Nuevos enfoques del diagnóstico molecular de las Rickettsiosis
Dra. Isabel Jado García Laboratorio de Espiroquetas y Patógenos Especiales Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III
Diagnóstico de las rickettsiosis Patógenos zoonósicos bacterianos emergentes : ‐ Producen cuadros clínicos inespecíficos Alteraciones hematológicas y bioquímicas (TCP, leuc y enz hep ↑ )
‐ Organismos de cultivo fastidioso ‐ Son agentes de difícil diagnóstico ‐ Enfermedades de baja incidencia
No existen métodos comerciales de detección directa Necesidad de una tipificación más detallada
NIVEL BAJO DE SOSPECHA Y DETECCIÓN DE CASOS
DEFICIENCIAS EN SU ESTUDIO
Necesidad de un abordaje multidisciplinar 1
Grupos de Medioambiente Estudio de la dinámica de vectores y reservorios Obtención de muestras para su estudio (Entomólogos, Zoólogos, Veterinarios, Biólogos)
2
Grupos Clínicos Identificación y estudio de casos humanos y animales Obtención de muestras para su estudio (Médicos y Veterinarios)
3
Grupos de Laboratorio Desarrollo de metodología de detección y caracterización Estudio de muestras recogidas. (Microbiólogos, Biólogos Moleculares, Taxónomos)
Diagnóstico de las Enfermedades Infecciosas
CLÍNICA
EPIDEMIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA
Diagnóstico: Aspectos Clínicos Los principales signos clínicos varían de la especie implicada, los daños tienen un mismo origen y derivan de la vasculitis generalizada por la multiplicación bacteriana en las células endoteliales.
Casos graves con afectación del SNC son relativamente frecuentes. R. conorii (subsp. conorii) 5‐6% formas severas y 2,5% † en pacientes diagnosticados
Además de las fiebres inexplicadas asociadas con neutropenia, trombopenia o elevación de las transaminasas, se debe sospechar una rickettsiosis: Una erupción febril inexplicada del adulto en verano Presencia de lesiones cutáneas necróticas Después de mordedura de garrapata si aparece: ‐ Meningoencefalitis (con serología de borreliosis negativa) ‐ Fiebre a la vuelta de un país tropical o mediterráneo ‐ Fiebre resistente a betalactámicos ‐ Eritema crónico atípico
Vasculitis
Exantema
Escara de inoculación
Evaluación del riesgo El riesgo de que una garrapata transmita una rickettsia y la prevalencia de una determinada infección depende de varios parámetros: 1. La prevalencia de garrapatas infectadas 53,4 % de D. marginatus de Madrid infectados con R. raoultii 0,4 % de I. ricinus del PV infectados con R. monacensis 2. La afinidad de las garrapatas para picar a humanos Prevalencia de FB en países mediterráneos 50/100.000: R. sanguineus ↓ Amblyomma spp ↑↑↑ 3. La abundancia de garrapatas en la zona: factores climáticos y ecológicos
FACTORES CLIMÁTICOS
DISPONIBILIDAD DE ALIMENTOS
DENSIDAD DE MICROMAMÍFEROS
MANTENIMIENTO DE IXÓDIDOS INFECTADOS
Diagnóstico: Aspectos Epidemiológicos LA DISTRIBUCIÓN DE UNA DETERMINADA ESPECIE COINCIDE CON LA DISTRIBUCIÓN DE LA GARRAPATA VECTOR
CASOS HUMANOS
VECTORES RESERVORIOS
LA CIRCULACIÓN DE ESTOS PATÓGENOS SIGUE UN PATRÓN DINÁMICO IMPORTACIÓN ILEGAL DE ANIMALES
AVES MIGRATORIAS
Las rickettsiosis son enfermedades emergentes
Especies de Rickettsia patógenas hasta 1984 R. conorii R. conorii subsp. israelensis R. sibirica R. australis R. prowazekii R. typhi R. rickettsii R. akari
