensaye 1 Pipeta de 5 mL 1 Pipeta 10 mL 1 Pipeta 1 mL 1 Baño María 1 Varillas de vidrio
2 Pipetas Pasteur 1 Parrilla 2 Sopote universal con anillo 2 Viales con tapa 4 Tubos capilares 2 Pinzas de tres dedos 2 Embudo de tallo corto 1 Espátula 1 Lámpara de UV
PROCEDIMIENTO 25 g de muestra o material biológico seco y molido (pueden ser hojas, corteza, semilla, etc deuna planta o un cuerpo fructífero de champiñón, portobello u otro hongo) se colocan en un matraz de fondo plano de 250 a 500 mL, se le agrega etanol procurando que cubra máximo 2/3 partes de su volumen (no olvidar agregar perlas de ebullición). Se extrae por reflujo durante media hora. El extracto etanólico obtenido después de filtrar, se concentra en baño María. El residuo semisólido se usa para los siguientes ensayos: Alcaloides. 31
Se tomar una porción del extracto y adicionar entre 5 mL a 10 mL de ácido clorhídrico al 10%, calentar a ebullición por cinco minutos, se enfriar y filtrar. Posteriormente dividir el filtrado en 3 tubos de ensaye, uno de los cuales servirá como testigo. Tubo 1. Se adiciona una gota del reactivo Dragendorff, la prueba se considera positiva si se forma un precipitado naranja. Tubo 2. Se adiciona una gota del reactivo Sonneschain la prueba se considera positiva si se forma un precipitado naranja. Flavonoides. Se disolver 0.5 mL del extracto en 2mL de etanol absoluto y dividir en tres tubos. El tercero será el testigo. 1) Reacción de Shinoda. Adicionar 2 gotas de ácido clorhídrico concentrado, si se obtiene una coloración roja indica la presencia de auronas o chalconas. En caso de haber cambio, se colocar un trozo de magnesio metálico, si se forma una coloración naranja a rojo, indica la presencia de flavonas; si es rojo flavonoles y si es magenta flavononas. 2) Reacción de hidróxido de sodio al 10%. Se adicionan 3 gotas de hidróxido de sodio si se forma una coloración de amarillo a rojo, indica la presencia de xantonas y flavonas; de café a naranja de flavonoles; de púrpura a rojizo de chalconas y azul de antocianinas. Glicosidos Cianogenicos. En un tubo de ensaye con 0.5 mL de extracto, se adicionar 1 mL de ácido clorhídrico al 10% y 1 mL de cloroformo. Calentar el tubo en baño María colocando en la boca del tubo una tira de papel filtro impregnado con reactivo de Grignard. La formación de una mancha rosa a rojo indica prueba positiva. Azucares Reductores. Se tomaron 2 mL del extracto, midiendo el pH y adicionando hidróxido de sodio al 10% (si es necesario) hasta tener un pH de 11. Dividir el extracto en dos tubos de ensaye para las siguientes pruebas. 1) Reacción de Fehling. Se adicionan 0.5 mL de solución Fehling A y 0.5 mL de solución Fehling B y 1 mL de agua destilada. 2) Reacción de Benedict. Se adicionan 0.5 mL de reactivo Benedict y 1 mL de agua destilada. Se preparar un blanco para cada tubo, sin extracto. Se colocar los cuatro tubos en baño maría por 15 minutos. Cuando hay azúcares en los tubos que contienen el extracto se forma un precipitado de color naranja a rojo. Saponinas. Prueba de altura y estabilidad de espuma. En un tubo de ensaye se colocar 1 mL de extracto, agitar vigorosamente y se tomar la altura de la espuma, en caso de que se presentara. Se considera positivo si la espuma alcanza un altura de 8 mm a 10 mm y se mantenía estable por 30 minutos. Reacción de Lieberman Bouchard. Se concentran 0.5 mL de extracto hasta 0.2 mL; después se agregan 2 gotas de acético anhídro y se estratifica con 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. Al formarse una coloración azul o verde en la interfase, hay presencia de saponinas esteroidales; si la coloración es rosa, rojo, magenta o violeta habrá presencia de saponinas triterpenoides. Reacción de Rosenthaler. A otra porción del extracto concentrado, adicionar dos gotas del reactivo Rosenthaler y estratificando con dos gotas de ácido sulfúrico concentrado. Si se forma coloración violeta, se considera positiva para saponinas triterpenoides.
32
Taninos. A 1 mL del extracto adicionar 2 mL de agua destilada y 3 gotas de cloruro de sodio al 2%, calentar a ebullición por un minuto, enfriando y filtrando. Dividir el filtrado en cuatro tubos de ensaye, el cuarto utilizar como testigo. Reacción con gelatina. Adicionar 2 gotas de reactivo de gelatina. La formación de un precipitado blanco indica presencia de taninos. Reacción de Cloruro férrico. Se adiciona una gota de cloruro férrico al 1%, la formación de coloraciones de azul a negro indica la presencia de derivados del ácido gálico y coloraciones verdes de derivados del catecol. Al tercer tubo, se agrega una gota de ferricianuro de potasio al 1%. La formación de una coloración azul, indica la presencia de compuestos fenólicos. Quinonas. Se colocan 2 mL del extracto en una cápsula de porcelana y se concentra a sequedad, posterior a ello se divide el extracto siruposo en tres porciones. Reacción de hidróxido de amonio. Se adiciona una gota de hidróxido de amonio concentrado al extracto. Se considera positiva la prueba para antraquinonas al tener la presencia de una coloración roja que aparece en los dos primeros minutos. Reacción con ácido sulfúrico. Se agrega 1 gota de ácido sulfúrico concentrado a otra porción del extracto. La formación de una coloración roja indica la presencia de antraquinonas. Reacción de Börntraguer. Se diluye una porción del extracto con 3 mL de agua destilada, se filtra, al líquido filtrado, se le añaden 3 mL de hidróxido de potasio al 5%; calentando a ebullición por 3 minutos, enfriando y realizando una extracción con 3 mL de cloroformo. Se elimina la fase acuosa y a la fracción clorofórmica se le adicionan 2mL de hidróxido de potasio al 5%. Un color rojo indica la presencia de benzoquinonas; si es amarillo verdoso, adicionar 1 gota de peróxido de hidrógeno al 6%. Si la coloración cambia a roja, se consideró positiva para