Nuevos enfoques del diagnóstico molecular de las

Nuevos enfoques del diagnóstico molecular de las Rickettsiosis Dra. Isabel Jado García Laboratorio de Espiroquetas y Patógenos Especiales...

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Nuevos enfoques del diagnóstico molecular de las Rickettsiosis 

Dra. Isabel Jado García Laboratorio de  Espiroquetas y Patógenos Especiales Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III

Diagnóstico de las rickettsiosis ™ Patógenos zoonósicos bacterianos emergentes : ‐ Producen cuadros clínicos inespecíficos Alteraciones hematológicas y bioquímicas (TCP, leuc y enz hep ↑ )

‐ Organismos de cultivo fastidioso ‐ Son agentes de difícil diagnóstico ‐ Enfermedades de baja incidencia

™ No existen métodos comerciales de detección directa ™ Necesidad de una tipificación más detallada

NIVEL BAJO DE SOSPECHA Y DETECCIÓN DE CASOS

DEFICIENCIAS  EN SU ESTUDIO

Necesidad de un abordaje multidisciplinar 1

Grupos de Medioambiente Estudio de la dinámica de vectores y reservorios  Obtención de muestras para su estudio   (Entomólogos, Zoólogos, Veterinarios, Biólogos) 

2

Grupos Clínicos Identificación y estudio de casos humanos y animales  Obtención de muestras para su estudio   (Médicos y Veterinarios) 

3

Grupos de Laboratorio Desarrollo de metodología de detección y caracterización Estudio de  muestras recogidas. (Microbiólogos, Biólogos Moleculares, Taxónomos) 

Diagnóstico de las Enfermedades Infecciosas

CLÍNICA

EPIDEMIOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA

Diagnóstico: Aspectos Clínicos ™ Los principales signos clínicos varían de la especie implicada, los daños tienen un mismo origen y derivan de la vasculitis generalizada por la multiplicación bacteriana en las células endoteliales.

™ Casos graves con afectación del SNC son relativamente frecuentes. R. conorii (subsp. conorii) 5‐6% formas severas y 2,5% † en pacientes diagnosticados

Además de las fiebres inexplicadas asociadas con neutropenia, trombopenia o elevación de las transaminasas, se debe sospechar una rickettsiosis: ™ Una erupción febril inexplicada del adulto en verano ™ Presencia de lesiones cutáneas necróticas ™ Después de mordedura de garrapata si aparece: ‐ Meningoencefalitis (con serología de borreliosis negativa)  ‐ Fiebre a la vuelta de un país tropical o  mediterráneo ‐ Fiebre resistente a betalactámicos ‐ Eritema crónico atípico 

Vasculitis

Exantema

Escara de  inoculación

Evaluación del riesgo El riesgo de que una garrapata transmita una rickettsia y la prevalencia de una determinada infección depende de varios parámetros: 1. La prevalencia de garrapatas infectadas 53,4 % de D. marginatus de Madrid infectados con R. raoultii 0,4 % de I. ricinus del PV infectados con R. monacensis 2. La afinidad de las garrapatas para picar a humanos Prevalencia de FB en países mediterráneos 50/100.000: R. sanguineus ↓ Amblyomma spp ↑↑↑ 3. La abundancia de garrapatas en la zona: factores climáticos y ecológicos

FACTORES CLIMÁTICOS

DISPONIBILIDAD DE ALIMENTOS

DENSIDAD DE  MICROMAMÍFEROS

MANTENIMIENTO DE IXÓDIDOS INFECTADOS

Diagnóstico: Aspectos Epidemiológicos LA DISTRIBUCIÓN DE UNA DETERMINADA ESPECIE COINCIDE  CON LA DISTRIBUCIÓN DE LA GARRAPATA VECTOR

CASOS HUMANOS

VECTORES RESERVORIOS

LA CIRCULACIÓN DE ESTOS PATÓGENOS SIGUE UN PATRÓN DINÁMICO IMPORTACIÓN ILEGAL DE ANIMALES

AVES MIGRATORIAS

Las rickettsiosis son enfermedades emergentes 

Especies de Rickettsia patógenas  hasta 1984 R. conorii R. conorii subsp. israelensis R. sibirica R. australis R. prowazekii R. typhi R. rickettsii R. akari

Nuevas especies de Rickettsia patógenas entre 1985 y 2004 R. japonica R. conorii subsp. caspia R. africae R. honei R. sibirica subsp. mongolotimonae R. slovaca R. heilongjiangensis R. aeschlimanii R. parkeri R. massiliae R. marmionii R. felis