Nuevas especies de Rickettsia patógenas entre 1985 y 2004 R. japonica R. conorii subsp. caspia R. africae R. honei R. sibirica subsp. mongolotimonae R. slovaca R. heilongjiangensis R. aeschlimanii R. parkeri R. massiliae R. marmionii R. felis
¡ 11 especies de rickettsias emergentes ! R. slovaca R. aeschlimannii R. sibirica mongolotimonae R. helvetica R. monacensis
R. sibirica mongolotimonae R. helvetica R. conorii (caspia)
R. japonica
R. parkeri R. heilongjiangensis
R. africae R. aeschlimannii R. sibirica mongolotimonae
R. honei
¡ 11 especies de rickettsias emergentes ! SITUACIÓN EN EUROPA A PARTIR DE 2008
R. typhi R. felis R. conorii conorii R. conorii israelensis
R. helvetica R. massiliae/Bar29
R. conorii caspia R. sibirica mongolotimonae
R. monacensis y otras relacionadas
PATÓGENAS
R. aeschlimanni R. Slovaca
R. raoultii Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
Diagnóstico
CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO (SIM) EN 2009 ‐ AISLAMIENTO ‐ DETECCIÓN DE AG/GENOMA ‐ SEROCONVERSIÓN (IFI)
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL ‐ Sarampión ‐ Meningococemia ‐ Sífilis secundaria ‐ Dengue ‐ Toxicodermias
Modificado de P. Brouqui et al. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108‐1132
Muestras Transporte Tiempo y Temperatura
Conservación Tiempo y Temperatura
PRUEBA DIAGNÓSTICA
MUESTRA
Recogida
Suero
Tubo con tapón de rosca
<24 h, 2‐8 C
+24h, ‐20 C
IFI1
Sangre con EDTA
Recoger en tubo con EDTA
< 24 h, 2‐8 ºC
+24h, ‐20 C
PCR2
Sangre citratada
Recoger en tubo con citrato
< 24 h, 2‐8 ºC
+24h, ‐60/‐80 C (no varias descongelaciones)
PCR, Cultivo4
Sangre heparinizada
Recoger en tubo con heparina
< 24 h, 2‐8 ºC
+24h, ‐60/‐80 C (no varias descongelaciones)
Cultivo
LCR
Recoger en tubo estéril
< 24 h, 2‐8 ºC
+24h, ‐20 C
PCR
Biopsia cutánea
Se recomienda asepsia en la toma de la muestra. Colocar el tejido en un tubo o frasco estéril con suero fisiológico estéril para prevenir la desecación
<24 h, 2‐8 C
+24 h, ‐20 C
Microscopía6 PCR
(escara de la picadura, piel del exantema, pápulas/máculas/ vesículas)
NOTA
El EDTA3 dificulta el cultivo
La heparina5 puede inhibir la PCR
Muestra de la escara de inoculación
Tomado del Procedimiento en Microbiología Clínica (SEIMC): ”Diagnóstico microbiológico de las infecciones por patógenos bacterianos emergentes: Anaplasma, Bartonella, Rickettsia, Tropheryma whipplei. 2007
Procesamiento de las muestras SANGRE
ARTRÓPODOS BIOPSIA CUTÁNEA (4°C 3 días)
PAPEL FILTRO
SUERO
ANTICOAGULANTE
EDTA
CITRATO INMUNODETECCIÓN
SEROLOGÍA
CULTIVO CELULAR EN SHELL‐VIALS
LCR
INMUNOFLUORESCENCIA TINCIÓN DE GIMÉNEZ/ GIEMSA
MÉTODOS BASADOS EN PCR Modificado de P. Brouqui et al. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108‐1132
Diagnóstico serológico El método serológico de referencia es la IFI. Permite el seguimiento de la respuesta inmune específica y conocer la prevalencia de anticuerpos en un área determinada. Existen portaobjetos comerciales sólo para ciertas especies. Necesidad de sueros pareados para demostrar la seroconversión que puede tardar varias semanas o no producirse. FB: sensibilidad 46% (sueros 5‐9 días) y del 100% (sueros después de 29 días) En DEBONEL/TIBOLA y en infecciones por R. sibirica mongolotimonae se han descrito casos (PCR/aislamiento) con serologías negativas. En R. africae se detectan anticuerpos 3‐4 semanas después del inicio de síntomas y la serología negativa en caso de instauración temprana de tratamiento antibiótico.