derivados de antrona. Cumarinas. Reacción de Erlich. Se colocan 0.5 mL de extracto en una cápsula de porcelana, se concentra y se agregan dos gotas de Reactivo Erlich y una gota de ácido clorhídrico concentrado. La coloración naranja, indicó presencia de cumarinas. Reacción con hidróxido de amonio. Se concentra otra porción del extracto y se le adicionan 0.5 mL de etanol y dos gotas de hidróxido de amonio concentrado. Se considera positiva la prueba si se presenta una fluorescencia azul-violeta. Glicosidos Cardiacos. Se transfieren 2 mL del extracto a una cápsula de porcelana y se concentran a la tercera parte de su volumen original. Se divide en tres porciones en una placa de porcelana con muescas. Reacción de Legal. Se deja evaporar el disolvente y se adicionan 2 o 3 gotas de piridina, se agrega una gota de nitroprusiato de sodio al 5% y 4 gotas de hidróxido de potasio, una coloración roja poco estable indica la presencia de glucósidos cardiacos. Reacción de Baljet. Se adicionan 3 gotas del reactivo Baljet. Una coloración de naranja a rojo obscuro indica presencia de glucósidos cardiacos. Sesquiterpenlactonas. Reacción con Hidroximato férrico. Se agrega una porción del extracto a una cápsula de porcelana, se le adicionan dos gotas de clorhidrato de hidroxilamina 2 N y una gota de hidróxido de potasio 2 N en metanol. Calentar la mezcla a ebullición de 1 a 2 minutos, enfriar y se llevar a pH de 1 con ácido 33
clorhídrico 0.5 N. Se adiciona una gota de cloruro férrico 1%. Las coloraciones roja, violeta o rosa indican que la prueba es positiva para este metabolito. Con los extractos etanólicos obtenidos hacer por duplicado una cromatografía en capa fina y revelar primero una de las placas con luz ultravioleta y la otra con sulfato cérico amioniacal. Identificar las manchas obtenidos y calcular el Rf correspondiente. RESIDUOS Y SU MANEJO Retirar los trozos de material biológico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgánicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. Extractos vegetales obtenidos. Se agrega un poco de la mezcla eluyente a los tubos que los contienen y se depositan en frascos etiquetados. Serán utilizados en otras prácticas. REFERENCIAS: Ávila, Z. J., García, C. M., Gavilán, I. C. G., León, F. C., Méndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodríguez, P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Química Orgánica. Experimentos con enfoque ecológico. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 622 p. Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and Bacon, Inc. USA. 334p. Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Química Orgánica Experimental Alambra, Madrid, 1974. Elder, J.W., Abbruzzese, J., Murray, J. y Zielski, M. 1976. Separation of Paprika pigments J. Chem. Ed. 53 (1): 43. Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA, 1976 Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988
34
Apéndice 1: Preparación de reactivos que se utilizaron durante la realización del análisis fitoquímico preliminar. REACTIVO DE WARNER: 1.27g de Yoduro de Potasio aforado a 100mL de agua destilada. CLORURO FERRICO: Sol. al 1% 0.5g de Cloruro Ferrico aforado a 50mL de agua destilada. REACTIVO DE GELATINA: 0.5g de grenetina pura aforado a 50mL de agua destilada. REACTIVO DE BENEDICT: 8.65g de Citrato de Sodio + 5g de Na2CO3 anh. en 30mL de agua destilada se añadió lentamente y agitando + 0.865 CuSO4 en 7.5mL de agua y se afora a 50mL. REACTIVO DE FEHLING: Sol. A: 3.5g de CuSO4 5H2O aforado a 50mL de agua destilada. Sol. B: 17.5g de tartrato de sodio y potasio + 5g de NaOH aforado a 50mL de agua. HIDROXIDO DE SODIO 5%: 2.5g de Hidróxido de Sódio aforado a 50mL de agua destilada. HIDROXIDO DE SODIO 10%: 5g de Hidróxido de sódio aforado a 50mL de agua de agua destilada. REACTIVO DE EHRLICH: 15 mL de Ácido Clorhídrico concentrado, 25mL de agua destilada, 25 mL de etanol al 95% y 1g de para-dimetilaminobenzaldehido. REACTIVO DE MAYER: 0.1355 g de Cloruro de Mercurio y 2.5 g de Yoduro de Potasio en agua. Aforada a 50 mL. REACTIVO DE ROSENTHALER: 0.5 g de vainillina a 50 mL con etanol. REACTIVO DE GRIGNARD: 0.5g de Carbonato de sodio + 50 mg de Ácido pícrico y agua hasta 50 mL. HIDROXIDO DE POTASIO 2N: 2.8 g de Hidróxido de potasio en 50 mL de agua destilada. HIDROXIDO DE POTASIO AL 5 %: 2.5g de hidróxido de potasio a 50 mL de agua destilada. FERROCIANURO DE POTASIO AL 1%: 0.5g de Ferrocianuro de potasio en 50 mL de agua destilada. CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA 2N: 1.7375 g en 50 mL de agua destilada. REACTIVO DE SONNESCHAIN: Sol. Saturada de Molibdato de amonio en agua se añade lentamente a una sol. saturada de fosfato disódico a 40º C. se forma un precipitado, este precipitado se lava con agua y se pasa a un vaso donde se agrega una solución concentrada de carbonato de calcio (puede ser al 40%). NOTA: Se agregan 2.2g de Molibdato de amonio, 1.4g de Fosfato disódico y 20g de carbonato de calcio.
35
INFORME sesión 6 TITULO DE LA PRÁCTICA. NOMBRE DE INTEGRANTES FECHA Resultados 1.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los metabolitos secundarios detectados para el material biológico trabajado Material
Metabolito
PRUEBA REALIZADA
Para cada metabolito indicar las pruebas que se realizaron y marcar con + presencia y - ausencia Haz una tabla en la que indiques los valores de Rf obtenidos para los extractos trabajados. CUESTIONARIO: 1. Escribe cuales son las principales reacciones químicas y el mecanismo de reacción de las mismas, que se presentan en la detección de los metabolitos secundarios que identificaste en el práctica. 2. Una vez detectados los metabolitos secundarios que otros métodos utilizarías para realizar el aislamiento y purificación de los mismos y como determinarías su estructura química?, describe por lo menos tres métodos a emplear.