¡ 11 especies de rickettsias emergentes ! R. slovaca R. aeschlimannii R. sibirica mongolotimonae R. helvetica R. monacensis

R. sibirica mongolotimonae R. helvetica R. conorii  (caspia)

R. japonica

R. parkeri R. heilongjiangensis

R. africae R. aeschlimannii R. sibirica mongolotimonae

R. honei

¡ 11 especies de rickettsias emergentes ! SITUACIÓN EN  EUROPA A PARTIR DE 2008

R. typhi R. felis R. conorii conorii R. conorii israelensis

R. helvetica R. massiliae/Bar29

R. conorii caspia R. sibirica mongolotimonae

R. monacensis y  otras relacionadas

PATÓGENAS

R. aeschlimanni R. Slovaca

R. raoultii Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev  2005; 18:719‐756

Diagnóstico

CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO (SIM) EN 2009 ‐ AISLAMIENTO ‐ DETECCIÓN DE AG/GENOMA ‐ SEROCONVERSIÓN (IFI)

DIAGNÓSTICO  DIFERENCIAL ‐ Sarampión ‐ Meningococemia ‐ Sífilis secundaria ‐ Dengue ‐ Toxicodermias

Modificado de P. Brouqui et al. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108‐1132

Muestras Transporte  Tiempo y  Temperatura

Conservación  Tiempo y  Temperatura

PRUEBA  DIAGNÓSTICA

MUESTRA

Recogida

Suero

Tubo con tapón de  rosca

<24 h, 2‐8 C 

+24h, ‐20 C

IFI1

Sangre con  EDTA

Recoger en tubo con  EDTA

< 24 h, 2‐8 ºC 

+24h, ‐20 C

PCR2

Sangre  citratada

Recoger en tubo con  citrato

< 24 h, 2‐8 ºC 

+24h, ‐60/‐80 C  (no varias  descongelaciones)

PCR, Cultivo4

Sangre  heparinizada

Recoger en tubo con  heparina

< 24 h, 2‐8 ºC 

+24h, ‐60/‐80 C  (no varias  descongelaciones)

Cultivo

LCR

Recoger en tubo  estéril

< 24 h, 2‐8 ºC 

+24h, ‐20 C

PCR

Biopsia cutánea 

Se recomienda  asepsia en la toma  de la muestra.  Colocar el tejido en  un tubo o frasco  estéril con suero  fisiológico estéril  para prevenir la  desecación

<24 h, 2‐8 C

+24 h, ‐20 C

Microscopía6 PCR

(escara de la  picadura, piel del  exantema,  pápulas/máculas/ vesículas)

NOTA

El EDTA3 dificulta el  cultivo

La heparina5  puede inhibir  la PCR

Muestra de  la escara de  inoculación 

Tomado del Procedimiento en Microbiología Clínica (SEIMC): ”Diagnóstico microbiológico de las infecciones por patógenos bacterianos emergentes: Anaplasma, Bartonella, Rickettsia, Tropheryma whipplei. 2007

Procesamiento de las muestras SANGRE

ARTRÓPODOS BIOPSIA CUTÁNEA (4°C  3 días)

PAPEL FILTRO

SUERO

ANTICOAGULANTE

EDTA

CITRATO INMUNODETECCIÓN

SEROLOGÍA

CULTIVO CELULAR EN  SHELL‐VIALS

LCR

INMUNOFLUORESCENCIA TINCIÓN  DE GIMÉNEZ/ GIEMSA

MÉTODOS BASADOS EN PCR Modificado de P. Brouqui et al. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108‐1132

Diagnóstico serológico ‰ El método serológico de referencia es la IFI. Permite el seguimiento de la respuesta inmune específica y conocer la prevalencia de anticuerpos en un área determinada. ‰ Existen portaobjetos comerciales sólo para ciertas especies. ‰ Necesidad de sueros pareados para demostrar la seroconversión que puede tardar varias semanas o no producirse. ‰ FB: sensibilidad 46% (sueros 5‐9 días) y del 100% (sueros después de 29 días) ‰ En DEBONEL/TIBOLA y en infecciones por R. sibirica mongolotimonae se han descrito casos (PCR/aislamiento) con serologías negativas. ‰ En R. africae se detectan anticuerpos 3‐4 semanas después del inicio de síntomas y la serología negativa en caso de instauración temprana de tratamiento antibiótico.