Diagnóstico serológico Inconveniente: reacciones cruzadas entre las diferentes especies Western blotting (absorción de los sueros con antígenos)
c o n o r i i
a f r i c a e
c o n o r i i
a f r i c a e
c o n o r i i
a f r i c a e
NO absor absor absor R. conorii R. africae Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
Diagnóstico mediante cultivo El diagnóstico definitivo requiere el aislamiento e identificación de la especie a partir del cultivo (días‐semanas) Cultivo en células vero‐E6 ⇒ efecto citopático no es muy característico ni especie‐ específico (5‐7 días) Cultivo en shell‐vial Giménez IFI PCR
7 días
El cultivo es la técnica diagnóstica más específica, fundamental para la obtención de antígenos y para estudiar la sensibilidad a los antibióticos Procedimiento muy laborioso, poco sensible y retrasa la emisión de resultados Las muestras deben cultivarse el día de la extracción o congelarse a ‐80°C ¡CULTIVO EN LABORATORIO BSL3!
VARIOS PASES (20 días)
Diagnóstico molecular
No existen técnicas comercializadas. Los genes más frecuentemente analizados son rOmpA, rOmpB y gltA. PCR‐RLB del espacio intergénico 23S‐5S rRNA permite la identificación de la especie implicada sin necesidad de secuenciación. Este método es válido para muestras clínicas como ambientales. Cuando se precisa mayor sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas.
Dianas más utilizadas
Genes utilizados y especies
Oligonucleótidos
Método
Muestra
Referencia
Citrato sintetasa (gltA) Todas las especies
PCR
Biopsia cutánea Garrapatas
Roux V. et al. Int J Syst Bacteriol 1997
Proteína externa de membrana A
PCR
Biopsia cutánea Garrapatas
Fournier P.E. et al. Int J Syst Bacteriol 1998
(ompA) Todas las especies excepto GT
(ompA)
“PCR suicida”* Suero
Raoult D. et al. N Engl J Med 2001 Fournier P.E. et al. J Clin Microbiol 2004
“PCR suicida”* Suero
*En la PCR anidada “suicida” no se utiliza control positivo y los oligonucleótidos sólo se usan una vez. * En la PCR anidada “suicida” no se utiliza control positivo Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
Dianas más utilizadas
Genes utilizados y especies
Oligonucleótidos
Método
Proteína externa de membrana B Citrato sintetasa (gltA) Todas las especies (ompB) (Todas las especies excepto
PCR
Gen D (mayoría de las especies)
PCR
Gen que codifica la proteina de 17 kDa (todas las especies SFG)
PCR
Muestra Biopsia cutánea Garrapatas
Biopsia cutánea
Biopsia cutánea Garrapatas
PCR PCR Nested
Biopsia cutánea Biopsia cutánea Garrapatas Suero Sangre Garrapatas
Referencia
Roux V. et al. Int J Syst Evol Microbiol 2000
Sekeyova Z. et al. Int J Syst Evol Microbiol 2001 Roux V. et al. Int J Syst Bacteriol 1997
Fournier P.E. et al. T. et al.1998 IntTzianbos J Syst Bacteriol J Cin Microbiol 1989
Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
Filogenia
R. africae Rickettsia sp. “strain S” R. parkeri R. sibirica sibirica R. sibirica mongolotimonae R. conorii conorii R. conorii indica R. conorii caspia R. conorii israelensis R. slovaca R. rickettsii R. honei R. japonica
R.
G R U P O
r i c k e t t s i i
R. massiliae R. massiliae Bar29 GRUPO R. rhipicephali R. massiliae R. aeschlimannii R. montanensis R. helvetica GRUPO R. helvetica R. australis GRUPO R. akari
gltA ompA ompB
gen D
R. canadendis AB bacterium R. belli
GRUPO Ancestral
Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA PARCIAL DE LOS GENES 23S y 5S rRNA Y ESPACIO INTERGÉNICO 23S‐5S AY125017-R_helvetica AY125014-R_Bar29 AY125013-R_massiliae AY125012-R_conorii AY125011-R_conorii AY125015-R_honei AABW01000001-R_sibirica AY125009-R_slovaca AY125008-R_slovaca U11022-R_rickettsii AY125016-R_aeschlimannii R_australis AAFE01000001-R_akari R_felis U11015-R_bellii AY125019-R_typhi U11018-R_prowazekii
SGR-TAGCTCGATTGRTTTACTTTG TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGGTTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGGTTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGGGATTACATATGCATATGGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGGGATTACATATGCGTATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACACATGTATATAGTGTTT TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTGTATATGCATATAGTGTTA TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTATATATGCATATAGTGTTA *********** ************** **** * *** *** *****
DISEÑO DE SONDAS ESPECÍFICAS EN GENES 23S y 5S rRNA Y ESPACIO INTERGÉNICO 23S‐5S R_hel CAGCTTTATCAACTAATAAAGATGTTGTTGCATGACTA--ATGTCATAT-----------CATGGCTTGATCCACGGTA----TCCAGTAAAA---ATTA Bar29 TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATCACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCTAG-AAAA---ATTA R_mass TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATCACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCTAGCAAAA---ATTA R_con TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATATAC---------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAGA---ATTA R_con TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATATAC---------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAGA---ATTA R_hon TAGTTTTATCAACTTATTAAAATGTTATTGCATAACTA--ATTTTATAC-----------TGTAGCCTTG-CCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA R_sib TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA R_slo TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCCTGCCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA R_slo TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGCCCCTGCCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTT R_rick TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC-----------TGTAGTCCTG-CAACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA R_aeschTAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATATTATACTGTA-------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCCAGCAAAA---ATTA R_aus TAGCTTTATCAATGAATAAAGATGTTGTTGCACAGCTA--ATAATGTCATCT--------CGTGGCTTGA-CCACAGTA----TCTAG---C----AGTA R_aka TAGCTTTATCAATGAATAAACATGTTGTTGCACAGCTA--ATAGTGTCATGT--------CGTGGCTTGA-CCAC---------------------AGTA R_fel TAGCTTTACCAATGAATAAAAATGTTGTTGCACAGCTA--ATAATGTTATAC--------CGTGGTCCCG-CCAC---------------------GGTA R_bell TAGCTTTATCAACTAATAAAG-TGTTGTTGCATGATTGTCATCCCGTGGCTTTATTTATATGTCATTCCTGCGAAAGCAGGAGTCTAGTAAAATATAATG TAGCTTTATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTT------TATGT-----------CACGATTTGA-CCGTAA-GA---TC--------------R_ty R_prow TAGCTTTATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTT------TATGT-----------TACGATTTGA-TAGTAA-AG---TTTTG--------ATCT
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA F1
DNA sintético de R. prowazekii
R1
103 pb F2
R2
152 pb F3
R3
224 pb F4
R4
318 pb R4
F5
374 pb
Reacción de ligación Shock térmico Selección de transformantes Purificación de plásmidos Secuenciación
CLONACIÓN
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
Semi‐NESTED MUESTRAS CLÍNICAS
Dilución 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10--8 Copias 103 102 10 1
CONTROL POSITIVO: Clon mutado de R. prowazekii GATAGGTCGGGTGTGGAAGCACAGTAATGTGTGTAGCTAACCGATACTAATAGCTCGATTGRTTTACTTTGCTGTGAGA TTATATATGCATATAGTGTTAATTATATAAGTATTTAAGCATCAATTTGTAAATTATAATTTTAATGTTAAATTAGCTT TATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTTTATGTYACGATTTGATAGTAAAGTTTTGATCTTTCTTTAAGATATTG TAGACAATTGTATATTATACCTTGCTTAAGAATAATATAATAGCATTAACAGCATATTATAATACAACCTATTTTGTTA AATTTGTATTGCTAGCTTGGTGGTCATAGCATGAGTGAAACACACGATCCCATCCCGA SG-Rick TAGCTCGATTGRTTTACTTTG SG-Rick-mut- TAGCTCCCATTAGTTCGGGTG (cambios en negrita) SG-TG-wt GTTATTCTATCGTTTTATGTYACG SG-TG-mut1-GAATAACATACGAAAATAGAATCG (cambiadas A y T) S-PROWTACGATTTGATAGTAAAGTTTTG S-PROW-mut1-ATCGTAAAGTATGATTTGAAAAG (cambiadas A y T)
Comparativa entre 23S‐5S rRNA y rOmpA
rOmpA
23S-5S rRNA
1ª PCR nested
1ª PCR seminested
532 pb
427 pb
Dilución 10‐3 10‐4 10‐5 10‐3 10‐4 10‐5 10‐6
374 pb
Dilución 10‐610‐510‐410‐3 C‐10‐610‐510‐410‐3C‐ Copias 1 10 102 103
Fournier P.E. et al. Int J Syst Bacteriol 1998
10 VECES MAYOR SENSIBILIDAD!!!
Diagnóstico molecular en el Lab de Espiroquetas y Patógenos Especiales PCR‐HIBRIADCIÓN EN FASE REVERSA (RLB) del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
A
Fijación de las sondas
C
B
Incubación con productos de PCR
Revelado de la reacción DETERMINACIÓN DE LA ESPECIE IMPLICADA (SIN NECESIDAD DE SECUENCIACIÓN)
SONDAS
S-CI2 SG-RICK SG-SFG S-AESCH S-AKA3 S-AUS S-BELL S-CON S-FEL S-HELV S-RI/SI S-SLO SG-TG S-PROW S-TYPHI S-CI2 SONDAS
Brucella mellitensis Chlamydia pneumoniae C. psittaci Escherichia coli Legionella pneumophila Leptospira interrogans Mycoplasma pneumoniae Ochrobactrum antropi Orientia tsutsugamushi Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica Typhi Streptococcus pneumoniae Treponema pallidum Ixodes ricinus Dermacentor marginatus Ripicephalus sanguineus Apodemus sylvaticus ADN humano Control negativo
ORGANISMO
R. aeschlimannii R. akari R. australis R. bellii R. conori R. felis R. helvetica R. rickettsii R. sibirica R. slovaca R. prowazekii R. typhi Negative Control
ORGANISMO
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
S-PHA S-CHA S-EWI S-MCO S-ALS S-BACI S-BOV S-CLAR S-DOSH S-ELIZ S-GRAH2 S-HENS S-KOEH S-QUIN S-SCHO S-TAY S-TRIB S-VIN-A1 S-VIN-A2 S-VIN-B SG-BOR3 S-IS1111 S-TUL SG-RICK SG-SFG SG-TG S-CI2
ESPECIFICIDAD
APLICACIONES
Nuevos patógenos humanos: R. monacensis
10 BLOOD 39 BLOOD 135 SKIN 135 BLOOD 172 PL 469 RBC 469 PL 473 RBC 362 BC 362 RBC 226 PL 226 LEU 175 BC 175 SER
Agente causal: R. conorii Vector: R. sanguineus
23S‐5S rRNA
AY125019-R typhi
99 100
R typhi U11018-R prowazekii AY125009-R slovaca
94 77
SG‐RICK SG‐SFG S‐AESCH S‐AKA3 S‐AUS S‐B29 S‐BEL S‐FEL S‐HELV S‐CON S‐HON S‐RI/SI S‐SIB S‐SLO SG‐TG S‐PROW S‐TYPHI
AY125008-R slovaca AY125015-R honei
50 99
AY125012-R conorii AY125011-R conorii
50 49 99
U11022-R rickettsii AY125014-R Bar29
98 AY125013-R massiliae 79
AY125016-R aeschlimannii AY125017-R helvetica
43 49
362 BC R felis
79
R australis U11015-R bellii
0.05
FIEBRE BOTONOSA
Nuevos patógenos humanos: R. monacensis
rOmpA Rickettsia spp.
Detección de un patógeno diferente de R. conorii en un paciente con un cuadro similar a una fiebre botonosa Identificación de R. monacensis mediante filogenia gltA
Primera vez que se describe a esta especie como patógeno humano
Descripción de 3 casos de R. sibirica mongolotimonae en Elche CASO 1 ‐ Junio 2007: • Mujer 67 años con fiebre, mialgias y lesión en cuero cabelludo de 10 días de evolución. Al ingreso: fiebre, confusión, adenopatías retroauriculares y exantema maculopapular en tronco y extremidades • NO LINFANGITIS • Analítica: Hiponatremia, enzimas hepáticas ↑. Tratamiento: doxiciclina con buena respuesta • PCR de la escara de inoculación POSITIVA. PCR en sangre NEGATIVA • IFI con antígeno de R. sibirica mongolotimonae IgG:1/160 IgM: 1/50 (no suero de fase convaleciente) • Actividad de riesgo: jardinería CASO 2 ‐ Septiembre 2008: • Varón 32 años con fiebre, escalofríos, mialgias y cefalea de 10 días de evolución • A la exploración escara en cara interna de muslo derecho con lifadenopatía regional y linfangitis. Analítica: Hiponatremia, elevación de enzimas hepáticas • Tratamiento con azitromicina, a las 24h exantema en extremidades, palmas y plantas • PCR del aspirado de la adenopatía POSITIVA • Serología (fase aguda y convaleciente) NEGATIVA • Actividad de riesgo: trabajar en un campo de golf CASO 3 ‐ Abril 2010: • Varón 33 años con fiebre, mialgias de 5 días de evolución. A la exploración escara necrótica en región pretibial derecha y linfangitis con adenopatía inginal. • Analítica: Hiponatremia, elevación de enzimas hepáticas • NO EXANTEMA • Tratamiento: doxiciclina con buena evolución • PCR de la escara positiva • Serología (fase aguda y convaleciente): NEGATIVA • Actividad de riesgo: pasear por el campo
CASO 1 CASO 2 CASO 3 R. conorii R. conorii
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
SG‐RICK‐ SG‐SFG‐
SECUENCIACIÓN
CASO 3
CASO 2
CASO 1
S‐SIB‐
rOmpA Nested
23S‐5S rRNA
caso 1‐ NO caso 2‐ HQ710799 caso 3 ‐HQ710800
rOmpA
caso 1‐ HQ728350 caso 2 ‐HQ728351 caso 3 ‐HQ728352
Confirmación de Casos de Tifus Murino en GC
DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA LA CONFIRMACIÓN DE CASOS HOSPITAL UNIVERSITARIO MATERNO INFANTIL LAS PALMAS DE GRAN CANARIA
DE TIFUS MURINO (2006) EN GRAN CANARIAS
SG‐RICK‐M SG‐RICK SG‐SFG SG‐TG S‐PROW S‐CON S‐AESCH S‐SIB S‐SLO
Estudio de vectores en Madrid
Estudio de garrapatas de erizo en Barcelona Colaboración con Elena Obon Centre de Recuperació de Fauna de Torreferrussa Santa Perpètua de Mogoda (Barcelona) Generalitat de Catalunya • Tamaño muestral: 99 garrapatas de erizos • Especies analizadas: Ixodes exagonus, Hyalomma lusitanicum, Rhipicephalus spp. R. pusillus y R. turanicus • Positivas: 34% • Especies: R. conorii (1), R. massiliae y R. massiliae Bar 29 (2:1)
EXISTE UN CICLO SILVESTRE DE R. massiliae Bar29 EN LA NATURALEZA ESTUDIO DE VECTORES Y RESERVORIOS
EVALUACIÓN DEL RIESGO
“ESTAMOS FRENTE A AGENTES CON UNA AGRESIVIDAD QUE ES IMPORTANTE IDENTIFICAR, PREVENIR Y TRATAR” Un proceso febril tras la picadura de una garrapata infectada, con resultados negativos por PCR en sangre es un hallazgo frecuente La metodología disponible hasta ahora carecía de sensibilidad en muestras clínicas
Antes...
Ahora...
Cuadros clínicos
Cuadros de evolución GRAVE
autolimitados
(neurológicos)
CONOCER LA DINÁMICA TEMPORAL DE ESTOS AGENTES EN LOS VECTORES
ESTABLECER ALERTAS Y PREVENIR RIESGOS POSTERIORES
MEJORAR EL NIVEL DE SOSPECHA CLÍNICA
CONCLUSIONES
HEMOS DISEÑADO UN MÉTODO VERDADERAMENTE GENÉRICO QUE AMPLIFICA CUALQUIER ESPECIE
PERMITE LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIE SIN NECESIDAD DE SECUENCIACIÓN
RESULTA 10 VECES MÁS SENSIBLE QUE OTROS MÉTODOS
CONCLUSIONES
MAYOR RAPIDEZ EN EL DIAGNÓSTICO MEJOR PRONÓSTICO PARA LOS PACIENTES MEJOR CONOCIMIENTO DE LAS ESPECIES QUE CIRCULAN LOCALMENTE DISPONEMOS DE CAPACIDAD PARA IDENTIFICAR LA CIRCULACIÓN DE CLONES NO AUTÓCTONOS (IMPORTADOS/LIBERACIÓN INTENCIONADA)
DESCRIPCIÓN DE NUEVOS PATÓGENOS/DETECCIÓN DE PATÓGENOS EMERGENTES
Laboratorio de Espiroquetas y Patógenos Especiales Centro Nacional de Microbiología Majadahonda. Madrid
¡ GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN!