36
Practica III.- ANÁLISIS PRELIMINAR FITOQUÍMICO DE PLANTAS MEDICINALES Y HONGOS 3.2.- Análisis espectroscópico infrarrojo y resonancia magnética
OBJETIVO El alumno obtendrá los espectros de IR y 1HRMN de extractos y sustancias puras y utilizará dichos espectros para caracterizar las substancias trabajadas. INTRODUCCIÓN: Espectroscopia Infrarroja (IR). El espectro Infrarrojo (IR) de la mayoría de los compuestos orgánicos puede dividirse en dos partes: la banda de vibración, de sustituibles específicos entre 1350 y 4000 cm-1 y las bandas de vibración del esqueleto hidrocarbonado (C-C y C-H) entre 650 y 1400 cm-1. Aunque algunas bandas en la zona de números de onda bajos pueden correlacionarse con grupos específicos (por ejemplo: C-0 entre 1100 y 1250 cm-1, CH de distintos tipos), estos suelen ser menos sensibles a cambios en el entorno de la molécula. Esta zona (de la impresión digital) se utiliza en general para comparar compuestos. En el análisis estructural la zona entre 1400 y 4000 cm-1 es de gran utilidad, así las bandas entre 1650 y 1800 cm-1 indican C=O y en estos últimos, según el valor exacto puede referirse al tipo de grupo funcional del que forma parte el carbonilo, sí se encuentra conjugado, etc. La presencia de dobles enlaces aislados o conjugados y de sistemas aromáticos, al igual que los distintos tipos de sustitución sobre anillos bencénicos, constituye información importante que también puede obtenerse a partir del espectro de IR. Resonancia Nuclear Magnética (RMN, por sus siglas en inglés). La espectroscopia RNM, es aplicable a una variedad de problemas químicos y bioquímicos. Las ventajas principales del método son su naturaleza no destructiva y el hecho de que en muchos casos la información obtenida permite la asignación inequívoca de la estructura de un compuesto ya que a diferencia de los métodos anteriores, cada señal obtenida puede ser asignada en general a un núcleo (o grupos de núcleos) de la molécula. Sí bien en un principio la mayoría de los estudios de RNM versaron sobre el 1H por su elevada abundancia natural (99.9 %), sensibilidad sólo superada por 3H y por poseer spín, los instrumentos modernos que funcionan por el sistema de pulsos y transformadas de Fourier han permitido extender este método a la observación de cualquier núcleo cuyo spín, sea distinto de cero. Desde el punto de vista de la determinación estructural de productos naturales, los núcleos generalmente observados son aquellos más comunes en los compuestos orgánicos es decir 1H y 13C (este último con una abundancia en la naturaleza de 1.1%) ambos de spin 1/2. Un espectro RMN brinda especialmente la siguiente información: 1. La posición de señal (su desplazamiento químico) que indica las características del entorno que rodea al núcleo en cuestión. 2.La estructura fina (dada por el acoplamiento spin-spin) que provee información sobre la relación espacial y el número de núcleos acíclicos con spin distinto de cero. 3.El área de la señal que es proporcional al número de núcleos que constituyen dicha señal.
REACTIVOS Y DISOLVENTES: Acetona, cloroformo, ibuprofeno, paracetamol, extractos de eucalipto, carotenoides, cloroplastos, cloroformo deuterado, DMSO deuterado, agua deuterada. Hojas blancas para impresión (alumno). 37
Materiales y equipo 5 Tubos para resonancia 1 Vaso de precipitados de 50 mL
Espectrómetro de IR Espectrómetro de RMN
PROCEDIMIENTO. Espectro Infrarrojo: Tomar una fracción pequeña de cada compuesto puro y de cada extracto, disolverlo y agregar unas gotas en el aditamento ATR del espectrómetro de infrarrojo, ayudado del sofware obtener el espectro correspondiente para cada una de las sustancias. Conservar cada espectro obtenido para su posterior análsis. Espectro de resonancia. Disolver los compuestos puros y los extractos por separado en los disolventes deuterados y colocarlos en los tubos para reonancia respectivos, etiquetar cada tubo. Con ayuda del profesor y siguiendo sus indicaciones colocar los tubos en el equipo de resonancia y obtener el especto característico, conservar la impresión de cada espectro obtenido para realizar el análisis correspondiente. Retirar el tubo del equipo de resonancia y vaciar el contenido de cada uno de ellos en viales diferentes para su posterior uso. RESIDUOS Y SU MANEJO Debido a que las técnicas empleadas utilizan cantidades mínimas de disolventes, se dejan evaporar los disolventes en la campana de extracción. Extractos vegetales y compuestos puros obtenidos. Se colocan en viales etiquetados, se deja que se evapore el disolvente utilizado y se conservan para su utilización posterior. Serán utilizados en otras prácticas. REFERENCIAS: Pecsok R. L. y Shields L. D. 1973 Métodos Modernos de análisis químicos. Limusa. México. p, 487 Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988 Silverstein RM y Webster FX .Spectrometric Identification of Organic Compounds, , 6th ed. John Wiley & Sons Inc. 1998
38
INFORME sesión 7 TITULO DE LA PRÁCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados 1.- Fotocopiar e insertar los espectros de RMN obtenidos de compuestos puros y extractos. Con base en el análisis de los mismos hacer la asignación de protones para los compuestos puros y comparar con los datos bibliográficos (reportar un cuadro de datos con los valores obtenidos). 2.- Para los espectros de RMN de los extractos hacer lo mismo y sugerir los posible compuestos que se encuentran presentes en los extractos analizados. 3.- Para los espectros de infrarrojo obtenidos fotocopiarlos y presentarlos en este informe, después del análisis correspondiente, indicar los principales grupos funcionales que se encuentran presentes en los compuestos puros y complementar con el espectro de resonancia obtenido, comparar con datos bibliográficos. 4.- Con los espectros de IR de los extractos identificar los principales grupos funcionales e indicar de que posibles compuestos se trata (apoyarse con los espectros de resonancia obtenidos). CUESTIONARIO: 1. Escribe cuales son las principales ventajas y/o desventajas del usos de la resonancia magnética para la identificación de productos naturales. 2. Que otros estudios requerirías para caracterizar los compuestos trabajados, descríbelos.
39
Práctica IV. DETECCIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS EN TEJIDOS VEGETALES OBJETIVOS: 1.- Identificar a los ácidos fenólicos por reacciones cromogénicas específicas INTRODUCCIÓN: Los compuestos fenólicos incluyen un amplio grupo de substancias vegetales que poseen como característica común un anillo aromático que contiene uno o más sustituyentes hidroxilos. Como los compuestos fenólicos son todos aromáticos, muestran una intensa absorción en la región UV del espectro electromagnético. Los compuestos fenólicos tienden a ser solubles en agua, sin embargo frecuentemente en los organismos vivos se encuentran combinados con azúcares como glucósidos y por lo tanto generalmente están ubicados en las vacuolas de los vegetales. Tanto los fenoles libres como los ácidos fenólicos son considerados como grupo único ya que la mayoría de las veces se identifican juntos durante el análisis fotoquímico de las plantas. Los ácidos p-hidroxibenzóico, vainíllico y siríngico se encuentran usualmente presentes en las angiospermas, sin embargo, en las gimnospermas se ha indicado que el ácido siríngico está ausente. Otros ácidos como el salicílico o el o-protocatecuíco son característicos de las Ericáceas. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Hojas frescas de angiospermas y gimnospermas (alumno), Acetato de etilo, Acetona, cloroformo, Acido acético, Hidróxido de amonio 2M, Ácido p-hidroxibenzóico, Ácido vainíllico, Ácido siríngico, Ácido salicílico, Reactivo de Folin, ácido clorhídrico 2 M (500 mL), etanol de 96° Materiales y equipo 5 Tubos para resonancia 2 Matraces Erlenmeyer 250 mL 1 Probeta graduada de 50 mL 2 Vasos de precipitados de 100 mL 2 Vasos de precipitado de 10 mL 1 Embudo de separación de 150 mL 1 Cámara cromatográfica con tapa 1 Baño de agua con temperatura controlada
1 Lápiz suave 1 Regla de plástico de 30 cm 1 Vaso de precipitados de 50 mL 1 Soporte Universal y anillo Rotaevaporador Lámpara de Luz UV Cromatoplacas de silicagel de 20X20cm
PROCEDIMIENTO: Colocar hojas (5-10 g aproximadamente) del material vegetal elegido; también puede analizarse un helecho o el cuerpo fructífero de un hongo. En cada caso, sumergir los trozos del tejido en un matraz Erlenmeyer de 250 mL con HC1 2M (cantidad suficiente para que cubra las hojas) y calentar por 1 hora en un baño de agua hirviente. Enfriar, decantar y extraer la fase acuosa con acetato de etilo en el embudo de separación (3 lavados con 20 mL cada uno). Separar el extracto orgánico y concentrar a sequedad en el rotaevaporador. Disolver cada residuo en 1-2 gotas de etanol de 95%. Analizar por cromatografía en capa fina cada extracto hidrolizado, para ello utilizar placas de sílicagel de 25 mm y desarrollar la cromatografía, por duplicado utilizando ácido acético-cloroformo (1:9) como eluyente. En las placas cromatográficas colocar también patrones de ácidos vainíllico, phidroxibenzóico y siríngico. Después de desarrollar las placas, dejarlas secar, observarlas bajo luz ultravioleta y en seguida revelarlas primero con el reactivo de Folin y luego con vapores de amoniaco, además de otros reveladores indicados por el profesor (Ver apéndice 2 para su preparación). Los ácidos aparecerán como manchas azules o malva en un fondo blanco con el 40
reactivo de Folin. Verificar la presencia de ácido siríngico en el tejido de angiospermas y notar la ausencia de ácidos de este tipo en el tejido de plantas inferiores o gimnospermas. RESIDUOS Y SU MANEJO: Residuos de tejidos vegetales. Se colocan en una bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura. Residuos ácidos. Se ajusta el pH entre 6 y 7 con hidróxido de potasio 0.1 M y se vierten en el recipiente de residuos acuosos. Acetato de etilo. Se obtiene como producto de la destilación en el rotaevaporador; puede ser reutilizado si se coloca en un frasco limpio de color ámbar. Mezcla eluyente (Ácido acético: cloroformo). Se ajusta el pH entre 6 y 7 con hidróxido de potasio 0.1 M y se vierte en el recipiente de residuos orgánicos. Gel de sílice. Se retira de las placas raspando con una navaja de un filo y se deposita en el frasco de residuos de sílica gel para su posterior limpieza y reutilización. Este procedimiento se realiza con mascarilla y lentes protectores. REFERENCIAS: Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3ra ed. Chapman & Hall. Londres. 288 p. Ikan, R. 1991. Natural Products. A laboratory guide. Academic Press, New York. 360 p. Stahl, E. 1969. Thin Layer Chromatography. Springer Verlag. New York. 1041 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.
41
INFORME sesión 8. TITULO DE LA PRÁCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- En la siguiente tabla resuma los resultados obtenidos a partir de la cromatografía en capa fina. Especie vegetal
Rfs Muestra
Estándar
Color Muestra
Compuesto probable
Estándar
2.- Indicar la estructura de los ácidos fenólicos empleados como estándar en la práctica. 3.- Realizar la discusión de resultados y comparar con datos bibliográficos. CUESTIONARIO 1.- ¿Qué importancia tiene el estudio de los ácidos fenólicos? 2.- Hacer un diagrama de su ruta biosisntética de los ácidos fenólicos utilizados en al práctica.
42
Práctica V. ANÁLISIS DE PIGMENTOS FLAVONOIDES EN SEMILLAS DEL GÉNERO Phaseolus OBJETIVO: Aislar e identificar el pigmento flavonoide más abundante en la testa de semillas del género Phaseolus. INTRODUCCIÓN: Los flavonoides son compuestos que están considerados dentro del grupo de los compuestos fenólicos, debido a la presencia de anillos aromáticos en su estructura. Poseen un esqueleto carbonado C6-C3-C6, en el cual los fragmentos C6 son anillos de benceno que están unidos por C3. Su estructura puede ser abierta o cerrada. La variación en el estado de oxidación del anillo central de pirano de los flavonoides, da lugar a la diferenciación entre estos compuestos. Se han identificado 14 tipos de flavonoides, los cuales se mencionan a continuación: flavonas, flavonoles, flavanonas, dihidroflavonoles, chalconas, dihidrochalconas, auronas, isoflavonoides, antocianidinas, leucoantocianidinas, neoflavonoides, biflavonoides, rotenoides y pterocarpanos. Los flavonoides están distribuidos universalmente en las plantas superiores tanto en angiospermas como en gimnospermas. También están presentes regularmente en helechos musgos y hepáticas. Recientemente se ha reportado su presencia en algas, hongos y bacterias. Por lo general se encuentran en estado libre o como glucósidos o derivados metilados. En el caso de los pigmentos, la glicosilación es de gran importancia porque los hace solubles en la savia, los protege de la oxidación enzimática y los hace fotoestables. Al igual que en las hojas y flores, las antocianinas son las principales contribuyentes en el color de los frutos de las plantas superiores. En algunos casos se encuentran en todo el fruto como en la fresa (pelargonidina), o bien confinadas en el epicarpio como en la manzana (cianidina), o en el jugo del fruto como en las uvas ( delfinidina). En las leguminosas las antocianinas pueden colorear las vainas de algunas especies o la testa de las semillas como en el género Phaseolus en donde las diferentes especies presentan pigmentaciones que han sido estudiadas por Feenstra (1960) quien ha aislado las 6 antocianinas más comunes así como varios flavonol glucósidos. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Semillas de fríjol: Phaseolus vulgaris L. y Phaseolus coccineus L (alumno), Ácido clorhídrico 2M, Ácido clorhídrico: metanol (1:1) Butanol, Ácido trifluoro acético, Amoniaco. Materiales y equipo 1 Vaso de precipitados de 10 mL 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Probeta graduada de 100 mL 1 Micropipeta 1 Agitador de vidrio 1 Soporte Universal
1 Campana y embudos para filtración con vacío 2 Cubetas de vidrio para el análisis espectofotométrico Espéctrofotómetro UV-Vis Rotaevaporador
43
PROCEDIMIENTO: Se pesan 25 g de semillas de fríjol, se colocan en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y se agregan 50 mL de una solución de ácido trifluoroacético en metanol al 3%, dejándolo reposar a 4°C por al menos 24 h; filtrar teniendo cuidado que durante el proceso permanezcan las semillas intactas. Concentrar el extracto a presión reducida. Se resuspende la muestra en metanol acidificado con ácido clorhídrico al 1%. Se analiza por espectrofotometría UV, Visible y por cromatografía descendente en papel. Para la cromatografía se toma una hoja de papel Whatman No. 3 de 46 x 57 cm y se coloca la muestra en forma de banda. Se desarrolla la cromatografía en forma descendente utilizando butanol: ácido acético y agua, 4:1:5, (BAW, por sus siglas en inglés) como mezcla eluyente. (Fase superior). Revelar con luz UV, vapores de amoniaco y revelador (NP) sin dejar pasar mucho tiempo (Ver apéndice para su preparación). Para el análisis con el espectrofotometría, se utiliza el espectrofotómetro UV-Vis, obteniendo el espectro al hacer un barrido a diferentes longitudes de onda, utiliza como blanco para ajustar el espectro una solución de metanol acidificado al 1%. RESIDUOS Y SU MANEJO: 1 Granos de fríjol. Se colocan en una bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura. Metanol acidificado y Mezcla eluyente Se ajusta el pH entre 6 y 7 con NaOH 1M y se depositan en el recipiente de residuos orgánicos REFERENCIAS: Goodwin, T. W. 1976. Chemistry and Biochemistry of Pigments. 2da.Ed. Vol. 1. Academie Press. New York.870 p. Goodwin, T. W. 1976. Chemistry and Biochemistry of Pigments. 2da.Ed. Vol. 2 . 1 Academic Press. New York.372 p. Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3rded. Chapman & Hall. Londres. 288p. Wagner, H., S. Bladtt. 1996. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas. 2d. Ed. Springer Verlag. New York. 384 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.
44
INFORME sesión 9. TITULO DE LA PRÁCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- Obtener el espectro de absorción graficando los datos de absorbancia contra longitud de onda, revisar datos bibliográficos e indicar que tipo de compuestos se encuentran presentes en el extracto. 2.- De igual forma escanear el cromatograma en papel obtenido o fotografiarlo y anexarlo a este informe, hacer el análisis y comparación con datos bibliográficos para identificar los tipos de compuestos de los que se trata. 3.- Escribir la posible estructura química de los compuestos identificados. 4.- Menciona las ventajas y desventajas de las técnicas utilizadas para caracterizar los compuestos químicos. CUESTIONARIO 1.- Describe las principales funciones de los flavonoides en las plantas 2.- Escribe la ruta metabólica de los flavonoides y cuales son los principales usos que les ha dado la humanidad.
45
Práctica VI. ANÁLISIS DE ACEITES ESENCIALES DE SEMILLAS DE umbelíferas OBJETIVOS: 1.- Obtener aceites esenciales de semillas de umbelíferas y su detección por cromatografía en capa fina. 2.- Identificar los compuestos volátiles de semillas de umbelíferas por reacciones cromógenas. INTRODUCCIÓN: Los aceites esenciales pertenecen al grupo de los terpenoides. Bajo este término se agrupa a una enorme cantidad de sustancias vegetales que tienen como característica fundamental originarse a partir de una ruta biosintética común. Todos los terpenoides tienen como punto de partida la molécula del isopreno: CH2 = C (CH3 ) - CH = CH2 y su esqueleto carbónico se constituye a partir de dos o más de esas unidades de 5 carbonos. En su calidad de terpenoides, los aceites esenciales pueden ser químicamente divididos en 2 grupos: mono y sesquíterpenoides (C10, C15), los cuales difieren en el intervalo de su punto de ebullición: monoterpenoides entre 140 a 180°C y sesquiterpenoides > 200°C. Los aceites esenciales son los responsables de los aromas y sabores característicos encontrados en muchas plantas. Por ello son comercialmente importantes en la perfumería, la industria de la alimentación y la medicina. Entre las familias de plantas que son especialmente ricas en aceites esenciales se incluye a las compuestas, pináceas, rosáceas, rutáceas y umbelíferas, estas últimas serán motivo de estudio en esta práctica. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Semillas de anís (Pinpinella anisum L.), cilantro (Coriandrum sativum L.), comino (Cominum cyminum L.), eneldo (Anethum graveolens L. ), perejil (Pertroselinum crispum L.), Cardamomo (Elleteria cardomomum L. Maton), alcaravea (Carum carvi L.) (alumno), Eter etílico Tolueno, Revelador de anisaldehído en medio ácido*, Revelador vainillina-ácido sulfúrico*, Revelador 2, 4-dinitrofenilhídrazina* (*ver apéndice 2 para su preparación) Materiales y equipo 2 Pipetas de 1 mL 1 Mortero con pistilo 1 Matraz volumétrico de 25 mL 2 Vasos de precipitados de 10 mL 1 Vaso de precipitado de 250 mL 1 Probeta de 25 mL 1 Matraz bola de 250 o 500 mL 5 Micropipetas
1 Agitador de vidrio 2 Placas cromatográficas de silicagel FG254, de 20 X 20 cm. 1 Cámara cromatográfica con tapa Parrilla eléctrica. Estufa de aire forzado Lámpara de luz UV
PROCEDIMIENTO: Moler las semillas en el mortero, cubrirlas con éter y dejar reposar el extracto durante 30 min. Decantar y concentrar el extracto a baño María o tomar una placa cromatográfica y trazar una línea horizontal, a una distancia de 2 cm. del borde inferior de la placa. Sobre la línea trazada, aplicar con las micropipetas los extractos por analizar, es decir, apoyando el capilar sobre la línea. Repetir varias veces la aplicación de las muestras. Preparar otra placa de la misma manera. Introducir las placas 46
cromatográficas en la cámara de elusión la cual deberá contener la mezcla de tolueno:acetato de etilo 93:7, tapar la cámara y esperar a que el eluyente suba hasta 0.5 cm. del borde superior, (40-60 min. aproximadamente). Sacar las placas de la cámara, marcar inmediatamente con el lápiz la distancia recorrida por la mezcla eluyente y dejarlas secar. Observar las placas bajo luz UV y marcar las manchas. Asperjar la primera placa con el revelador vainillina-ácido sulfúrico, calentar a 100°C durante 10 minutos para desarrollar color. Asperjar la segunda placa con el revelador 2,4-dinitrofenilhídrazina (DNP) y observar las manchas de color naranja, alternativamente la placa se puede asperjar con el revelador de anisaldehído-ácido sulfúrico, calentando a 100°C por 10 minutos para desarrollar color (Ver apéndice para la preparación de los reveladores). RESIDUOS Y SU MANEJO: Tejido vegetal macerado Se coloca en una bolsa de papel de estraza y se deposita al cesto de la basura. Mezcla de elusión tolueno:acetato de etílo Se vierte en el recipiente de los residuos orgánicos. Gel de Sílice Una vez que se tomaron todos los datos se retira la silicagel de la placa raspando con una navaja de un filo y se coloca en el recipiente de desechos de silica gel, para su posterior limpieza y reutilización. Tener la precaución de realizar esta actividad con mascarilla y lentes. REFERENCIAS: Ikan, R. 1991. Natural Prroducts. A Laboratory Guide. Academic Press, New York.360p. Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3rd ed. Chapman & Hall. Londres. 288p. Wagner, H., S. Bladtt. 1996. Plant Drug Analysis A Thin Layer Chromatography Atlas. 2d. Ed. Springer Verlag. New York. 384 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.
47
INFORME sesión 10. TITULO DE LA PRÁCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- En el cuadro 1 se presentan los valores de Rf de diferentes aceites esenciales encontrados en semillas de plantas de la familia umbelíferas, haz un cuadro con los datos obtenidos en la cromatografía y compara los valores de Rf con el cuadro 1, escribe las conclusiones a las que llegues. Cuadro 1.- Listado e identificación por Rf y color de algunos de los aceites esenciales presentes en las semillas de las umbelíferas en estudio. Rf (X100) COMPUESTO GENERONOMBRE COLOR Y ESPECIE COMUN REVELADOR APROX.
Anís Perejil
Pimpinella anisum
Petroselinum crispum Coriandrum sativum Cilantro Comino Cuminum cyminum Alcaravea Carum-carvi L. Anethum graveolens Eneldo Cardomomo Elleteria cardomomum
85 40 64
Anetol Anilsaldehído Apiol
Naranja-DNP Naranja-DNP Café-Vainillina
30 59 46 43 40
Linalol Cuminaldehído Carvona Carvona Cineol
Malva-vainillina Naranja-DNP Naranja-DNP Naranja-DNP Azul y violeta Vainillina
2.- Escriba las estructuras químicas de los compuestos identificados. CUESTIONARIO 1.- Describe las principales funciones de los aceites esenciales en las plantas 2.-. Describe por lo menos 3 métodos de análisis que se reportan para el estudio de aceites esenciales 3.- Escribe cual es la ruta metabólica de biosíntesis de los aceites esenciales.
48
Práctica VII. ANÁLISIS DE ALICINA EN Allium spp. OBJETIVO: 1.- Aislar el compuesto azufrado alicina de Allium spp. INTRODUCCIÓN: Además de los aminoácidos cisteína y metionina que contienen azufre, existen otros compuestos orgánicos comprendidos dentro de los metabolitos secundarios que contienen azufre. Su distribución dentro del Reino Vegetal es restringida. Muchos de ellos son volátiles y presentan un olor o sabor irritante muy característico, lo que facilita su detección durante la extracción y aislamiento. Dentro de este grupo encontramos a los glucosinolatos, universalmente distribuidos en la familia de las Crucíferas y familias relacionadas del orden. Los glucosinolatos son precursores del aceite de mostaza y sólo provocan el olor irritante después de sufrir hidrólisis enzimática. Ello ocurre cuando el tejido fresco es macerado y la enzima hidrolítica, una tioglusidasa conocida como mirosinasa libera los isotiocianatos. Se conocen alrededor de 70 glucosinolatos siendo la mayoría derivados alifáticos con un remanente con sustituyentes bencilo. La estructura es la misma y el azufre ligado al azúcar, que es siempre glucosa. Los glucosinolatos son sintetizados a partir de aminoácidos. En cuanto a su función en las plantas se sabe que tienen acción antibacteriana, y algunos ejercen atracción alimenticia a orugas y áfidos que se alimentan de crucíferas. Por lo que se refiere a los tiofenos, estos ocurren únicamente en la familia Asteraceae. Se encuentran en asociación con poliacetilenos. El primero que se descubrió fue el α-tertienil en los pétalos de Tapetes, el cual es un trímero de tiofeno, pero la mayoría de los 100 o más tiofenos descubiertos tienen cadenas laterales que contienen sustituciones acetilénicas. Como tercer grupo de compuestos azufrados podernos mencionar a los sulfuros orgánicos, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en el género Allium (ajo). El sabor del ajo, rábano y cebolla se debe a la presencia de estos compuestos. Ellos son inmediatamente reconocidos por su olor pungente y sus propiedades lacrimógenas. Probablemente se encuentran en los tejidos intactos como aminoácidos sulfurados. Entre ellos se puede mencionar a la aliína y alicina. Este último ha sido aislado en estado puro como un líquido incoloro que contiene aproximadamente un 40% de azufre en su molécula. Se ha demostrado también su actividad antibacteriana (Cavallito y Bailey 1944). REACTIVOS Y DISOLVENTES: 1 diente de ajo (alumno), Agua destilada, Etanol, Éter etílico, Cloroformo, Metanol, Tolueno, Acetato de Etilo, Diclorometano. Materiales y equipo 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Vaso de precipitados de 250 mL 1 Embudo de tallo largo 1 Agitador 1 Embudo de separación de 300 mL 1 Mortero con pistilo 1 Congelador
1 Matraz Erlenmeyer de 1 L 1 Probeta de 25 mL Papel filtro Whatman # 1 1 Espátula metálica 1 Frasco de cultivo con tapa Placas de sílicagel GF254 de 2X5 y de 20X20 cm. 1 Rotaevaporador
49
PROCEDIMIENTO: El diente de ajo picado, se ponen en170 mL de etanol al 95% o 15 mL de amortiguador de fosfatos a pH 6. Se agita por 15 minutos y se filtra. En el caso del extracto etanólico se concentra a presión reducida hasta que todo el etanol sea removido. En el caso de la extracción con el amortiguador de fosfatos agregar 10 mL de hexano y se prosigue como indica método. En el caso del concentrado etanólico, éste se combina con 25mL de agua + 10 mL de hexano. Posteriormente, se separa la fase orgánica y la fase acuosa se extrae con 4 porciones de 25 mL c/u de éter etílico o diclorometano; el extracto obtenido se guarda en congelación para separar trazas de agua residual. Se evapora el disolvente en el rotaevaporador obteniéndose un líquido incoloro, que corresponde a la alicina. La detección de los compuestos de azufre en el extracto de ajo puede hacerse a través de la técnica de CCF, para la cual se aplica la muestra según las técnicas ya indicadas y se desarrolla, utilizando como mezcla eluyente tolueno:acetato de etilo 100:30 (v/v). Una vez desarrollado el cromatograma se retira de la cámara, se permite la evaporación del disolvente y se observa bajo la lámpara de UV. Enseguida se puede preparar el revelador con los siguientes reactivos: 1).- Cloruro estaño en medio ácido y anisaldehído en medio ácido. 2).- Vainillina en medio ácido. Ver apéndice 2 para la preparación de estos reveladores. Se revela cada placa con cada uno de los reveladores RESIDUOS Y SU MANEJO: Material vegetal macerado (ajo) Se coloca en una bolsa de papel encerado y se deposita en el cesto de la basura. Etanol, Éter etílico, Mezcla eluyente Se colocan en el recipiente de residuos orgánicos Placas cromatográficas. Retirar la sílica, utilizando para ello una navaja de un filo, la cual se deposita en el recipiente sílica gel, para su limpieza y posterior reuso. REFERENCIAS: Cavallito, C.J. y Bailey, H.J. 1944. the antibacterial principie of Allium sativum.I. Isolation, physical properties and antibacterial action.J. Am. Chem. Soc. 66:1950. Harborne, J.B. 1983. Phytochemical Methods. Chapman and Hall, Londres. 289 p. Keusgen,M. 1997. TLC Analysis of Allium sativum Constituents. Planta Medica 63: 93- 94. Wagner, H., Bladt, S. 1996. Plant Drug Analysis. Springer Verlag. Berlin. 384 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.
50
INFORME sesión 11. TITULO DE LA PRÁCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- Indicar el rendimiento de alicina obtenido (escribir los cálculos correspondientes) 2.- Indicar Rf experimental y compararlo con el obtenido bibliográficamente, hacer al discusión correspondiente y escribir conclusiones. 3.- Escriba las estructuras químicas de la alicina CUESTIONARIO 1.- Describe las principales funciones de los compuestos azufrados en las plantas 2.- Menciona los principales usos que se le dan los compuestos azufrados de las plantas. 3.- Escribe cual es la ruta metabólica de biosíntesis de los compuestos azufrados.
51
Práctica VIII. EXTRACCIÓN DE CAFEÍNA DE HOJAS DE TÉ NEGRO OBJETIVOS: 1.- Aislar cafeína de hojas de té negro. 2.- Caracterizar el producto obtenido por su p.f., pruebas de color y formación de un derivado. INTRODUCCIÓN: La cafeína es uno de los más importantes metil derivados naturales de la xantina (1, 3, 7trimetilxantina). La concentración de este alcaloide, que se encuentra en el café, té, nuez de cola, mate, etc., varía dependiendo de las condiciones climáticas y topográficas en las que se desarrollan los cultivos de donde se extrae. Se ha encontrado un intervalo de variación entre 2.0 a 4.6% de cafeína en dichos vegetales. La cafeína presenta varias acciones farmacológicas de interés terapéutico. Es fisiológicamente activa produciendo un efecto estimulante sobre el sistema nervioso central (SNC). La popularidad de las bebidas que contienen cafeína es parcialmente debida a este efecto; sin embargo, su consumo en exceso puede causar efectos irritantes tales como nerviosismo e insomnio. Además de su efecto sobre SNC la cafeína actúa sobre el riñón para producir diuresis; estimula el músculo cardiaco y relaja el músculo liso, especialmente el bronquial. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Hojas de Té Negro Camellia sinensis L. o en su defecto bolsitas de te negro (alumno), Diclorometano, Acetato de plomo al 10%, Agua destilada, Hidróxido de amonio Acetona, Yoduro de potasio, Yodo, Metanol, Acetato de etilo, Agua oxigenada, carbonato de calcio, Papel filtro, Ácido clorhídrico, Tela de algodón. Materiales y equipo 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 1 Anillo metálico 2 Vasos de precipitados de 400 mL 1 Embudo de vidrio tallo corto 1 Probeta graduada de 100 mL 1 Vaso de precipitado de 50 mL 1 Embudo de separación de 500 mL 1Matraz Erlenmeyer de 50 mL 1 Matraz Kitazato de 500 mL 1 Vidrio de reloj 1 Embudo Büchner de 8 cm diam.
1 Agitador de vidrio 1 Recipiente p/baño María 1 Pipeta Pasteur 1 Soporte metálico 1 Parrilla de calentamiento 1 Espátula 1 Cápsula de porcelana Balanza analítica Rotaevaporador
PROCEDIMIENTO: Poner a hervir 100 mL de agua destilada en vaso de precipitados de 400 mL. Sumergir en el vaso 10-11 g de hojas de té (cinco bolsitas de té negro) y hervir por 15 min. Enfriar, remover las bolsas de té, exprimiéndolas con unas pinzas. Añadir 5.0 g de carbonato de calcio y calentar por 5 min. Filtrar la mezcla a un vaso limpio a través de la tela de algodón y exprimir la tela. Filtrar ahora con vacío en un embudo Büchner para eliminar por completó el residuo de té. Enfriar el filtrado a temperatura ambiente y pasarlo al embudo de separación; añadir 30 mL de diclorometano y agitar el embudo suavemente, dejar separar las fases, quitar el tapón del embudo y drenar la fase orgánica inferior de la fase acuosa superior. Repetir la extracción de la fase acuosa con dos porciones más de diclorometano (30 mL c/u). Evaporar el disolvente en el rotaevaporador. Purificar la cafeína cruda 52
con acetona. Dejar secar los cristales. Pesar el producto, determinar su p.f. y efectuar las siguientes pruebas: a).- Poner unos cuantos cristales de cafeína en una cápsula de porcelana y añadir 3 gotas de H202 + 3 gotas de HC1. Evaporar a sequedad con calor y añadir 2 gotas de hidróxido de amonio; observar la formación de un color púrpura. (Prueba de la Murexida). b).- Como prueba adicional obtener el espectro UV de la cafeína, observándose λ max a 278 nm. c).- Alternativamente realizar la cromatografía en capa fina utilizando como mezcla eluyente acetato de etilo: metanol: agua (100:13.5:10). Revelar con el revelador de yodo/yoduro de potasio en medio ácido (Ver apéndice 2 para su preparación). RESIDUOS Y SU MANEJO: Bolsitas con te negro Se colocan en bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura. Diclorometano Se deposita en el recipiente de residuos halogenados. Mezcla de etanol:éter etílico y Éter de petróleo Se vierten en el recipiente de residuos orgánicos. Residuos de la prueba de Murexida (ácido clorhídrico, hidróxido de amonio). Dado que se trata de pequeñas cantidades del orden de unos cuantos mililitros, se diluye con agua y se vierte en el recipiente de los residuos acuosos. REFERENCIAS: Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3a ed. Chapman & Hall. Londres. 288 p. Ikan, R. 1991. Natural Products. A Laboratory guide. Academic Press New York. 293 P. Pavia, D.D., Lampman, G.M. y Kriz, G.S. Jr. 1976. Introduction to Organic Laboratory Techniques. W.B. Saunders Co. Filadelfia. 699 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.
53
INFORME sesión 12. TITULO DE LA PRÁCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- Indicar el rendimiento de cafeína obtenido (escribir los cálculos correspondientes) 2.- Indicar los valores del punto de fusión, Rf experimental y espectro de la cafeína obtenida y compararlo con datos bibliográficos, hacer la discusión correspondiente y escribir conclusiones. 3.- Escriba las estructura química de la cafeína y las reacciones químicas con su mecanismo de reacción, que se efectúan en la la prueba de Murexida. CUESTIONARIO 1.- Mencione fuentes naturales para el aislamiento de cafeína, incluyendo la referencia bibliográfica 2.- Explique el fundamento del proceso de extracción de cafeína 3.- En que se basa el proceso de recristalización por par de disolventes 4.- Menciona los principales usos que se le dan a la cafeína y sus efectos fisiológicos. 3.- Escriba cual es la ruta metabólica de biosíntesis de la cafeína.
54
APÉNDICE 2 REVELADORES 1) Natural product's polietilenglicol (NP/PEG) La placa se asperja con una solución al 1% en metanol (10mL) de: P-etíl-aminoéster del ácido difenil bórico (NP), seguido por una solución al 5% de polietilenglicol 4000 en metanol (8 mL). 2) Reactivo de Libebermann-Burchard. Se añade cuidadosamente 5 mL de anhídrido acético y 5 mL de ácido sulfúrico concentrado a 50 mL de etanol absoluto previamente enfriado en hielo. El reactivo se usa fresco. La placa se asperja con 10 mL del reactivo y se calienta a 100° C por 5–10 min. 3) Reactivo de 2,4–dinitrofenilhidracina (DNPH). Se disuelve 0.1 g del 2,4-dinitrofenilhidracina en 100 mL de metanol, se añade 1 mL de HCL al 36%. La placa se asperja en 10 ml del reactivo y se evalúa inmediatamente. 4) Reactivo de Dragendorff (DRG) Solución a) Se disuelven 0.85 g de nitrato básico de bismuto en 10 mL de ácido acético glacial y 40 ml de agua (con calentamiento y filtración si es necesario). Solución b) Se disuelven 8 g de ioduro de potasio en 30 mL de agua. Solución stock. Solución a y b se mezclan 1:1. La placa se asperja adicionalmente con 10 mL del reactivo para asperjar: 1 mL de sol. Stock se mezcla con 2 ml de ácido acético glacial y 10 mL de agua. El color de las manchas se intensifica cuando la placa se asperja adicionalmente con 10mL de ácido sulfúrico al 10% en etanol o Nitrito de sodio al 10% en agua. La placa se calienta en la estufa por 5– 10 min. 5) Reactivo de vainillina – Ácido sulfúrico Solución I. Vainilla al 1% en etanol Solución II Ácido sulfúrico al 10% en etanol La placa se asperja con 10 ml de solución I, seguida de 10 mL de solución II. La placa se calienta a 110° C por 5 – 10 min. 6) Revelador de anisaldehído Anisaldehído, ácido sulfúrico, ácido acético glacial. Se mezclan en la siguiente proporción: 10:0.2:0.1 mL. La placa se calienta en la estufa por 5 – 10 min. 7) Revelador de cloruro estanoso y anisaldehído. a) Se disuelven 250 mg de SnC12 en 5 mL de HC1 y 5 mL de metanol. b) Se disuelven 0.5 mL de anisaldehído en 10 mL de ácido acético, se añaden 85 mL de metanol y 5 mL de ácido sulfúrico concentrado, en ese orden. c) La placa de asperja con 10 mL de "a" y enseguida con 10 mL de "b" y se calienta a 110°C por 7 min. 8) Revelador de Carr-Price. Solución al 20% de tricloruro de antimonio en cloroformo o etanol. La placa se asperja con 10-15 mL del reactivo y enseguida se calienta por 5-6 min a 100°C. Se evalúa tanto en UV (365nm) como en visible. Reveladores de Acidos Fenólicos 1) Reactivo de Gibbs Se prepara una solución de 0.5% de 2,6-dicloroquinona cloroimida La placa de asperja con 10 mL de esta solución e inmediatamente se expone a vapores de amoniaco. 2) Reactivo de Pauli 55
Sol. A. Se disuelven con calentamiento 450 mg de ácido sulfanílico en 4.5 mL de HC1 12N y se diluyen a 50 mL. Sol. B. Se prepara una solución acuosa al 4.5% de nitrito de sodio en agua. Ambas soluciones se mantienen a 4°C. Al momento de asperjar la placa se usan volúmenes 1:1 de A y B mas 1 vol. igual de Na2CO3; al 10%. 3) Ferricianuro de potasio-cloruro férrico. Sol. A. Se prepara una solución acuosa al 1% de ferricianuro de potasio Sol. B. Se prepara una solución acuosa al 2% de cloruro férrico. Cantidades iguales de A y B se mezclan al momento de asperjar la placa. Los colores se realzan al asperjar la placa con HC1 2N 4) Cloruro férrico Se prepara una solución al 1-5% de cloruro férrico en HC1 0.5N 5) Reactivo de Folin-Ciocalteu Sol. A. Carbonato de sodio al 20% Sol. B: Reactivo de Folin La placa se asperja primero con sol. A y luego con sol. B., después de un breve secado. 6) Reactivote Vainillina-Ácido acético 0.8g de vainillina se disuelven en 40 mL de ácido acético glacial y se añaden en 2 mLl de ácido sulfúrico concentrado. La placa se asperja con 10 mL de la solución y se calienta por 3-5 min (110°C)
56