Diagnóstico serológico ‰ Inconveniente: reacciones cruzadas entre las diferentes especies ‰ Western blotting (absorción de los sueros con antígenos)

c o n o r i i

a f r i c a e

c o n o r i i

a f r i c a e

c o n o r i i

a f r i c a e

NO absor         absor                  absor  R. conorii R. africae Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev  2005; 18:719‐756

Diagnóstico mediante cultivo ‰ El diagnóstico definitivo requiere el aislamiento e identificación de la especie a partir del cultivo (días‐semanas) ‰ Cultivo en células vero‐E6 ⇒ efecto citopático no es muy característico ni especie‐ específico (5‐7 días) Cultivo en shell‐vial Giménez IFI PCR

7 días

El cultivo es la técnica diagnóstica más específica, fundamental para  la obtención de antígenos y para estudiar la sensibilidad a los antibióticos Procedimiento muy laborioso, poco sensible y retrasa la emisión de resultados Las muestras deben cultivarse el día de la extracción o congelarse a ‐80°C ¡CULTIVO EN LABORATORIO BSL3!

VARIOS  PASES (20 días)

Diagnóstico molecular

‰ No existen técnicas comercializadas. ‰ Los genes más frecuentemente analizados son rOmpA, rOmpB y gltA. ‰ PCR‐RLB del espacio intergénico 23S‐5S rRNA permite la identificación de la especie implicada sin necesidad de secuenciación. Este método es válido para muestras clínicas como ambientales. ‰ Cuando se precisa mayor sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas.

Dianas más utilizadas

Genes utilizados y especies

Oligonucleótidos

Método

Muestra

Referencia

Citrato sintetasa (gltA) Todas las especies

PCR

Biopsia cutánea Garrapatas

Roux V. et al. Int J Syst Bacteriol 1997

Proteína externa de membrana A

PCR

Biopsia cutánea Garrapatas

Fournier P.E. et al. Int J Syst Bacteriol 1998

(ompA) Todas las especies excepto GT

(ompA)

“PCR suicida”* Suero

Raoult D. et al. N Engl J Med 2001 Fournier P.E. et al. J Clin Microbiol 2004

“PCR suicida”* Suero

*En la PCR anidada “suicida” no se utiliza control positivo y los oligonucleótidos sólo se usan una vez. * En la PCR anidada “suicida” no se utiliza control positivo Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev  2005; 18:719‐756

Dianas más utilizadas

Genes utilizados y especies

Oligonucleótidos

Método

Proteína externa de membrana B Citrato sintetasa (gltA) Todas las especies (ompB) (Todas las especies excepto

PCR

Gen D (mayoría de las especies)

PCR

Gen que codifica la proteina de 17 kDa (todas las especies SFG)

PCR

Muestra Biopsia cutánea Garrapatas

Biopsia cutánea

Biopsia cutánea Garrapatas

PCR PCR Nested

Biopsia cutánea Biopsia cutánea Garrapatas Suero Sangre Garrapatas

Referencia

Roux V. et al. Int J Syst Evol Microbiol 2000

Sekeyova Z. et al. Int J Syst Evol Microbiol 2001 Roux V. et al. Int J Syst Bacteriol 1997

Fournier P.E. et al. T. et al.1998 IntTzianbos J Syst Bacteriol J Cin Microbiol 1989

Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev  2005; 18:719‐756

Filogenia

R. africae Rickettsia sp. “strain S” R. parkeri R. sibirica sibirica R. sibirica mongolotimonae R. conorii conorii R. conorii indica R. conorii caspia R. conorii israelensis R. slovaca R. rickettsii R. honei R. japonica

R.

G R U P O

r i c k e t t s i i

R. massiliae R. massiliae Bar29 GRUPO R. rhipicephali R. massiliae R. aeschlimannii R. montanensis R. helvetica   GRUPO R. helvetica   R. australis           GRUPO R. akari  

gltA                            ompA                        ompB

gen D

R. canadendis AB bacterium R. belli

GRUPO Ancestral

Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev  2005; 18:719‐756

PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA  ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA PARCIAL DE LOS GENES 23S y 5S rRNA Y ESPACIO INTERGÉNICO 23S‐5S  AY125017-R_helvetica AY125014-R_Bar29 AY125013-R_massiliae AY125012-R_conorii AY125011-R_conorii AY125015-R_honei AABW01000001-R_sibirica AY125009-R_slovaca AY125008-R_slovaca U11022-R_rickettsii AY125016-R_aeschlimannii R_australis AAFE01000001-R_akari R_felis U11015-R_bellii AY125019-R_typhi U11018-R_prowazekii

SGR-TAGCTCGATTGRTTTACTTTG TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGGTTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGGTTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGGGATTACATATGCATATGGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGGGATTACATATGCGTATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACACATGTATATAGTGTTT TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTGTATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTATATATGCATATAGTGTTA *********** ************** **** * *** *** *****

DISEÑO DE SONDAS ESPECÍFICAS EN GENES 23S y 5S rRNA Y ESPACIO INTERGÉNICO 23S‐5S  R_hel CAGCTTTATCAACTAATAAAGATGTTGTTGCATGACTA--ATGTCATAT-----------CATGGCTTGATCCACGGTA----TCCAGTAAAA---ATTA Bar29 TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATCACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCTAG-AAAA---ATTA R_mass TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATCACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCTAGCAAAA---ATTA R_con TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATATAC---------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAGA---ATTA R_con TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATATAC---------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAGA---ATTA R_hon TAGTTTTATCAACTTATTAAAATGTTATTGCATAACTA--ATTTTATAC-----------TGTAGCCTTG-CCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA R_sib TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA R_slo TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCCTGCCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA R_slo TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCCTGCCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTT R_rick TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGTCCTG-CAACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA R_aeschTAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATATTATACTGTA-------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCCAGCAAAA---ATTA R_aus TAGCTTTATCAATGAATAAAGATGTTGTTGCACAGCTA--ATAATGTCATCT--------CGTGGCTTGA-CCACAGTA----TCTAG---C----AGTA R_aka TAGCTTTATCAATGAATAAACATGTTGTTGCACAGCTA--ATAGTGTCATGT--------CGTGGCTTGA-CCAC---------------------AGTA R_fel TAGCTTTACCAATGAATAAAAATGTTGTTGCACAGCTA--ATAATGTTATAC--------CGTGGTCCCG-CCAC---------------------GGTA R_bell TAGCTTTATCAACTAATAAAG-TGTTGTTGCATGATTGTCATCCCGTGGCTTTATTTATATGTCATTCCTGCGAAAGCAGGAGTCTAGTAAAATATAATG TAGCTTTATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTT------TATGT-----------CACGATTTGA-CCGTAA-GA---TC--------------R_ty R_prow TAGCTTTATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTT------TATGT-----------TACGATTTGA-TAGTAA-AG---TTTTG--------ATCT

PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA  F1

DNA sintético de R. prowazekii

R1

103 pb F2

R2

152 pb F3

R3

224 pb F4

R4

318 pb R4

F5

374 pb

Reacción de ligación Shock térmico Selección de transformantes Purificación de plásmidos Secuenciación

CLONACIÓN

PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA 

Semi‐NESTED MUESTRAS CLÍNICAS

Dilución 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10--8 Copias 103 102 10 1

CONTROL POSITIVO: Clon mutado de R. prowazekii GATAGGTCGGGTGTGGAAGCACAGTAATGTGTGTAGCTAACCGATACTAATAGCTCGATTGRTTTACTTTGCTGTGAGA TTATATATGCATATAGTGTTAATTATATAAGTATTTAAGCATCAATTTGTAAATTATAATTTTAATGTTAAATTAGCTT TATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTTTATGTYACGATTTGATAGTAAAGTTTTGATCTTTCTTTAAGATATTG TAGACAATTGTATATTATACCTTGCTTAAGAATAATATAATAGCATTAACAGCATATTATAATACAACCTATTTTGTTA AATTTGTATTGCTAGCTTGGTGGTCATAGCATGAGTGAAACACACGATCCCATCCCGA SG-Rick TAGCTCGATTGRTTTACTTTG SG-Rick-mut- TAGCTCCCATTAGTTCGGGTG (cambios en negrita) SG-TG-wt GTTATTCTATCGTTTTATGTYACG SG-TG-mut1-GAATAACATACGAAAATAGAATCG (cambiadas A y T) S-PROWTACGATTTGATAGTAAAGTTTTG S-PROW-mut1-ATCGTAAAGTATGATTTGAAAAG (cambiadas A y T)

Comparativa entre 23S‐5S rRNA y rOmpA

rOmpA

23S-5S rRNA

1ª PCR              nested

1ª PCR   seminested

532 pb

427 pb

Dilución 10‐3  10‐4  10‐5                            10‐3   10‐4  10‐5 10‐6

374 pb

Dilución 10‐610‐510‐410‐3 C‐10‐610‐510‐410‐3C‐ Copias 1    10   102 103

Fournier P.E. et al. Int J Syst  Bacteriol 1998

10 VECES MAYOR SENSIBILIDAD!!!

Diagnóstico molecular en el Lab de Espiroquetas y Patógenos Especiales PCR‐HIBRIADCIÓN EN FASE REVERSA (RLB) del  fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA 

A

Fijación de las sondas

C

B

Incubación con productos de PCR

Revelado de la reacción DETERMINACIÓN DE LA  ESPECIE IMPLICADA  (SIN NECESIDAD DE  SECUENCIACIÓN)

SONDAS

S-CI2 SG-RICK SG-SFG S-AESCH S-AKA3 S-AUS S-BELL S-CON S-FEL S-HELV S-RI/SI S-SLO SG-TG S-PROW S-TYPHI S-CI2 SONDAS

Brucella mellitensis Chlamydia pneumoniae C. psittaci Escherichia coli Legionella pneumophila Leptospira interrogans Mycoplasma pneumoniae Ochrobactrum antropi Orientia tsutsugamushi Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica Typhi Streptococcus pneumoniae Treponema pallidum Ixodes ricinus Dermacentor marginatus Ripicephalus sanguineus Apodemus sylvaticus ADN humano Control negativo

ORGANISMO

R. aeschlimannii R. akari R. australis R. bellii R. conori R. felis R. helvetica R. rickettsii R. sibirica R. slovaca R. prowazekii R. typhi Negative Control

ORGANISMO

PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA 

S-PHA S-CHA S-EWI S-MCO S-ALS S-BACI S-BOV S-CLAR S-DOSH S-ELIZ S-GRAH2 S-HENS S-KOEH S-QUIN S-SCHO S-TAY S-TRIB S-VIN-A1 S-VIN-A2 S-VIN-B SG-BOR3 S-IS1111 S-TUL SG-RICK SG-SFG SG-TG S-CI2

ESPECIFICIDAD

APLICACIONES

Nuevos patógenos humanos: R. monacensis

10 BLOOD 39 BLOOD 135 SKIN 135 BLOOD 172 PL 469 RBC 469 PL 473 RBC 362 BC 362 RBC 226 PL 226 LEU 175 BC 175 SER

Agente causal: R. conorii Vector: R. sanguineus

23S‐5S rRNA

AY125019-R typhi

99 100

R typhi U11018-R prowazekii AY125009-R slovaca

94 77

SG‐RICK SG‐SFG S‐AESCH S‐AKA3 S‐AUS S‐B29 S‐BEL S‐FEL S‐HELV S‐CON S‐HON S‐RI/SI S‐SIB S‐SLO SG‐TG S‐PROW S‐TYPHI

AY125008-R slovaca AY125015-R honei

50 99

AY125012-R conorii AY125011-R conorii

50 49 99

U11022-R rickettsii AY125014-R Bar29

98 AY125013-R massiliae 79

AY125016-R aeschlimannii AY125017-R helvetica

43 49

362 BC R felis

79

R australis U11015-R bellii

0.05

FIEBRE BOTONOSA  

Nuevos patógenos humanos: R. monacensis

rOmpA Rickettsia spp.

Detección de un patógeno diferente de R. conorii en un  paciente con un cuadro similar a una fiebre botonosa Identificación de R. monacensis  mediante filogenia gltA

Primera vez que se describe a esta especie como patógeno humano

Descripción de 3 casos de R. sibirica mongolotimonae en Elche CASO 1 ‐ Junio 2007: • Mujer 67 años con fiebre, mialgias y lesión en cuero cabelludo de 10 días de evolución. Al ingreso: fiebre, confusión, adenopatías retroauriculares y exantema maculopapular en tronco y extremidades • NO LINFANGITIS • Analítica: Hiponatremia, enzimas hepáticas ↑. Tratamiento: doxiciclina con buena respuesta • PCR de la escara de inoculación POSITIVA. PCR en sangre NEGATIVA • IFI con antígeno de R. sibirica mongolotimonae IgG:1/160 IgM: 1/50 (no suero de fase convaleciente) • Actividad de riesgo: jardinería CASO 2 ‐ Septiembre 2008: • Varón 32 años con fiebre, escalofríos, mialgias y cefalea de 10 días de evolución • A la exploración escara en cara interna de muslo derecho con lifadenopatía regional y linfangitis. Analítica: Hiponatremia, elevación de enzimas hepáticas • Tratamiento con azitromicina, a las 24h exantema en extremidades, palmas y plantas • PCR del aspirado de la adenopatía POSITIVA • Serología (fase aguda y convaleciente) NEGATIVA • Actividad de riesgo: trabajar en un campo de golf CASO 3 ‐ Abril 2010: • Varón 33 años con fiebre, mialgias de 5 días de evolución. A la exploración escara necrótica en región pretibial derecha y linfangitis con adenopatía inginal. • Analítica: Hiponatremia, elevación de enzimas hepáticas • NO EXANTEMA • Tratamiento: doxiciclina con buena evolución • PCR de la escara positiva • Serología (fase aguda y convaleciente): NEGATIVA • Actividad de riesgo: pasear por el campo

CASO 1 CASO 2 CASO 3 R. conorii R. conorii

PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA 

SG‐RICK‐ SG‐SFG‐

SECUENCIACIÓN

CASO 3

CASO 2

CASO 1

S‐SIB‐

rOmpA Nested

23S‐5S rRNA

caso 1‐ NO caso 2‐ HQ710799 caso 3 ‐HQ710800

rOmpA

caso 1‐ HQ728350 caso 2 ‐HQ728351 caso 3 ‐HQ728352

Confirmación de Casos de Tifus Murino en GC

DIAGNÓSTICO MOLECULAR  PARA LA CONFIRMACIÓN DE CASOS HOSPITAL UNIVERSITARIO MATERNO INFANTIL LAS PALMAS DE GRAN CANARIA

DE TIFUS MURINO (2006) EN GRAN CANARIAS

SG‐RICK‐M SG‐RICK  SG‐SFG SG‐TG S‐PROW S‐CON S‐AESCH S‐SIB S‐SLO

Estudio de vectores en Madrid

Estudio de garrapatas de erizo en Barcelona Colaboración con Elena Obon Centre de Recuperació de Fauna de Torreferrussa Santa Perpètua de Mogoda (Barcelona) Generalitat de Catalunya • Tamaño muestral: 99 garrapatas de erizos • Especies analizadas: Ixodes exagonus, Hyalomma lusitanicum, Rhipicephalus spp. R. pusillus y R. turanicus • Positivas: 34% • Especies: R. conorii (1), R. massiliae y R. massiliae Bar 29 (2:1)

EXISTE UN CICLO SILVESTRE DE R. massiliae Bar29 EN LA NATURALEZA ESTUDIO DE VECTORES Y RESERVORIOS

EVALUACIÓN DEL RIESGO

“ESTAMOS FRENTE A AGENTES CON UNA AGRESIVIDAD  QUE ES IMPORTANTE IDENTIFICAR, PREVENIR Y TRATAR” Un proceso febril tras la picadura de una garrapata infectada, con resultados negativos  por PCR en sangre es un hallazgo frecuente La metodología disponible hasta ahora  carecía de sensibilidad en muestras clínicas

Antes... 

Ahora... 

Cuadros clínicos 

Cuadros de evolución GRAVE 

autolimitados

(neurológicos)

CONOCER LA DINÁMICA TEMPORAL DE ESTOS AGENTES EN LOS VECTORES

ESTABLECER ALERTAS Y PREVENIR RIESGOS POSTERIORES

MEJORAR EL NIVEL DE SOSPECHA CLÍNICA

CONCLUSIONES

HEMOS DISEÑADO UN MÉTODO VERDADERAMENTE  GENÉRICO QUE AMPLIFICA CUALQUIER ESPECIE 

PERMITE LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIE  SIN NECESIDAD DE SECUENCIACIÓN

RESULTA 10 VECES MÁS SENSIBLE QUE OTROS MÉTODOS

CONCLUSIONES

MAYOR RAPIDEZ EN EL DIAGNÓSTICO MEJOR PRONÓSTICO PARA LOS PACIENTES MEJOR CONOCIMIENTO DE LAS ESPECIES  QUE CIRCULAN LOCALMENTE DISPONEMOS DE CAPACIDAD PARA IDENTIFICAR  LA CIRCULACIÓN DE CLONES NO AUTÓCTONOS (IMPORTADOS/LIBERACIÓN INTENCIONADA)

DESCRIPCIÓN DE NUEVOS PATÓGENOS/DETECCIÓN DE  PATÓGENOS EMERGENTES

Laboratorio de Espiroquetas y Patógenos Especiales Centro Nacional de Microbiología Majadahonda. Madrid

¡ GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN!