PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, ULTRAVIOLET PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI PADA EKSTRAK ETANOLIK DAUN PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Setio Agustin NIM : 118114181

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015



SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Setio Agustin NIM : 118114181

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

i


Persetujuan Pembimbing


Skripsi yang diajukan oleh : Setio Agustin NIM : 118114181

telah disetujui oleh :

Pembimbing Utama

Dr. rer. nat. Yosi Bayu Murti, Apt.

tanggal 19 Juni 2015

ii


Pengesahan

iii


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama

: Setio Agustin

Nomor mahasiswa

: 118114181

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, ULTRAVIOLET PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI PADA EKSTRAK ETANOLIK DAUN PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban.) Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal 19 Juni 2015 Yang menyatakan

Setio Agustin

iv


Halaman Persembahan

Aku persembahkan karyaku ini untuk: Tuhan Yesus dan Bunda Maria, Keluargaku dan Aditya Tri Saputra tersayang Almamaterku tercinta

v


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi peraturan perundang-undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 19 Juni 2015 Penulis

Setio Agustin

vi


PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat anugerah dan perlindungan, kasih dan sayang, serta tuntunan yang diberikan sehingga

skripsi

berjudul

“ISOLASI

DAN

IDENTIFIKASI

GOLONGAN SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, ULTRAVIOLET PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI PADA EKSTRAK ETANOLIK DAUN PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban.)” dapat terselesaikan dengan baik dan lancar. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak terlepas dari berbagai pihak. Kesempatan ini, penulis pergunakan untuk mengungkapkan rasa terima kasih kepada: 1.

Ibu Aris Widayati, M. Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2.

Bapak Dr. rer. nat. Yosi Bayu Murti, Apt. selaku Dosen Pembimbing Skripsi yang telah membimbing, mendampingi dan memberikan arahan, evaluasi serta kritik dan saran mulai dari pembuatan proposal penelitian hingga penulisan skripsi ini selesai.

3.

Bapak Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Penguji yang telah meluangkan waktu untuk memberikan kritik dan saran selama penulisan skripsi.

4.

Ibu Damiana Sapta Candrasari, S. Si., M. Sc. selaku Dosen Penguji yang telah meluangkan waktu untuk memberi kritik dan saran selama penulisan skripsi.

vii


5.

Bapak Yohanes Dwiatmaka, M. Si. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang selalu memberikan motivasi dan bimbingan selama mengikuti perkuliahan.

6.

Ibu Agustina Setiawati, M. Sc., Apt. selaku Kepala Penanggungjawab Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan ijin dalam penggunaan semua fasilitas laboratorium untuk kepentingan penelitian skripsi.

7.

Bapak Wagiran, Bapak Mukminin, Bapak Bimo, Bapak Parlan, serta semua laboran yang telah membantu selama proses penelitian di laboratorium.

8.

Elyn Prameswari, Agustine Kurniawaty, Surya Adhi Nugraha, dan Skolastika Feranda atas bantuannya baik tenaga maupun ide-ide cemerlangnya serta motivasi dalam suka dan duka selama penelitian di laboratorium.

9.

Teman-teman FST dan FKK 2011 atas doa dan dukungan.

10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan baik. Penulis menyadari bahwa naskah skripsi ini masih banyak kekurangan dengan keterbatasan yang ada sehingga penulis membuka diri terhadap semua kritik dan saran dari semua pihak yang membangun untuk kemajuan diri dan ilmu pengetahuan. Akhir kata, penulis berharap semoga naskah skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama di Bidang Farmasi.

Penulis

viii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .......................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN...............................................................................v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................ vi PRAKATA ......................................................................................................... vii DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiv INTISARI

..........................................................................................................xv

ABSTRACT ........................................................................................................ xvi BAB I PENGANTAR ..............................................................................................1 A. Latar Belakang ................................................................................................1 1. Rumusan masalah ..................................................................................... 3 2. Keaslian penelitian .................................................................................... 3 3. Manfaat penelitian .................................................................................... 5 B. Tujuan Penelitian ............................................................................................6 1. Tujuan umum ............................................................................................ 6 2. Tujuan khusus ........................................................................................... 6 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................7 A. Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) ..........................................................7 1. Klasifikasi tanaman................................................................................... 7 2. Uraian tanaman ......................................................................................... 7 3. Kandungan kimia ...................................................................................... 8 B. Polifenolik ......................................................................................................9 C. Flavonoid ........................................................................................................9

ix


D. Triterpenoid ..................................................................................................10 E. Ekstraksi .......................................................................................................10 1. Maserasi .................................................................................................. 10 2. Triturasi ................................................................................................... 11 F. Kromatografi ................................................................................................11 1. Kromatografi lapis tipis .......................................................................... 12 2. Kromatografi kolom................................................................................ 13 G. Antioksidan dan Uji Aktivitas Penangkap Radikal Bebas ...........................13 1. Radikal bebas .......................................................................................... 13 2. Antioksidan ............................................................................................. 14 H. UV Protection dan Uji Aktivitas UV Protection .........................................15 I. Antibakteri ....................................................................................................17 1. Bioautografi ............................................................................................ 18 2. Disc Diffusion ......................................................................................... 19 J. Landasan Teori .............................................................................................19 K. Hipotesis .......................................................................................................20 BAB III METODE PENELITIAN.........................................................................21 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................................21 B.Bahan dan Alat Penelitian .............................................................................21 1. Bahan ...................................................................................................... 21 2. Alat .......................................................................................................... 22 C.Tata Cara Penelitian .......................................................................................22 1. Alur pengerjaan penelitian ..................................................................... 22 2. Penyiapan simplisia ................................................................................ 23 3. Perhitungan susut pengeringan simplisia ................................................ 23 4. Ekstraksi.................................................................................................. 23 5. Susut pengeringan ekstrak ...................................................................... 24 6. Uji kualitatif golongan senyawa ............................................................. 24 7. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas ekstrak dan isolat ........ 25 8. Optimasi ketinggian lampu UV dan waktu perlakuan ............................ 25 9. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak dan isolat ........................ 26

x


10.Uji kualitatif aktivitas antibakteri ........................................................... 27 11.Isolasi senyawa aktif ............................................................................... 29 12.Alur pengerjaan isolasi senyawa aktif .................................................... 30 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................31 A. Penyiapan Bahan, Penyerbukan dan Susut Pengeringan Serbuk Simplisia Daun Pegagan ...............................................................................31 B. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Pegagan.................................................33 C. Optimasi Fase Gerak ....................................................................................36 D. Uji Kualitatif Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas Ekstrak Etanolik .......37 E. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Ekstrak Etanolik .............................40 F. Uji Kualitatif Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanolik Menggunakan Metode Bioautografi .....................................................................................45 G. Isolasi Senyawa Aktif Pada Ekstrak Etanolik Daun Pegagan ......................50 1. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas isolat ........................... 53 2. Uji kualitatif aktivitas UV protection isolat............................................ 55 3. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat menggunakan Metode Disc Diffusion.................................................................................................. 58 4. Uji kualitatif identifikasi senyawa aktif pada ekstrak etanolik dan isolat menggunakan reagen semprot................................................................. 63 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................71 A. Kesimpulan ...................................................................................................71 B. Saran .............................................................................................................71 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................72 LAMPIRAN ..........................................................................................................75 BIOGRAFI PENULIS .........................................................................................101

xi


DAFTAR TABEL

Tabel 1.

Uji Kualitatif Aktivitas Penangkap Radikal Bebas Ekstrak Etanolik .............................................................................................40

Tabel 2.

Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Ekstrak Etanolik .................44

Tabel 3.

Simpangan deviasi (SD) pengukuran uji kualitatif UV Protection pada ekstrak etanolik.......................................................45

Tabel 4.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak terhadap bakteri E. coli menggunakan Metode Bioautografi ...........................................48

Tabel 5.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak terhadap bakteri S. aureus menggunakan Metode Bioautografi ......................................50

Tabel 6.

Uji Kualitatif Aktivitas Penangkap Radikal Bebas Isolat 1 ..............54

Tabel 7.

Uji Kualitatif Aktivitas Penangkap Radikal Bebas Isolat 2 ..............55

Tabel 8.

Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Isolat 1 ................................57

Tabel 9.

Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Isolat 2 ................................58

Tabel 10.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat 1 terhadap bakteri S. aureus................................................................................................60

Tabel 11.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat 2 terhadap bakteri S. aureus................................................................................................61

Tabel 12.

Klasifikasi kekuatan aktivitas antibakteri .........................................61

Tabel 13.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri Amoxicillin terhadap bakteri S. aureus............................................................................................63

Tabel 14.

Identifikasi Golongan Senyawa Isolat 1 dan isolat 2 menggunakan Reagen Semprot dan Aktivitasnya ............................70

xii


DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Senyawa radikal bebas DPPH dan Senyawa DPPH non radikal ......15

Gambar 2.

Bagan alur pengerjaan penelitian ......................................................22

Gambar 3.

Bagan alur pengerjaan isolasi senyawa aktif ....................................30

Gambar 4.

Bagan rendemen ...............................................................................36

Gambar 5.

Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh senyawa antioksidan ........................................................................................38

Gambar 6.

Uji kualitatif aktivitas antioksidan menggunakan DPPH semprot..............................................................................................39

Gambar 7.

Grafik hasil optimasi ketinggian lampu UV dalam pengujian aktivitas UV protection.....................................................................42

Gambar 8.

Uji kualitatif UV protection pada ekstrak etanolik ...........................43

Gambar 9.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak etanolik terhadap bakteri E. coli ...................................................................................48

Gambar 10. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak etanolik terhadap bakteri S. aureus menggunakan metode bioautografi .......................49 Gambar 11. Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Isolat 1 dan Isolat 2 ................53 Gambar 12. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Isolat 1 dan Isolat 2 ............56 Gambar 13. Uji kualitatif aktivitas antibakteri Isolat 1 terhadap bakteri S. aureus................................................................................................59 Gambar 14. Uji kualitatif aktivitas antibakteri Isolat 2 terhadap bakteri S. aureus................................................................................................60 Gambar 15. Uji kualitatif aktivitas antibakteri Amoxicillin terhadap bakteri S. aureus............................................................................................62 Gambar 16. Identifikasi golongan senyawa menggunakkan reagen semprot .......64 Gambar 17. Identifikasi golongan senyawa isolat 1 menggunakan reagen semprot ..........................................................................................68 Gambar 18. Identifikasi golongan senyawa isolat 2 menggunakan reagen semprot .........................................................................................69

xiii


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1.

Formula kosmetik tradisional .........................................................76

Lampiran 2.

Simplisia kering herba Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) ............................................................................................77

Lampiran 3.

Surat keterangan pembelian dan determinasi tanaman Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) .........................................78

Lampiran 4.

Perhitungan susut pengeringan serbuk simplisia kering ................80

Lampiran 5.

Perhitungan berat serbuk simplisia untuk ekstraksi .......................81

Lampiran 7.

Sertifikat hasil uji bakteri Staphylococcus aureus ATCC25923 ...................................................................................84

Lampiran 8.

Sertifikat hasil uji bakteri Eschericia coli ATCC 25922 ................85

Lampiran 9. Rangkaian alat lampu UV pada pengujian aktivitas UV protection........................................................................................86 Lampiran 10. Alat pengukur intensitas cahaya lampu UV ...................................87 Lampiran 11. Indikator warna untuk pembanding warna pada uji aktivitas UV protection .................................................................................88 Lampiran 12. Optimasi intensitas cahaya lampu UV ...........................................89 Lampiran 13. Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanolik daun pegagan terhadap bakteri Eschericia coli metode bioautografi .....90 Lampiran 14. Hasil pengujian antibakteri ekstrak etanolik daun pegagan terhadap bakteri Staphyloccocus aureus metode bioautografi .......91 Lampiran 15. Hasil fraksinasi yang didapat dengan cara triturasi ........................92 Lampiran 16. Hasil pemisahan fraksi dengan kromatografi lapis tipis .................93 Lampiran 17. Proses dan Hasil kromatografi kolom Lampiran 18. Hasil KLT isolat .......................................................................................94 Lampiran 18. Hasil KLT isolat .............................................................................95 Lampiran 19. Hasil pengujian antibakteri isolat 1 terhadap bakteri S. aureus .....96 Lampiran 20. Hasil pengujian antibakteri isolat 2 terhadap bakteri S. aureus .....97 Lampiran 21. Hasil pengujian aktivitas UV protection isolat 1 ...........................98 Lampiran 22. Hasil pengujian aktivitas UV protection isolat 2 ...........................99 Lampiran 23. Hasil uji identifikasi golongan senyawa pada ekstrak etanolik daun pegagan ................................................................................100

xiv


INTISARI Tanaman pegagan adalah salah satu contoh tanaman yang digunakan dalam produk kosmetik tradisional berupa masker wajah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri pada ekstrak etanolik daun pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.). Ekstrak daun pegagan dibuat menggunakan pelarut etanol 90% v/v dengan metode maserasi. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan untuk mengetahui bercak senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak etanolik. Uji aktivitas penangkap radikal bebas dilakukan menggunakan metode DPPH, UV protection menggunakan metode inhibition of bleaching of 𝛽- caroten, dan antibakteri menggunakan metode bioautografi kontak. Senyawa aktif diisolasi menggunakan kromatografi kolom sehingga didapatkan 2 isolat aktif yang kemudian diuji kembali aktivitas penangkap radikal bebas dengan metode DPPH, UV protection dengan metode inhibition of bleaching of 𝛽- karoten , dan antibakteri menggunakan metode disc diffusion. Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun pegagan memiliki aktivitas penangkap radikal bebas pada senyawa dengan Rf 0,14; 0,36; 0,46; 0,75; 0,88; 0,92. Senyawa yang memiliki aktivitas UV proteksi terdapat pada Rf 0,14-0,20 dan 0,73-0,74. Senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri S. aureus terdapat pada Rf 0,16-0,17; 0,210,23; 0,29-0,34; 0,51-0,53. Isolat 1 dan isolat 2 yang didapat memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dan isolat kedua memiliki aktivitas antibakteri, tetapi kedua isolat tidak memiliki aktivitas UV protection. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa kedua isolat merupakan golongan senyawa terpenoid. Kata kunci : ekstrak etanolik daun pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.), kromatografi, penangkap radikal bebas, DPPH, UV proteksi, antibakteri.

xv


ABSTRACT Pegagan is one example of a plant used in the traditional cosmetics product of a face masker. This research aims to identification of active principle that have activity free radical scavenger , UV protection , and antibacterial in ethanolic pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) leaf extract. C. asiatica leaf extract prepared using ethanol 90% v/v with maceration method. Thin Layer Chromatography (TLC) was conducted to determine spott of active compound contained in the ethanolic extracts. Activity of free radical scavenger was tested by DPPH method, UV protection using a method of inhibition of bleaching of β-carotene , and antibacterial using bioautografi contact method. The active compound were isolated using column chromatography to obtain 2 isolates active then tested again activity of free radical scavenger with DPPH method , UV protection by inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial use disc diffusion method. The research results showed that ethanolic pegagan leaves extract have antioxidant activity in a compound with Rf 0,14; 0.36; 0,46; 0.75; 0,88; 0.92. Compounds that have UV protection activities Rf 0.14-0.20 and Rf 0.73-0.74. Compounds that have antibacterial activity against S. aureus bacteria Rf 0.160.17; 0.21-0.23; 0.29-0.34; 0.51-0.53. Isolate 1 and isolate 2 presented activity as free radical scavenger and the second isolate have antibacterial activity, but both of isolates did not have UV protection activities. Isolates identified as terpenoid compound. Keywords : ethanolic pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) leaf extract, chromatography, free radical scavenger, DPPH, UV protection, antibacterial.

xvi


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kosmetik adalah setiap bahan yang dibutuhkan untuk digunakan dengan cara mengoleskan, menaburkan, maupun cara mengaplikasikan pada tubuh manusia lainnya untuk membersihkan, mempercantik, meningkatkan daya tarik, mengubah penampilan tubuh manusia, dan yang terpenting adalah untuk kesehatan kulit dan rambut di mana saat diaplikasikan pada tubuh akan memberikan sensasi segar (Mitsui, 1997). Dalam kehidupan sehari-hari, masyarakat tidak dapat terlepas dengan penggunaan kosmetik. Kosmetik digunakan tidak hanya untuk menunjang penampilan seseorang, tetapi juga dipergunakan untuk melindungi tubuh bagian luar dari bahaya polusi, debu, dan sinar UV yang semakin meningkat. Polusi dan sinar UV dapat membentuk radikal bebas yang berbahaya bagi tubuh terutama pada bagian kulit sehingga dapat mengakibatkan terjadinya penuaan dini. Debu yang menempel pada kulit, jika tidak dibersihkan maka dapat mengakibatkan timbulnya jerawat dan akan diperparah dengan adanya infeksi bakteri. Meningkatnya permintaan pasar terhadap produk kosmetik, memicu industri kosmetik berlomba–lomba untuk memproduksi produk kosmetik yang harganya dapat dijangkau oleh masyarakat. Kondisi inilah yang sering kali dimanfaatkan oleh produsen “nakal” untuk memproduksi produk kosmetik menggunakan bahan kimia berbahaya sehingga produk dapat dijual dengan harga yang murah.

1


2

Produk kosmetik berbahaya ini sangat memberikan dampak negatif bagi penggunanya baik yang terlihat langsung dari penggunaan jangka pendek maupun efeknya yang timbul dalam penggunaan jangka panjang. Menurut Pusat Informasi Kosmetik Berbahaya di Indonesia (2013), penggunaan kosmetik berbahaya dapat menyebabkan gangguan pernapasan, kerusakan bagian tubuh, kanker, tumor, dan kerusakan sel otak. Menurut Ratnadita (2012), kasus efek samping penyakit kulit yang ditemui di Yogyakarta, 40% dikarenakan penggunaan produk kosmetik berbahaya. Akibat produk kosmetik yang berbahaya inilah, penggunaan herbal dan jamu di masyarakat mulai kembali populer tidak hanya untuk pengobatan dan pencegahan tetapi berkembang sebagai bahan kosmetik yang berfungsi untuk mempertahankan atau meningkatkan kecantikan khususnya bagi kaum wanita (Yuliarti, 2010). Masyarakat pun mulai kembali menggunakan kosmetik yang terbuat dari bahan alam di mana resiko bahaya yang timbul minimum dan relatif aman. Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) adalah salah satu tanaman obat Indonesia yang secara tradisional digunakan oleh penduduk untuk menyembuhkan luka, anemia, asma, bronkitis, selulit, kolera, konstipasi, diare, dll. (WHO, 1999). Seiring perkembangan jaman yang semakin modern, tanaman pegagan telah banyak digunakan sebagai bahan pembuatan pada beberapa produk kosmetik di pasaran yang diklaim dapat merawat kulit agar tetap halus dan mengatasi jerawat. Hal ini didukung dengan adanya aktivitas antioksidan dan dapat meningkatkan jumlah kolagen pada kulit (Bylka, Znajdek-Awiżeń, Studzińska-Sroka, dan


3

Brzezińska, 2013). Pegagan juga banyak digunakan sebagai bahan kosmetik karena memiliki aktivitas antibakterial yang terdapat pada kulit (Kedzia, Kozlowska, Furnamowa, Mikolajczak, Kedzia, dan Kozaryn, 2007). Besarnya manfaat dari tanaman pegagan ini maka penelitian ini dilakukan untuk mengetahui

adanya

aktivitas

penangkap

radikal

bebas

1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl (DPPH), UV protection, dan antibakteri serta dapat mengetahui golongan senyawa aktif yang bertanggungjawab terhadap adanya aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri pada ekstrak etanolik daun pegagan. 1. Rumusan masalah a. Apakah ekstrak etanolik daun pegagan memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri? b. Golongan senyawa apa saja yang bertanggungjawab terhadap aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri pada ekstrak etanolik daun pegagan? 2. Keaslian penelitian Sejauh pengamatan penulis, penelitian terhadap daun pegagan sudah pernah dilakukan oleh Rahman et al. (2013) untuk menguji aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol, ekstrak etanolik 50%, dan ekstrak air dari tanaman pegagan menggunakan metode DPPH scavenging activity. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik 50% memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi daripada ekstrak tanaman lainnya. Penelitian aktivitas antioksidan menggunakan


4

metode DPPH scavenging activity juga pernah dilakukan oleh Kedzia et al. (2013) menggunakan ekstrak etanolik 30% dan 60%. Tidak hanya aktivitas antioksidan yang mendukung daun pegagan dapat dijadikan sebagai bahan kosmetik tetapi juga potensi ekstrak pegagan yang telah diteliti oleh Zaidan (2005) yang menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap S. aureus dan Methycillin Resistant S. aureus (MRSA) menggunakan metode difusi. Aktivitas antibakteri juga pernah diteliti menggunakan metode dilusi oleh Kedzia et al. (2013) yang menunjukkan bahwa ekstrak etanolik 30% dapat menghambat bakteri S. aureus. Penelitian terhadap analisis kualitatif kandungan kimia yang terdapat pada bagian akar dan daun dari pegagan menggunakan kromatografi lapis tipis juga pernah dilakukan oleh Biradar dan Rachetti (2013) di mana bagian akar dan daun pegagan diekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol absolut selama 72 jam. Ekstrak dianalisis menggunakan kromatografi lapis tipis dengan berbagai sistem fase gerak yaitu metanol : amonium hidroksida (17:3 v/v), kloroform : metanol (18:2 v/v), kloroform : asam asetat glasial : metanol : air (6:2:2:1 v/v), benzena : etil asetat (1:1 v/v). Dari penelitian yang sudah ada, sejauh studi pustaka yang telah terkumpul perbedaan penelitian yang dilakukan oleh penulis terletak pada pengumpulan bahan yang diteliti di mana simplisia tanaman pegagan didapat dari B2P2TOOT. Ekstrak yang digunakan yaitu ekstrak etanolik 90% v/v belum pernah ada penelitian yang melakukan uji aktivitasnya. Selain itu, belum pernah dilakukan


5

penelitian menggunakan kromatografi lapis tipis dengan fase gerak kloroform : metanol (95:5 v/v) untuk melakukan skrining senyawa aktif antioksidan, UV proteksi dan antibakteri. Pada daun pegagan juga belum pernah ada yang melakukan menggunakan metode metode penghambat pemutihan (inhibition of bleaching of 𝛽-caroten) untuk menguji aktivitas UV protection. Selain itu, belum pernah dilakukan skrining senyawa aktif antibakteri ekstrak etanolik daun pegagan menggunakan metode bioautografi. Isolasi senyawa aktif pada ekstrak etanol 90% menggunakan kromatografi kolom dengan cara step gradient chromatography dan menguji aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan metode DPPH, UV protection menggunakan metode inhibition of bleaching of 𝛽caroten, antibakteri menggunakan metode disc diffusion, dan menguji golongan senyawa isolat aktif yang didapat secara kualitatif belum pernah dilakukan. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Hasil penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi senyawa aktif pada ekstrak daun pegagan yang mampu memberikan aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri. Informasi hasil penelitian diharapkan dapat menambah ilmu pengetahuan di Bidang Farmasi terkait penggunaan kosmetik tradisional.


6

b. Manfaat praktis Hasil penelitian ini diharapkan mampu membuktikan keefektifitasan tanaman pegagan sehingga dapat meningkatkan pemanfaatannya sebagai bahan kosmetik tradisional yang berkualitas.

B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Tujuan umum dari penelitian ini adalah mengetahui aktivitas dan golongan senyawa aktif penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri yang terdapat pada ekstrak etanolik daun pegagan sehingga dapat dibuktikan khasiatnya sebagai bahan kosmetik. 2. Tujuan khusus Tujuan khusus dari penelitian ini adalah sebagai berikut. a.

Mengetahui golongan senyawa isolat aktif dari ekstrak etanolik daun pegagan dalam menghambat aktivitas radikal bebas DPPH.

b.

Mengetahui golongan senyawa isolat aktif dari ekstrak etanolik daun pegagan yang dapat melindungi β-karoten dan menghambat efek paparan sinar UV.

c.

Mengetahui golongan senyawa isolat aktif dari ekstrak etanolik daun pegagan yang dalam menghambat aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dan Eschericia coli.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA A. Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) 1. Klasifikasi tanaman menurut United States Departement of Agriculture : Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Superdivision

: Spermatophyta

Division

: Mangnoliophyta

Class

: Dicotyledoneae

Subclass

: Rosidae

Ordo

: Apiales

Family

: Apiaceae

Genus

: Centella

Species

: Centella asiatica (L.). Urb.

Nama Indonesia : Pegagan 2. Uraian tanaman Pegagan yang biasa disebut kaki kuda merupakan herba tahunan tanpa batang dan memiliki stolon – stolon yang melata dengan daun tunggal tersusun dalam roset yang terdiri dari dua sampai sepuluh daun, kadang-kadang agak

7


8

berambut. Panjang tangkai daun mencapai 50 mm, helai daun berbentuk ginjal, lebar dan bundar dengan garis tengah 1-7 cm, dan tepi daun beringgit (Depkes RI, 2009). Pegagan banyak hidup di daerah tropis, sub-tropis, dan dapat berkembang subur di daerah lembab seperti daerah berawa di India, Sri Lanka, Madagaskar, Afrika, Australia, China, Indonesia, Malaysia, Australia, Afrika Selatan dan Tengah (James dan Dubery, 2009). 3. Kandungan kimia

Ekstrak tanaman pegagan memiliki aktivitas biologis, khususnya penyembuhan luka yang berhubungan dengan antimikroba, antiinflamasi, antioksidan, dan imunostimulan. Aktivitas tersebut ditimbulkan dengan adanya respon dari derivat triterpenoid yaitu asam asiatat dan asiatikosida, fenolik, flavonoid, dan minyak atsiri (Kedzia, et. al., 2007). Ekstrak etanolik 50% tanaman pegagan mengandung polifenolik 45 μg/mg ekstrak, flavonoid 14,6 μg/mg ekstrak, β-karoten 0,7 μg/mg ekstrak, tanin 59,7 μg/mg ekstrak, Vitamin C 9,5 μg/mg ekstrak (Rahman, 2013). Komposisi terpenting yang diisolasi dari tanaman pegagan adalah centelloida yang merupakan saponin triterpenoid pentasilklik. Komponen penting lainnya yang memiliki aktivitas farmakologis adalah centelosida, seperti ; asiatikosida, madekosida, asam asiatat dan asam madekasat. Centelosida lainnya yang terdapat dalam tanaman pegagan adalah asam triterpenat, seperti ; asam brahmat, asam madasiatat, asam termolat, dan asam centellat yang sama baiknya


9

dalam bentuk glikosidanya yaitu brahminosida, madasiatikosida dan centellosida (Bylka, et. al., 2013). Aktivitas antibakteri dalam tanaman pegagan karena adanya kandungan saponin triterpenoid pentasiklik, terutama asam asiatat dan asam madekasat (James dan Dubery, 2009). Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Kedzia (2013), pada ekstrak etanolik 30% memiliki aktivitas antibakterial yang paling baik jika dibandingkan dengan ekstrak etanolik 60% dengan menunjukkan hasil MIC dari ekstrak etanolik 30%, yaitu 1000 μg/mL dan MIC dari ekstrak etanolik 60%, yaitu >1000 μg/mL. B. Polifenolik Polifenolik adalah suatu metabolit sekunder yang ada pada tanaman. Karakteristik struktur dari polifenolik sendiri adalah memiliki satu atau lebih dari enam karbon dengan cincin aromatik dan terdapat dua atau lebih gugus fenolik yaitu gugus hidroksil yang langsung berikatan dengan cincin aromatik. Polifenolik yang terdapat pada tanaman memiliki fungsi yang berbeda – beda yaitu sebagai pemberi warna pada bagian bunga, daun, dan buah, juga berfungsi sebagai antimikrobial, anti jamur, melindungi dari kerusakan akibat radiasi UV, dan sebagai antioksidan (Stevenson dan Hurst, 2007). C. Flavonoid Flavonoid adalah suatu senyawa produk dari cinnamoil-CoA yang mengalami perpanjangan menggunkan tiga molekul malonil-CoA. Derivat dari flavonoid yang memiliki enam cincin heterosiklik dan terdapat gugus fenol dan gugus keton merupakan bentuk dari suatu flavonon. Flavonon dapat dibagi


10

berdasarkan skeleton yang menyusunnya yaitu flavon, flavonol, antisianidin, dan katekin. Flavonoid sangat bermanfaat untuk antioksidan di mana dengan adanya gugus fenolik aktivitas antioksidan dapat merusak radikal bebas (Dewick, 2002). D. Triterpenoid Terpen merupakan metabolit sekunder yang jumlahnya pada tanaman paling besar. Terpen dapat dibiosintesis dari unit isoprene yang memiliki struktur siklik dan diklasifikasikan berdasarkan jumlah unit isoprene C 5 penyusunnya, yaitu monoterpen (C10), sesquiterpen (C15), diterpen (C20), sesterpen (C25), triterpen (C30), karotenoid (C40), dan politerpen yang memiliki unit isopren yang sangat panjang. Pada tanaman pegagan terdapat banyak saponin triterpen pentasiklik yang disintesis melalui jalur isoprenoid. Saponin triterpenoid yang terkandung dalam pegagan memiliki kontribusi terhadap aktivitas biologis dari tanaman tersebut sebagai antibakterial (James dan Dubery, 2009). E. Ekstraksi Ekstraksi merupakan salah satu teknik pemisahan suatu senyawa berdasarkan distribusi zat dalam pelarut yang digunakan. Ekstraksi secara umum dilakukan menggunakan dua pelarut yang berbeda di mana kelarutan zat pada pelarut kedua lebih besar daripada pelarut pertama (Dirjen POM, 1996). 1. Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke dalam


11

sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan digantikan oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah melalui proses difusi. Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama proses maserasi berlangsung dilakukan pengadukan dan penggantian cairan penyari setiap hari. Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan (Sudjadi, 1986). 2. Triturasi Triturasi merupakan salah satu teknik pemurnian yang digunakan pada sampel dengan berat kurang dari 500 mg bertujuan untuk menghilangkan sampel dari keadaan bergetah dan pengotor bersifat non polar. Untuk menghilangkan getah maka dapat dilakukan dengan cara ditumbuk. Untuk menghilangkan pengotor yang bersifat non polar maka dapat dilakukan dengan melarutkannya menggunakan pelarut non polar, seperti ; n-heksana, n-pentana, dietil eter (Zala, et al., 2012). F. Kromatografi Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Teknik kromatografi ini telah berkembang dan digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen kompleks (Gandjar dan Rohman, 2007).


12

1. Kromatografi lapis tipis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan bentuk kromatografi planar di mana fase diamnya berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik. Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata–rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Fase gerak pada KLT yang disebut sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). Sistem yang paling sederhana ialah campuran dua pelarut organik, karena daya elusi campuran kedua pelarut dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga didapatkan pemisahan yang optimal (Gandjar dan Rohman, 2007). KLT pada umumnya digunakan untuk analisis kualitatif dengan cara membandingkan nilai Rf solut dengan nilai Rf senyawa baku. Nilai retardasi factor (Rf) dapat menggambarkan pemisahan yang terjadi pada kromatografi planar. Nilai Rf dapat dihitung menggunakan perbandingan melalui persamaan : 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢 𝑕 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡

Nilai Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘

𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢 𝑕 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘

Untuk dapat memaksimalkan pemisahan yang terjadi, pada sistem fase gerak yang dipilih dapat diatur sedemikian rupa untuk mendapatkan nilai Rf antara 0,2-0,8 (Gandjar dan Rohman, 2007).


13

2. Kromatografi kolom Kromatografi kolom secara umum digunakan sebagai salah satu teknik pemurnian dengan tujuan untuk dapat mengisolasi suatu komponen dari suatu campuran. Step gradient elution merupakan perubahan komposisi fase gerak pada umumnya digunakan dalam analisis kromatografi cair untuk mempersingkat durasi analisis. Perubahan ini memungkinkan untuk beralih langsung dari fase gerak pertama menjadi fase gerak kedua dengan perbedaan kekuatan elusi atau polaritas secara bertahap (Wu, Liang, dan Berthod, 2013). G. Antioksidan dan Uji Aktivitas Penangkap Radikal Bebas 1. Radikal bebas Radikal bebas adalah molekul atau bagian molekul yang tidak utuh lagi dan bersifat tidak stabil karena kehilangan satu elektron sehingga untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak jaringan. Oksigen merupakan salah satu molekul yang sangat reaktif, dan oksidasi dari protein dan lemak akan menghasilkan radikal bebas. Radikal bebas diperburuk dengan adanya pengaruh dari lingkungan, seperti ; asap kendaraan dan paparan sinar UV. Stres oksidatif adalah kondisi yang disebabkan oleh ketidakseimbangan antara produksi oksigen reaktif dengan kemampuan sistem biologi tubuh manusia untuk mendetoksifikasinya atau segera memperbaiki kerusakan yang ditimbulkan. Stres oksidatif dapat menyebabkan kerusakan komponen sel–sel, termasuk protein, lipid, dan DNA. Untuk melindungi dari kerusakan akibat radikal bebas maka dibutuhkan suatu antioksidan untuk dapat menetralkan radikal bebas sehingga tidak memperburuk kerusakan jaringan (Tambayong, 2000).


14

2. Antioksidan Antioksidan dapat terkandung dalam vitamin, mineral, dan bioflavonoida alamiah yang dapat berguna dalam menetralkan radikal bebas. Antioksidan ini bekerja dengan cara mendonorkan atom hidrogen pada radikal hidroksi membentuk molekul air yang tidak berbahaya (Youngson, 2003). Pada tubuh manusia, memliki suatu jaringan pelindung yang terdiri dari antioksidan alamiah yang mudah dioksidasi (menyerahkan elektron) sehingga dapat menetralkan adanya radikal bebas. Antioksidan yang terpenting adalah vitamin A, C, dan E, serta enzim-enzim alamiah glutathionperoxydase (GPx), superoxide-dismutase (SOD) dan katalase. Adanya kandungan antioksidan pada senyawa bioflavon terbukti dapat berkhasiat sebagai antitumor, antilipidermia, anti-arterosklerosis (Tjay, 2007). Berbagai macam model in vitro kimia telah dikembangkan untuk menilai kemampuan untuk mencegah kerusakan oksidatif, di antaranya tes kimia mengukur kapasitas radikal menggunakan metode DPPH. Menurut Molyneux (2004), dasar dari metode DPPH adalah adanya pereduksian warna. DPPH adalah suatu radikal bebas yang bila dicampurkan dengan suatu senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogren sehingga membentuk senyawa tereduksi dan kehilangan warna violet. Reaksi yang terjadi, radikal bebas DPPH disimbolkan sebagai Z* dan senyawa pendonor atom hidrogen disimbolkan sebagai AH : Z* + AH → ZH + A*


15

Gambar 1. Senyawa radikal bebas DPPH (1) dan Senyawa DPPH non radikal (2)

H. UV Protection dan Uji Aktivitas UV Protection Sinar matahari sangat diperlukan oleh makhluk hidup sebagai sumber energi, pertumbuhan, dan kesehatan tubuh, akan tetapi disamping manfaat yang didapatkan sinar matahari juga mengandung sinar ultraviolet yang sangat berbahaya terutama bagi kesehatan kulit. Sinar ultraviolet ini dapat menimbulkan berbagai kelainan pada kulit mulai dari kemerahan, noda hitam, penuaan dini, kekeringan, keriput, sampai kanker kulit. Sinar ultraviolet sendiri terdiri dari sinar UV-A (320-3800nm), sinar UV-B (290-320nm), sinar UV-C (200-290nm). Sinar UV-C memiliki energi dan daya perusak yang sangat tinggi, tapi untungnya sinar ini tidak dapat menembus lapisan ozon bumi. Walaupun demikian, kulit manusia tetap memerlukan perlindungan dari paparan radiasi sinar ultraviolet saat sedang melakukan kegiatan pada siang hari. Kulit secara alami dapat melindungi diri dari bahaya sinar UV matahari melalui reaksi melanin, tetapi jika pembentukan melanin tersebut berlebihan dan terus menerus maka dapat menimbulkan noda hitam pada kulit (Tranggono dan Latifah, 2007).


16

Fotoproteksi dapat dicapai dengan menghindari sinar matahari, berpakaian dan penggunaan tabir surya yang mengandung organik dan anorganik UV filter. Penggunaan tabir surya secara teratur dapat mengurangi efek berbahaya yang disebabkan oleh paparan jangka panjang terhadap radiasi UVB dan UVA (Osterwalder, Jung, Seifert, dan Herrling, 2009). Zat yang aktif sebagai sunscreen dimaksudkan dapat menyerap setidaknya 85% dari radiasi sinar UV-B pada panjang gelombang 290-320 nm dan sinar UV-A pada panjang gelombang 320-400 nm. Zat aktif sunscreen yang banyak digunakan merupakan bahan anargonik yaitu titan dioksida dan zinc oksida dengan mekanisme kerja merefleksikan sinar ultraviolet (Farage, 2010). Agen tabir surya secara pengaplikasiaanya dapat dibedakan menjadi topikal dan sistemik. Salah satu agen tabir surya yang diaplikasikan secara sistemik adalah β-karoten (Fonseca dan Rafaela, 2013). β-karoten merupakan karotenoid

yang

banyak

didapatkan

dari

buah-buahan

dan

sayuran.

Mengkonsumsi suplemen mengandung β-karoten atau makanan yang banyak mengandung karotenoid dapat melindungi dari paparan sinar UV yang dapat mengakibatkan eritema pada kulit (Heinrich, et al.,2002). Karotenoid efisien dalam aktivitas fotoproteksi, menangkap oksigen singlet dan radikal peroksil. Mengkonsumsi karotenoid efisien untuk fotoproteksi secara sistemik karena mengurangi sensitifitas yang dapat menginduksi eritema akibat sinar UV (Sies dan Stahl, 2004).


17

Aktivitas UV Protection dapat diuji menggunkan metode inhibition of bleaching of 𝛽-caroten di mana KLT ekstrak uji yang sudah kering disemprot menggunakan larutan 0,05% β-karoten dalam kloroform kemudian dipaparkan pada sinar UV 366 nm. Senyawa aktif berwarna kuning-orange dengan background pelat berwarna putih, menunjukkan bahwa senyawa tersebut dapat melindungi β-karoten yang sensitif terhadap cahaya (Marston,2011). I. Antibakteri Bakteri merupakan sumber penyebab penyakit yang banyak terjadi. Bakteri secara global dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana. Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri Gram positif yang termasuk dalam family Micrococcaceae. Bakteri S. aureus dapat menyebabkan infeksi pada manusia terutama infeksi yang terjadi pada kulit. Escherichia coli yang termasuk dalam family Enterobacteriaceae merupakan salah satu bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif memiliki membran luar yang tersusun dari liposakarida-endotoksi yang menyebabkan toksisitas. Bakteri E. coli dapat menyebabkan infeksi pada manusia terutama menyerang sistem pencernaan (Campbell, Reece, dan Mitchell, 2003). Antibakteri merupakan suatu senyawa yang dapat menghambat dari pertumbuhan suatu bakteri. Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibakteri dibedakan menjadi :


18

1. Zat bakterisida, merupakan suatu senyawa di mana pada dosis kecil dapat mematikan mikroba. 2. Zat bakteriostatis, merupakan suatu senyawa di mana pada dosis kecil dapat menghentikan

pertumbuhan

dan

menghambat

perbanyakan

mikroba

(Tjay,2007). Aktivitas antibakteri dibuktikan melalui pengujian untuk mengatahui kemampuan suatu senyawa dalam mengahambat atau membunuh bakteri. Metode yang dapat digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri dibedakan menjadi dua, yaitu metode difusi dan metode dilusi. Metode difusi digunakan untuk mengukur potensi antibakteri berdasarkan luas zona jernih yang terbentuk disekitar tempat penginokulasian obat karena terdifusinya obat (Jawetz, Melnick, Brooks, dan Adelberg, 2005). Metode difusi dapat dilakukan dengan berbagai cara. 1. Bioautografi Uji bioautografi sering dilakukan untuk skrining senyawa yang aktif sebagai antibakteri. Bioautografi merupakan suatu metode kromatografi lapis tipis di mana komponen aktif dipisahkan menggunakan pelat kromatografi yang kemudian pelat tersebut diinkubasi pada media agar yang sudah berisi bakteri uji. Hasil yang dapat memberikan zona jernih dari media agar mengekspresikan aktivitas suatu senyawa yang sudah terpisah pada pelat KLT (Purkayastha dan Dahiya, 2012). Metode bioautografi dalam pelaksanaannya dapat dibagi menjadi ; bioautografi langsung, bioautografi immersion, dan bioautografi kontak. Pada


19

metode bioutografi kontak, pelat KLT diletakkan pada media agar yang sudah diinolukasikan bakteri uji selama beberapa menit atau jam untuk senyawa dapat berdifusi. Kemudian, pelat KLT diambil dan media agar diinkubasi. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya zona hambat pada tempat senyawa aktif antibakteri sesuai dengan kontak pelat KLT pada media agar (Choma dan Gerzelak, 2011). 2. Disc Diffusion Metode cakram kertas (Disc diffusion) merupakan salah satu metode difusi lainnya yang dapat menggambarkan potensi antibakteri karena adanya difusi obat sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Hasil uji menggunakan disc diffusion terlihat dengan terbentuknya zona jernih dan pengukuran dilakukan dengan menghitung rata–rata dari zona jernih yang dihasilkan (Hermawan, Eliyani, dan Tyasningsih, 2007). J. Landasan Teori Kosmetik merupakan suatu kebutuhan yang wajib digunakan oleh manusia dengan tujuan mempercantik, merawat, maupun melindungi kulit dari debu, polusi, dan paparan sinar matahari. Sekarang ini, masyarakat mulai kembali menggunakan kosmetik tradisional karena penggunaannya yang relatif lebih aman daripada kosmetik bahan kimia. Tanaman pegagan (C. asiatica) dari suku Apiaceae disebut juga tanaman kaki kuda biasa dimanfaatkan oleh masyarakat untuk menyembuhan luka dengan aktivitas sebagai antimikroba, antiinflamasi, antioksidan, dan imunostimulan. Tanaman pegagan memiliki kandungan kimia, yaitu senyawa triterpenoid,


20

polifenolik, flavonoid yang dapat memberikan aktivitas farmakologis. Seiring dengan berkembangnya kosmetik tradisional, semakin banyak pula kosmetik yang beredar di pasaran dengan komposisi bahan herbal salah saatunya adalah masker wajah ekstrak daun pegagan yang diklaim dapat memperhalus kulit wajah dan sebagai masker merawat kulit wajah yang berjerawat. Aktivitas antioksidan, UV protection, dan antibakteri dilakukan untuk menguji kandungan senyawa apa yang berperan aktif dalam memberikan aktivitas tersebut dalam ektstrak etanolik daun pegagan, dengan demikian untuk mengetahui

kandungan

senyawa

dilakukan

pengecekan

menggunakan

kromatografi lapis tipis sehingga senyawa bioaktif dapat terpisah menjadi beberapa komponen berdasarkan sifat polaritasnya. Penelitian yang dilakukan ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang manfaat tanaman pegagan terutama bagian daunnya terkait aktivitasnya sebagai penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri.

K. Hipotesis Daun pegagan mengandung senyawa kimia terpenoid, flavonoid, fenolik, dan minyak atsiri yang dapat memberikan aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri.


BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksploratif. Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognogsi-Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

B. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah simplisia kering daun pegagan sebanyak 1 kg yang didapatkan dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Tanaman

Obat

dan

Obat

Tradisional

(B2P2TOOT)

Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan berupa bahan kualitas pro analitik Sigma hem. Co., USA yaitu DPPH dan β-karoten. Pelarut kualitias pro analitik dari Merck, yaitu kloroform, etanol, metanol, nheksana, etil asetat, asam formiat, dan asam asetat glasial. TLC silica gel 60 F254 dan silica gel 60 (0,040-0,063) dari Merck. Bahan kualitas teknis dari Brataco Chemica yaitu ethanol 96% v/v ethanol 96% v/v antiseptik, dan aquadest. Kultur bakteri uji S. aureus, E. coli, media pertumbuhan bakteri berupa Mueller Hinton Agar (MHA) dari Merck didapat dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta. Media pertumbuhan bakteri Trypticasein Soy Broth (TSB) dan Oxoide Agar dari PT. Agarindo Biological Company, Indonesia. Antibiotik yaitu Amoxicilin dari PT. Indofarma.

21


22

2. Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah vortex (Junke & Kunkel), rotary vacuum evaporator (Buchi Labortechnik AG CH-9230), waterbath (Memmert), mikropipet 10-1000 μL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), timbangan analitik digital (Scaltec SBC 22, BP 160P), autoclave (YX – 400Z), oven (WTE binder), cawan petri, cawan porselin, sendok, bunsen, jarum ose, tabung kaca, mikrotube, pipa kapiler (Brand), corong, kain mori, kertas saring no. 41 (Whatman), tabung reaksi bertutup dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

C. Tata Cara Penelitian 1. Alur pengerjaan penelitian Pembelian bahan Pembuatan serbuk simplisia Ekstraksi  Maserasi menggunakan etanol 90% v/v  evaporasi

Susut pengeringan serbuk simplisia

Susut pengeringan ekstrak kental

Ekstrak kental

Isolasi senyawa aktif

Uji kualitatif aktivitas Uji aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan metode DPPH

Uji aktivitas UV protection metode inhibition of bleaching of β-caroten

Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi

Uji kualitatif aktivitas pada isolat Uji aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan metode DPPH

Uji aktivitas UV protection metode inhibition of bleaching of β-caroten

Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi

Gambar 2. Bagan alur pengerjaan penelitian

Identifikasi golongan senyawa aktif isolat secara kualitatif menggunakan reagen semprot


23

2. Penyiapan simplisia Bahan penelitian yang digunakan yaitu bagian daun pegagan yang sudah kering sebanyak 1 kg yang didapatkan dari B2P2TOOT dan sudah dideterminasi. Simplisia kering disortasi kering untuk menghilangkan pengotor yang ada, kemudian dihaluskan kasar menggunakan blender. 3. Perhitungan susut pengeringan simplisia Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g menggunakan cawan petri. cawan petri yang berisi serbuk simplisia ditimbang sebagai berat pada waktu 0 menit. Panaskan menggunakan oven dengan suhu 105℃ tiap 30 menit kemudian didiamkan pada desikator selama 10 menit dilakukan sampai memperoleh bobot tetap. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali. 4. Ekstraksi Serbuk simplisia yang akan diekstraksi ditimbang sebanyak 50 g kemudian, dimasukkan dalam erlenmeyer yang sudah berisi etanol 90% v/v dengan perbandingan 1:3 atau sampai semua serbuk terendam sempurna dengan etanol setinggi 2 cm. Tutup erlenmeyer menggunakan aluminium foil, kemudian

dilakukan

ekstraksi

dengan

penggojogan

yang

konstan

menggunakan maserator selama 24 jam. Setelah 24 jam, dilakukan penyaringan menggunakan kain mori. Ampas yang tersisa, dimaserasi kembali dengan perlakuan yang sama. Kedua filtrat yang didapat dicampur dan saring menggunakan kertas saring yang akan dilanjutkan dengan pemekatan ekstrak menggunakan evaporator bersuhu 60℃.


24

5. Susut pengeringan ekstrak Ekstrak kental ditimbang sebanyak 1 g menggunakan cawan petri yang sudah ditimbang berat kosongnya. Cawan petri yang berisi ekstrak kental ditimbang sebagai berat pada waktu 0 menit. Panaskan menggunakan oven dengan suhu 105℃ tiap 30 menit kemudian didiamkan pada desikator selama 10 menit dilakukan sampai memperoleh bobot tetap. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali. 6. Uji kualitatif golongan senyawa a. Optimasi fase gerak

Berbagai macam fase gerak dibuat dengan perbandingan : 1) n-heksana : etil asetat (2:3 v/v) 2) kloroform : metanol (7:3 v/v) 3) kloroform : metanol (9:1 v/v) 4) kloroform : metanol (95:5 v/v) 5) etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) Larutan ekstrak dibuat dengan konsentrasi 5 mg/mL dari ekstrak kental dan pastikan ekstrak telah larut sempurna. Larutan ekstrak tersebut ditotolkan pada sebuah pelat KLT dengan jarak elusi 5 cm. Pelat KLT dimasukkan ke dalam chamber fase gerak yang sudah dijenuhkan menggunakan kertas saring. Pelat KLT dibuat sejumlah fase gerak yang akan dioptimasi. Nilai Rf tiap spot senyawa yang muncul dihitung.


25

b. Uji kualitatif golongan senyawa Enam buah pelat KLT yang sudah dielusi dibiarkan beberapa saat untuk menghilangkan pelarut fase gerak yang masih tersisa pada pelat KLT. Satu buah pelat KLT dilihat dibawah lampu UV 254 nm dan 360 nm beri tanda pada spot pemisahan yang meredam atau berpendar. Lima buah pelat disemprotkan pelat KLT tersebut dengan reagen semprot : 1) AlCl3

4) Vanilin-asam sulfat

2) FeCl3

5) Sitroborat

3) Dragendroff Nilai Rf tiap spot senyawa yang muncul dihitung. 7. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas ekstrak dan isolat Pelat KLT disiapkan untuk pengujian, totolkan larutan ekstrak konsentrasi 5 mg/mL dan isolat konsentrasi 1 mg/mL (ditotolkan hingga mendapatkan mass loading 10 μg, 20 μg, dan 30 μg), kemudian dielusikan pada fase gerak yang sudah dipilih paling optimal. Satu buah pelat untuk kontrol dan satu buah untuk disemprotkan menggunakan larutan DPPH 0,25mg/10mL metanol. Hitung nilai Rf pada spot pemisahan yang dapat menghambat DPPH dengan memberikan warna ungu yang memudar hingga kekuningan. 8. Optimasi ketinggian lampu UV dan waktu perlakuan Pada rangkaian alat lampu UV dibuat untuk dapat digerakan naik turun sehingga dapat mengoptimasikan jarak lampu UV yang dapat merubah warna larutan 𝛽-karoten dan masih dapat terukur dengan jarak 100 cm dari


26

dasar, 50 cm dari dasar, dan 35 cm dari dasar. Ditiap perbedaan ketinggian diukur intensitas cahaya lampu UV dengan alat lightmeter. Ditiap perbedaan ketinggian, pelat KLT yang sudah dicelupkan ke dalam larutan 𝛽-karoten dan dimasukkan ke dalam rangkaian alat dengan lampu UV yang menyala. Diukur perubahan warnanya menggunakan indikator warna tiap menit hingga 15 menit. Perubahan warna setiap diamati tiap 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15 menit. 9. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak dan isolat Enam buah pelat KLT disiapkan, satu buah pelat untuk kontrol, lima buah pelat untuk perlakuan tiga kali replikasi pada ekstrak dan dua buah pelat untuk pengujian isolat yang tidak dilakukan replikasi. Larutan ekstrak ditotolkan dengan konsentrasi 5 mg/mL dan isolat konsentrasi 1 mg/mL (ditotolkan hingga mendapatkan mass loading 10 μg, 20 μg, dan 30 μg), kemudian elusikan pada fase gerak yang paling optimal. Larutan 𝛽-karoten 0,5mg/mL disiapkan dengan melarutkan 𝛽-karoten dalam kloroform. Lampu UV disiapkan dengan ketinggian optimal dan ukur intensitas cahaya yang dikeluarkan oleh lampu UV menggunakan lightmeter. Pelat KLT dicelupkan satu per satu kedalam larutan 𝛽-karoten dan dimasukkan pada rangkaian alat lampu UV selama 0, 1, 3, 6, 9, dan 12 menit tiap hitungan waktu dilihat perubahan warna yang terjadi menggunakan indikator skala warna. Nilai Rf pada spot pemisahan yang dapat mempertahankan warna orange kekuningan dihitung.


27

10. Uji kualitatif aktivitas antibakteri Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptis menggunakan bunsen dan alkohol antiseptik. a. Pembuatan media pertumbuhan 1) Media padat Triptic Soy Broth (TSB) ditimbang sebanyak 6 g dan agar sebanyak 2,4 g. TSB dilarutkan kedalam aquadest 300 mL sambil dipanaskan. Tambahakan agar sedikit demi sedikit hingga homogen dan campuran menjadi bening. Autoklaf selama 15 menit. Selagi masih panas, tuangkan media pada cawan petri yang sudah disterilisasi. 2) Media cair TSB ditimbang sebanyak 3 g dan larutkan kedalam erlenmeyer berisi aquadest 100 mL sambil dipanaskan. Aduk hingga homogen kemudian autoklaf selama 15 menit. Selagi panas pindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup. b. Pengawetan bakteri Koloni bakteri S. aureus dan E. coli yang masih segar dicuplik sebanyak satu goresan ose. Pindahkan kedalam tabung reaksi yang berisi media cair. Lakukan lagi hingga bakteri tidak tersisa. Inkubasi selama 24 jam pada inkubator suhu 37℃. Setelah diinkubasi, tabung reaksii yang berisi pertumbuhan bakteri divortex hingga homogen. 1000 μL kultur bakteri diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof kemudian dimasukan


28

gliserol 50 μL, lakukan hingga habis kemudian ditutup rapat. Kultur bakteri diinkubasi dalam inkubator selama 1 jam kemudian disimpan di freezer. c. Pembuatan kultur bakteri uji Satu tabung eppendrof berisi bakteri S. aureus dan satu tabung berisi bakteri E. coli disiapkan. Pada tabung reaksi yang berisi cairan fisiologis 0,9% sebanyak 10 mL ditambahkan koloni bakteri yang sudah siap tetes demi tetes hingga sama dengan MacFarland 0,5 yang setara dengan jumlah bakteri (1,5x108 CFU).

d. Perlakuan uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak menggunakan metode bioautografi Pada

cawan

petri

yang

berisi

media

padat,

digoreskan

menggunakan cottonbud steril yang sudah dimasukkan dalam larutan bakteri uji yang sudah disiapkan secara merata keseluruh bagian. Tiga buah pelat KLT disiapkan dengan lebar 1 cm. dengan larutan ekstrak 5mg/mL ditotolkan sebanyak 15 μL, 20 μL, 30 μL. Kemudian elusi menggunakan fase gerak yang optimal. Tunggu 30 menit untuk menghilangkan sisa pelarut fase gerak yang digunakan. Setelah semua siap, pelat KLT ditempelkan perlahan pada media padat dalam cawan petri yang sudah ditumbuhi bakteri. Setelah 45 menit, pelat KLT diambil, dan media padat diinkubasi selama 18 jam. Hasil positif adalah munculnya zona jernih pada spot pemisahan.


29

e. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat menggunakan metode disc diffusion Larutan isolat disiapkan dengan konsentrasi 1mg/mL. Diambil larutan isolat sebanyak 50 μL, 75 μL, dan 100 μL kemudian kering uapkan larutan tersebut pada paper disc blank. Media Muller Hilton yang sudah memadat diinokulasikan bakteri S. aureus dengan teknik streak hingga merata, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Paper disc isolat yang sudah siap diinokulasikan pada media yang sudah ditumbuhi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam. Amati zona jernih yang terbentuk dan diukur besar diameternya. 11. Isolasi senyawa aktif a. Triturasi Ekstrak kental dan seasand ditimbang sebanyak 5 g. Keduanya dicampurkan dengan cara digerus sambil ditetesi menggunakan metanol secukupnya untuk mempermudahkan homogenisasi dan diibiarkan satu malam untuk menghilangkan metanol yang ditambahkan. Campuran ekstrak dipindahkan ke dalam tube sentrifuge hingga tanda volume 1 kemudian ditambahkan pelarut n-heksana hingga tanda volume 3. Tube divortex hingga homogen kemudian disentrifuge selama 10 menit. Supernatant yang terbentuk diambil dan disaring, lalu diuapkan. Endapan yang tersisa pada tube dikeringkan lalu ditambahkan pelarut yang diganti dengan kloroform : metanol (95:5 v/v), dan dilanjutkan dengan pelarut kloroform: metanol (9:1 v/v).


30

b. Kromatografi kolom Fraksi ekstrak dari hasil triturasi menggunakan pelarut kloroform : metanol (95:5 v/v) dicampurkan dengan serbuk silika gel masing-masing sebanyak 300 mg kemudian digerus hingga homogen. Packing kolom yang digunakan dengan urutan susunan : kapas, silika gel setinggi 2 cm, ekstrak setinggi 0,5 cm, silika gel setinggi 1 cm, dan tutup dengan kapas. Masukkan eluen secara bergradien menggunakan pelarut yang sesuai yaitu 10 mL n-heksana : kloroform (20:80 v/v), 10 mL n-heksana : kloroform (10:90 v/v), dan 20 mL kloroform, kemudian ditampung setiap 2 mL ke dalam tabung kaca. Isolat dipastikan kemurniannya menggunakan kromatografi lapis tipis. Isolat yang memiliki pola pemisahan yang sama digabungkan menjadi satu isolat, diuapkan, dan dihitung rendemen yang didapat. Isolat yang sudah kering, dipindahkan kedalam eppendrof sehingga terdapat 1 mg tiap eppendrof. 12. Alur pengerjaan isolasi senyawa aktif Ekstrak kental Triturasi

Fraksi heksan

Fraksi CHCl3:MeOH (95:5v/v)

Fraksi CHCl3:MeOH (9:1v/v)

Kromatografi kolom

Isolat 1

Isolat 2

Gambar 3. Bagan alur pengerjaan isolasi senyawa aktif


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian yang telah dilakukan ini secara umum bertujuan untuk mengetahui aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri pada ekstrak etanolik daun pegagan (C. asiatica). Selain itu, untuk mempertegas aktivitas yang dimiliki maka penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi senyawa aktif dan mengetahui golongan senyawa aktif yang bertanggungjawab terhadap aktivitas yang diberikan dalam ekstrak etanolik daun pegagan. A. Penyiapan Bahan, Penyerbukan dan Susut Pengeringan Serbuk Simplisia Daun Pegagan Simplisia kering herba pegagan (C. asiatica) sebanyak 1 kg didapatkan dari B2P2TOOT, Tawangmangu, Jawa Tengah. Bahan yang digunakan untuk penelitian merupakan bagian daun dari tanaman pegagan. Sebelum diproses lebih lanjut, simplisia perlu dilakukan determinasi yang bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman yang akan digunakan. Pegagan adalah tanaman dari family Apiaceae yang memiliki ciri-ciri berupa terna menahun, batang menjalar dengan panjang 0,1-0,8 meter. Tidak berbatang, rizoma pendek, dan salur panjang. Daun dalam roset, jumlah 2-10 per roset, berbentuk ginjal, tepi beringgit-berigi, panjang 1-7 cm, lebar 1½-9 cm, panjang tangkai daun 1-50 cm.

31


Simplisia

kering

herba

pegagan

diperoleh

dari

32

B2P2TOOT,

Tawangmangu, Jawa Tengah dijadikan sebagai bahan penelitian dan sudah didukung kebenaran dari tanaman dengan adanya determinasi seperti yang dilampirkan pada Lampiran 3. Simplisia kering yang didapat masih dalam campuran herba sehingga perlu dilakukan sortasi kering yang bertujuan untuk menghilangkan bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan seperti akar dan tangkai daun, sehingga yang didapatkan hanya bagian daunnya saja. Penyerbukan dilakukan untuk memperkecil permukaan simplisia sehingga dapat memperbesar luas permukaan dan dapat mempermudah penyarian. Simplisia diserbuk kasar menggunakan blender dengan tujuan mengurangi tumbukan pada blender supaya memperkecil kemungkinan kerusakan senyawa kimia yang terkandung pada daun pegagan. Standarisasi serbuk simplisia kering yang dilakukan adalah susut pengeringan untuk mengetahui kandungan air yang terdapat dalam simplisia. Menurut

Keputusan

Menteri

Kesehatan

Republik

Indonesia

nomor

:

661/MENKES/SK/VII/1998 tentang persyaratan obat tradisional, menetapkan bahwa kadar air serbuk atau simplisia tidak boleh lebih dari 10%. Pelabelan yang tertera pada kemasan simplisia kering dari B2P2TOOT adalah 8,86%. Hal tersebut memang sudah memenuhi persyaratan yang berlaku, akan tetapi untuk memastikan kadar air yang sebenarnya pada saat hendak diproses maka dilakukan susut pengeringan. Susut pengeringan ini perlu dilakukan untuk memastikan kandungan air dari simplisia kering yang dapat berubah pada saat proses penyimpanan. Susut pengeringan dilakukan dengan cara serbuk simplisia kering


33

yang dipanaskan pada suhu 105℃ hingga memperoleh bobot tetap. Pada kondisi ini, diasumsikan bahwa air yang terkandung dalam simplisia sudah menguap secara keseluruhan sehingga dapat menggambarkan kandungan air yang ada. Pada penelitian dilakukan tiga kali replikasi pengukuran sehingga didapatkan rata-rata susut pengerinngan pada simplisia kering daun pegagan sebesar 9,46% b/b. Dari hasil susut pengeringan yang diperoleh serbuk simplisia daun pegagan masih memenuhi persyaratan kadar air yang sudah ditetapkan. B. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Pegagan Bahan penelitian yang digunakan selanjutnya adalah ekstrak etanolik daun pegagan. Ekstrak etanolik daun pegagan dibuat melalui proses ekstraksi dengan metode maserasi dan menggunakan etanol 90% v/v sebagai pelarut. Metode maserasi dipilih untuk preoses ekstraksi dengan tujuan menghindari adanya perubahan senyawa kimia yang mungkin terjadi karena adanya pemanasan dapat menyebabkan kerusakan senyawa kimia. Maserasi sendiri merupakan salah satu cara penyarian dingin yang mudah dilakukan dengan alat dan pengerjaannya yang sederhana. Etanol 90% v/v dipilih sebagai pelarut penyari karena etanol merupakan pelarut universal dengan indeks polaritas 5,2 sehingga dapat menarik berbagai senyawa kimia. Proses ekstraksi dilakukan dengan menimbang serbuk simplisia daun pegagan dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang sudah berisi etanol 90% v/v dengan tujuan supaya partikel serbuk simplisia dapat terbasahi sempurna dan etanol 90% v/v yang ditambahkan dibuat setinggi ±2cm dari permukaan serbuk simplisia sehingga dapat terendam dengan sempurna dan dapat tergojog dengan


homogen.

Penggojogan

dilakukan

untuk

mempercepat

proses

34

ekstraksi

dibandingkan dengan cara ekstraksi yang hanya direndam saja. Adanya penggojogan yang berasal dari alat bantu, yaitu shaker akan membuat kontak serbuk simplisia dengan pelarut diperbesar sehingga memudahkan penarikan senyawa kimia dari serbuk simplisia. Maserasi dilakukan selama 24 jam dan dilakukan penyaringan untuk memisahkan hasil ekstraksi dengan serbuk simplisia. Penyaringan dilakukan sebanyak dua kali, yang pertama menggunakan kain mori dan yang kedua menggunakan kertas saring Whatman no 41. Penyaringan menggunakan kain mori bertujuan untuk mendapatkan hasil ekstrak secara keseluruhan dan membantu mempercepat proses penyaringan karena serbuk simplisia selanjutnya dilakukan remaserasi. Penyaringan menggunakan kertas saring Whatman no 41 bertujuan untuk memisahkan hasil ekstraksi dengan partikel serbuk simplisia yang mungkin dapat melewati pori-pori pada kain mori. Remaserasi adalah proses maserasi kembali dari serbuk simplisia yang sudah dilakukan maserasi sebelumnya. Remaserasi dilakukan selama 24 jam dan kembali dilakukan penyaringan menggunakan kain mori. Proses remaserasi dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh ekstrak yang lebih banyak karena pelarut yang sudah jenuh dapat diperbaharui sehingga senyawa kimia yang tertarik keluar oleh pelarut semakin banyak dan rendemen yang didapatkan diharapkan akan semakin banyak pula. Hasil ekstraksi yang sudah disaring dibuat ekstrak kental menggunakan bantuan alat rotary vaccuum evaporator dengan suhu 60℃. Prinsip kerja dari


35

rotary vaccuum evaporator adalah destilasi untuk menghilangkan kandungan pelarut dengan bantuan pemanasan dan pompa vakum. Pemanasan dilakukan untuk menguapkan pelarut etanol sehingga dapat memisahkan pelarut dengan ekstrak kental. Pelarut etanol yang menguap tersebut akan ditarik oleh pompa vakum sehingga dapat memasuki kondesator sehingga uap tersebut kembali menjadi titik-titik cairan pelarut. Ekstrak etanolik akhir yang diperoleh merupakan ekstrak kental daun pegagan, berwarna hijau tua, berbau khas daun pegagan, dan tidak berasa. Ekstrak kental dipilih karena mengandung sedikit kadar air sehingga dapat disimpan lebih lama dan kadar air yang terkandung dalam ekstrak tidak akan mengganggu penelitian selanjutnya. Kadar air yang tinggi dalam ekstrak dapat merusak kandungan senyawa aktif melalui proses enzimatik sehingga dapat merubah komponen dan komposisi senyawa aktif. Berdasarkan Farmakope Herbal Indonesi (2009), ekstrak kental pegagan merupakan ekstrak yang mengandung air tidak boleh melebihi 10%. Ekstrak kental kemudian dilakukan pengujian susut pengeringan untuk memastikan kandungan air yang terdapat dalam ekstrak kental. Dari hasil pengujian susut pengeringan ekstrak didapatkan rata-rata kandungan air sebesar 5,71% b/b, hal ini menunjukkan bahwa ekstrak kental telah memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan. Rendemen ekstrak kental yang didapatkan adalah sebesar 1,65% b/b.


36

Rendemen Ekstrak Etanolik Kental = 1,65% b/b Rendemen Fraksi Heksan = 15,59% b/b

Rendemen Fraksi Kloroform : Metanol (95:5 v/v) = 5,06% b/b

Rendemen Fraksi Kloroform:Metanol (9:1 v/v) = 0,41% b/b

Rendemen Isolat 1 = 1,39% b/b

Rendemen Isolat 2 = 0,99% b/b Gambar 4. Bagan rendemen

C. Optimasi Fase Gerak Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode pemisahan senyawa pada suatu fase diam berdasarkan polaritas senyawa terhadap fase gerak pembawa. KLT ini bertujuan untuk membantu skrining fitokimia dalam mengetahui komponen bioaktif apa saja yang terdapat dalam ekstrak etanolik daun pegagan. Pada penelitian, pemisahan senyawa bioaktif dilakukan menggunakan fase diam yaitu pelat aluminium TLC Silica gel 60 F254 karena partikel silika pada pelat KLT dapat dikontrol keseragamannya sehingga pemisahan yang akan terbentuk semakin optimal dan efisien. Pemisahan yang optimal pada KLT ditunjukkan dengan nilai Rf 0,2-0,8, untuk mendapat pemisahan yang baik maka perlu dilakukan optimasi fase gerak. Optimasi fase gerak dilakukan dengan


37

mencoba menggunakan 5 macam fase gerak, yaitu n-heksana : etil asetat (2:3 v/v) ; kloroform : metanol (7:3 v/v) ; kloroform : metanol (9:1 v/v) ; kloroform : metanol (95:5 v/v) ; etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air (100:11:11:20 v/v). Pada Tabel 1, dapat dilihat hasil KLT yang menunjukkan bahwa pada fase gerak etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air (100:11:11:20 v/v) dapat memisahkan senyawa dengan sempurna menjadi 11 spot pemisahan. Akan tetapi, fase gerak yang dipilih untuk penelitian selanjutnya adalah kloroform : metanol (95:5 v/v). Pemilihan fase gerak ini karena fase gerak dapat memisahkan senyawa aktif dengan optimal setelah fase gerak etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air (100:11:11:20 v/v) yaitu didapatkan 6 spot pemisahan dengan bercak yang lebih jelas. Pada fase gerak etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air (100:11:11:20 v/v) tidak dipilih dengan pertimbangan pada saat uji aktivitas selanjutnya akan sangat sulit menghilangkan pelarut karena fase gerak tersebut mengandung komponen pelarut yang susah menguap. D. Uji Kualitatif Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas Ekstrak Etanolik Optimasi fase gerak yang telah dilakukan ini sekaligus untuk uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan DPPH sebagai sumber radikal bebas.

Uji aktivitas penangkap radikal bebas dianggap perlu dalam mengevaluasi suatu produk kosmetik tradisional karena dalam komposisi suatu produk kosmetik tradisional tidak ditambahkan bahan kimia yang dapat berperan sebagai antioksidan. Komposisi masker wajah tradisional dapat ditunjukkan pada Lampiran 1.


38

Radikal bebas merupakan sumber masalah terutama bagi kulit yang merupakan perlindungan pertama tubuh manusia dari segala paparan lingkungan yang dapat membentuk radikal bebas, seperti ; polusi dan sinar UV. Radikal bebas ini dapat merusak jaringan kulit sehingga mengakibatkan penuaan dini yang ditunjukkan dengan adanya pembentukan keriput pada kulit wajah. Aktivitas antioksidan suatu senyawa aktif ditunjukkan melalui perubahan warna DPPH yaitu violet yang mengalami pemudaran menjadi warna kuning akibat adanya aktivitas penangkapan radikal bebas oleh suatu antioksidan melalui reaksi seperti berikut.

+ DPPH (violet)

AH

→

antioksidan

kuning

Gambar 5. Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh senyawa antioksidan

Pada Gambar 5, radikal bebas DPPH yang memiliki satu elektron bebas pada gugus N yang berwarna violet saat diberikan suatu senyawa yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas maka warna violet dari radikal bebas DPPH akan memudar. Pemudaran ini terjadi karena suatu senyawa antioksidan dapat mendonorkan satu elektronnya kepada radikal bebas DPPH sehingga DPPH menjadi suatu senyawa non radikal yang berwarna kuning.


Rf 1 Rf 1

Rf 0

Rf 1

39

Rf 1 Rf 1

Rf 0

Rf 0

Rf 0

Rf 0

Gambar 6. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan DPPH semprot pada hasil pemisahan dengan fase gerak ; (a)CHCl 3:MeOH 95:5 v/v (b)CHCl3:MeOH 9:1v/v (c) n-heksana:etil asetat 2:3 v/v (d)n-heksana:etil asetat 7:3 v/v (e)etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air 100:11:11:20v/v

Hasil elusi KLT menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95:5 v/v) yang ditunjukkan pada Gambar 6, mendapatkan spot pemisahan pada Rf 0,14; 0,36; 0,46; 0,75; 0,88; 0,92 yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dengan munculnya bercak senyawa aktif berwarna kuning setelah disemprot menggunakan DPPH.


40

Tabel 1. Uji Kualitatif Aktivitas Penangkap Radikal Bebas Ekstrak Etanolik Fase Gerak

kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

kloroform : metanol (9 : 1 v/v)

n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v)

heksan : etil asetat ( 7 : 3 v/v )

etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100 :11 : 11 :20 v/v)

Retention factor (Rf) 0,14 0,36 0,46 0,75 0,88 0,92 0,49 0,65 0,75 0,83 0,27 0,50 0,60 0,72 0,77 0,12 0,40 0,52 0,13 0,24 0,35 0,43 0,47 0,53 0,65 0,75 0,77 0,85 0,97

E. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Ekstrak Etanolik Uji aktivitas UV protection dilakukan untuk membuktikan bahwa senyawa aktif dapat melindungi kulit dari efek buruk paparan sinar ultraviolet. Uji kualitatif aktivitas UV protection ini dilakukan menggunakan metode inhibition of


41

bleaching of 𝛽-caroten dengan cara melapisi pelat KLT kering hasil pemisahan senyawa ekstrak menggunakan 𝛽-karoten. 𝛽-karoten dipilih karena sifatnya yang fotosensitif terhadap sinar UV. 𝛽karoten akan memudar akibat adanya oksidasi oleh sinar UV sehingga memutuskan ikatan rantai penyusun 𝛽-karoten. Hal ini yang dimanfaatkan dalam penelitian uji kualitatif aktivitas UV protection dengan cara mengamati perubahan warna 𝛽-karoten yang terjadi akibat adanya paparan ultraviolet dari warna kuning menjadi memudar. Senyawa aktif yang memiliki aktivitas UV protection dapat mempertahankan warna kuning 𝛽-karoten pada spot pemisahannya. Sebelum melakukan pengamatan pengujian aktivitas, dilakukan optimasi ketinggian lampu UV pada rangkaian alat terlebih dahulu untuk mengetahui intensitas cahaya yang dipancarkan oleh lampu. Ketinggian lampu UV dibuat berbeda dengan jarak tertinggi, sedang, dan terdekat dari bidang pengamatan yaitu 100 cm, 50 cm, dan 35 cm. Adanya perbedaan ketinggian ini diasumsikan dapat menggambarkan intensitas cahaya dari terkecil, sedang, hingga terbesar. Optimasi ini dilakukan untuk mengetahui waktu mulai 𝛽-karoten memudar setelah terpapar sinar UV dengan adanya perubahan intensitas cahaya.


42

7 6

skala warna

5 4

ketinggian lampu UV 100cm

3


2


1 0 -1

0

5

10

15

20

waktu (menit)

Gambar 7. Grafik hasil optimasi ketinggian lampu UV dalam pengujian aktivitas UV protection

Pada grafik optimasi yang ditunjukkan pada Gambar 7, terlihat bahwa dari hasil optimasi dipilih ketinggian lampu berjarak sedang karena pengamatan perubahan warna 𝛽-karoten masih dapat diamati secara kasat mata dengan waktu yang relatif tidak terlalu lama dan tidak terlalu cepat. Pengamatan perubahan warna 𝛽-karoten dilakukan dengan cara membandingkan dengan indikator warna yang ditunjukkan pada Lampiran 11 dengan skala warna 0 sampai dengan 7, di mana skala warna 0 menunjukkan warna putih dan gradasi warna semakin meningkat hingga skala warna 7 yang menunjukkan warna kuning-orange. Adanya indikator warna sebagai pembanding ini dapat menggambarkan aktivitas UV protection di mana semakin terpapar sinar UV, maka warna 𝛽-karoten akan semakin memudar yang ditunjukkan dengan penurunan skala warna hingga 0 dan dapat mengamati warna spot pemisahan senyawa aktif. Tabel 2, menunjukkan bahwa pelat KLT yang sudah dilapisi 𝛽-


43

karoten mengalami pemudaran pada menit pertama setelah paparan lampu UV dari skala warna 5 menjadi 1. Pada saat menit ke-9 warna 𝛽-karoten pada pelat KLT kembali mengalami pemudaran dari skala warna 1 hingga skala warna 0 yang menunjukkan warna putih, dan terlihat spot pemisahan senyawa yang berwarna lebih kuning daripada warna pelat KLT yang ditunjukkan melalui skala warna 1 dengan warna putih kekuningan. Hasil yang dapat dilihat pada Gambar 8, menunjukkan bahwa dalam ekstrak etanolik daun pegagan terdapat senyawa aktif UV protection dengan spot pemisahan pada Rf 0,14-0,20 dan 0,73-0,74.

A

Rf 1

Rf 1

Rf 0

Rf 0

B

Rf 1

Rf 1

Rf 0

Rf 0

C

D

Gambar 8. Uji kualitatif UV protection pada ekstrak etanolik (A : kontrol ; B-D : Replikasi I – Replikasi III)

Mekanisme reaksi senyawa aktif pada ekstrak etanolik daun pegagan yang memiliki aktivitas UV protection belum dapat diketahui dengan pasti, namun aktivitas ini dapat dikaitkan dengan adanya aktivitas antioksidan yang terdapat pada spot pemisahan senyawa pada Rf 0,14 dan 0,75. Aktivitas antioksidan ini dapat menghambat terjadinya pemutusan rantai akibat oksidasi paparan sinar UV sehingga warna dari β-karoten dapat dipertahankan.


Tabel 2. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Ekstrak Etanolik Pengukuran uji aktivitas UV Protection menggunakan lampu dengan ketinggian 50 cm dan intensitas cahaya 15,81 Replikasi I

Waktu

Replikasi II

Replikasi III

Replikasi IV

Replikasi V

(menit)

BG

Keterangan

BG

Keterangan

BG

Keterangan

BG

Keterangan

BG

Keterangan

0’

5

-

5

-

5

-

5

-

5

-

1’

1

-

1

-

1

-

1

-

1

-

3’

1

-

1

-

1

-

1

-

1

-

6’

1

-

0

-

0

-

0

-

0

-

9’

1

-

0

Rf = 0,14 (1)

0

Rf = 0,20 (1-)

0

Rf = 0,18 (1-)

0

-

0

Rf = 0,18 (1)

Rf = 0,74 (1) 12’

0

Rf = 0,14 (1-)

0

Rf = 0,74 (1) 15’

0

Rf = 0,14 (1+) Rf = 0,74 (1+)

Rf = 0,14 (1)

Rf = 0,73 (1) 0

Rf = 0,74 (1) 0

Rf = 0,14 (1) Rf = 0,74 (1)

Rf = 0,20 (1)

Rf = 0,74 (1-) 0

Rf = 0,73 (1) 0

Rf = 0,20 (1) Rf = 0,73 (1)

Rf = 0,18 (1) Rf = 0,74 (1-)

0

Rf = 0,18 (1) Rf = 0,74 (1)

Rf = 0,73 (1-) 0

Rf = 0,18 (1) Rf = 0,73 (1-)

BG (background) untuk menunjukkan warna background pelat KLT sesudah disemprot 𝜷-karoten.

44


45

Tabel 3. Simpangan deviasi (SD) pengukuran uji kualitatif UV Protection pada ekstrak etanolik Waktu (menit)

Simpangan Deviasi (SD) Retention factor (Rf) Spot Spot BG BG KLT KLT 0 5 0 1 1 0 3 1 0 6 0,2 0,45 9 Rf = 0,14 - 0,20 1 0 0,2 0,45 Rf = 0,73 – 0,74 1 0 12 Rf = 0,14 – 0,20 1 0 0 0 Rf = 0,73 - 0,74 1 0 15 Rf = 0,14 – 0,20 1 0 0 0 Rf = 0,73 - 0,74 1 0 BG (background) untuk menunjukkan warna background pelat KLT sesudah disemprot 𝜷-karoten. Rata – rata ( 𝒙 )

F. Uji Kualitatif Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanolik Menggunakan Metode Bioautografi

Uji aktivitas antibakteri dilakukan untuk menggambarkan kebenaran dari kemanfaatan ekstrak daun pegagan yang dapat merawat kulit berjerawat. Jerawat yang dapat timbul pada kulit dapat disebabkan karena kulit wajah yang tidak dirawat kebersihannya, ada penyumbatan lemak pada pori-pori kulit, dan adanya infeksi oleh suatu bakteri tertentu. Menurut Campbell, Reece, dan Mitchell (2003), salah satu bakteri yang dapat menginfeksi kulit adalah bakteri S. aureus. Bakteri S. aureus dapat ditemukan secara normal pada kulit dan umumnya tidak menyebabkan penyakit tertentu, tetapi ketika adanya perubahan hormonal pada tubuh maka dapat menyebabkan kelenjar keringat lebih aktif memproduksi minyak sehingga minyak yang berlebih ini akan mengering


46

menyebabkan terjadinya sumbatan aliran minyak dari folikel rambut ke pori-pori dan bakteri akan berkumpul dalam pori kulit. Bakteri yang tumbuh pada bagian tersumbat ini akan menguraikan lemak dari minyak sehingga menyebabkan iritasi kulit berupa bintil putih berisi nanah atau yang sering disebut jerawat. Penelitian uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak etanolik daun pegagan dilakukan terhadap bakteri S. aureus yang merupakan bakteri pada kulit dan merupakan kelompok bakteri Gram positif serta pengujian terhadap bakteri E.coli yang merupakan bakteri kelompok bakteri Gram negatif. Kebenaran bakteri uji yang digunakan dalam penelitian dapat dilihat pada Lampiran 7 dan 8. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak etanolik daun pegagan dilakukan menggunakan metode bioautografi. Bioautografi merupakan teknik pengujian antibakteri terhadap pemisahan senyawa bioaktif pada suatu pelat KLT. Prinsip dari metode bioautografi adalah adanya kontak senyawa aktif dengan media agar yang menyebabkan senyawa aktif tersebut dapat berdifusi dari hasil pemisahan pada pelat KLT menuju media agar yang telah diinokulasikan bakteri uji sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan adanya zona jernih pada tiap spot pemisahan senyawa bioaktif sebagai tanda positif aktif antibakteri. Pada

pengujian

antibakteri

dilakukan

secara

aseptis

disetiap

pengerjaannya untuk menghindari adanya kontaminasi. Keberhasilan pengerjaan secara aseptis ditunjukkan dengan kontrol media yang tidak ada pertumbuhan mikroorganisme apapun. Kontrol pertumbuhan dibuat dengan tujuan untuk mengetahui apakah bakteri yang diinokulasikan dapat tumbuh dengan baik pada media agar atau tidak. Kontrol positif dibuat bertujuan untuk membandingkan


47

aktivitas antibakteri yang terdapat pada ekstrak etanolik dengan suatu aktivitas senyawa pembanding yaitu amoxicillin. Amoxicillin dipilih sebagai pembanding karena amoxicillin merupakan antibiotik turunan penisilin yang mempunyai spektrum kerja yang luas yaitu dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Konsentrasi ekstrak etanolik daun pegagan yang digunakan untuk penotolan pada pelat KLT adalah 5 mg/mL dengan adanya variasi volume penotolan membuat variasi mass loading pula, yaitu 75 μg, 100 μg, dan 150 μg. Pelat KLT yang sudah dielusi, dikeringuapkan terlebih dahulu secara aseptis untuk menghindari adanya hasil positif palsu akibat masih adanya pelarut fase gerak kloroform:metanol (95:5 v/v) di mana kedua pelarut ini memiliki daya antibakteri pula. Pada Gambar 9, hasil pemisahan pelat KLT yang ditandai dengan lingkaran menunjukkan ekstrak etanolik daun pegagan tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri E. coli karena tidak terdapat zona jernih yang terbentuk disekitar kontak pada spot pemisahan. Hal ini dapat terjadi karena kurangnya konsentrasi dalam menghambat pertumbuhan bakteri E. coli yang memiliki membran luar sebagai karakteristik bakteri Gram negatif sehingga kekuatan senyawa aktif belum dapat merusak membran luar bakteri E. coli.


A

B

48

C

D

Gambar 9. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak etanolik terhadap bakteri E. coli menggunakan metode bioautografi (A: mass loading 75μg; B: mass loading 100 μg; C: mass loading 150 μg; D : mass loading 250 μg)

Tabel 4. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak terhadap bakteri E. coli menggunakan Metode Bioautografi Mass Loading ( μg )

75

100

150

250

Rf 0,12 0,22 0,3 0,52 0,12 0,23 0,31 0,54 0,14 0,23 0,32 0,54 0,14 0,23 0,32 0,55


49

Berbeda dengan hasil pengujian ekstrak etanolik terhadap bakteri S. aureus memiliki aktivitas antibakteri dengan terbentuknya zona hambat sesuai dengan spot pemisahan yang ditunjukkan pada Gambar 10. Spot pemisahan senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas antibakteri ditunjukkan pada Rf 0,160,17; 0,21-0,23; 0,29-0,34; 0,51-0,53. Zona hambat yang terbentuk tidak dapat dihitung secara pasti karena zona jernih yang terbentuk tidak rata dan saling berhimpit namun dapat terlihat secara kasat mata bahwa seiring dengan adanya peningkatan mass loading besar zona hambat yang terbentuk juga semakin besar. Walaupun, jika dibandingkan dengan amoxicillin efek antibakteri yang ditunjukkan efek antibakteri ekstrak etanol tidak sebaik amoxicillin, tapi dengan dilakukannya metode bioatugrafi dapat memberikan informasi bahwa pada mass loading 75μg ekstrak etanolik sudah dapat menhambat pertumbuhan bakteri.

Gambar 10. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak etanolik terhadap bakteri S. aureus menggunakan metode bioautografi


50

Tabel 5. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak terhadap bakteri S. aureus menggunakan Metode Bioautografi Mass Loading ( μg )

75

100

150

250

Rf 0,16 0,21 0,29 0,51 0,17 0,23 0,32 0,51 0,17 0,23 0,34 0,53 0,17 0,23 0,34 0,53

G. Isolasi Senyawa Aktif Pada Ekstrak Etanolik Daun Pegagan Ekstrak etanolik daun pegagan yang telah diuji aktivitasnya maka dapat diketahui pula spot senyawa aktifnya, sehingga dilakukan isolasi untuk mengambil senyawa aktif yang masih terdapat didalam campuran ekstrak. Triturasi merupakan salah satu cara teknik pemurnian untuk senyawa dengan berat kurang dari 500 mg dengan cara pelarutan kembali menggunakan pelarut yang sesuai. Langkah triturasi dilakukan sebagai tahapan awal dalam mengisolasi senyawa aktif dari ekstrak etanolik daun pegagan. Triturasi cocok digunakan untuk bahan yang memiliki viskositas tertentu dengan cara ditumbuk dan untuk menyalut ekstrak pada penelitian digunakan seasand sehingga dapat mengurangi kelat pada ekstrak. Pada teknik triturasi juga dapat bertujuan untuk


51

menghilangkan senyawa pengotor yang bersifat non polar dengan cara melarutkannya menggunakan pelarut non polar. Ekstrak etanolik daun pegagan mengandung pigmen warna klorofil yang dapat mengganggu pengamatan dalam pemisahan senyawa aktif karena klorofil dapat menutupi senyawa aktif lainnya yang memiliki Rf yang sama dengan klorofil. Triturasi membantu dalam pemurnian senyawa aktif dari adanya klorofil dengan pelarut n-heksana karena klorofil merupakan senyawa non polar dan larut dengan n-heksana. Triturasi juga dilakukan menggunakan pelarut kloroform : metanol (95:5 v/v) dan kloroform : metanol (9:1 v/v) untuk mengambil senyawa yang bersifat semipolar. Pada penelitian ini, triturasi juga dapat digambarkan sebagai suatu cara dalam melakukan fraksinasi senyawa aktif ekstrak etanolik daun pegagan menggunakan sample dan pelarut yang sedikit. Fraksinasi dilakukan dengan tujuan untuk dapat memisahkan senyawa aktif yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri dari campuran ekstrak. Hasil triturasi didapatkan 3 fraksi, yaitu fraksi n-heksana, fraksi kloroform:metanol (95:5 v/v), dan fraksi kloroform:metanol (9:1 v/v) dengan rendemen 15,59% b/b, 5,06% b/b, dan 0,41% b/b dari 300 mg ekstrak etanolik. Hasil fraksinasi ini dipantau menggunakan pemisahan pada pelat KLT dengan fase gerak kloroform:metanol (95:5 v/v), gambar pada Lampiran 16 dapat diketahui bahwa triturasi yang dilakukan berhasil mengurangi adanya klorofil pada fraksi kloroform:metanol.


52

Setelah fraksinasi dilakukan maka proses isolasi senyawa dilanjutkan dengan metode kromatografi kolom dengan teknik elusi step gradient chromatography menggunakan fraksi kloroform:metanol (95:5 v/v) karena rendemen yang didapat cukup banyak dan klorofil juga sudah dapat dikurangi. Metode step gradient chromatography coloum dilakukan untuk isolasi senyawa aktif karena pengerjaannya yang mudah dan dapat mengambil senyawa aktif sesuai dengan kepolarannya karena metode ini memungkinkan untuk mengganti kepolaran eluen secara bertahap. Eluen yang digunakan pada penelitian ini secara berurutan adalah n-heksana : kloroform (20:80 v/v); n-heksana : kloroform (10:90 v/v); kloroform. Pemilihan eluen ini bertujuan untuk mengambil senyawa yang memiliki sifat non polar terlebih dahulu hingga senyawa bersifat lebih polar. Adanya silica gel 60 (0,040-0,063 mm) sebagai fase diam maka pemisahan dari senyawa satu dengan lainnya dapat terjadi dan hasil elusi ditampung ke dalam tabung kaca tiap 2 mL supaya dapat memisahkan senyawa yang mungkin masih terbawa eluen. Pemastian keberhasilan kromatografi kolom yang telah dilakukan dipantau menggunakan cara pemisahan pada pelat KLT dengan fase gerak kloroform:metanol (95:5 v/v). Hasil pemantauan dan dideteksi menggunakan H2SO4 5% dalam metanol didapatkan 2 isolat yang murni. Isolat 1 merupakan penggabungan isolat dari tabung kaca ke 10-13 yang muncul bercak pada Rf 0,32 dengan rendemen isolat 1 sebesar 1,39% b/b. Isolat 2 merupakan penggabungan isolat dari tabung ke 11-13 yang muncul bercak pada Rf 0,26 dengan rendemen sebesar 0,99% b/b dari 300mg fraksi kloroform:metanol (95:5 v/v).


53

1. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas isolat A

B Rf 1 1

Rf 1 1

Rf 0 0

Rf 0 0

Gambar 11. Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Isolat 1 (A) dan Isolat 2 (B) (dari kiri-kanan : ekstrak mass loading 10 μg, isolat 1 mass loading 10, 20, dan 30 μg)

Isolat yang sudah didapatkan diuji aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan metode DPPH, di mana volume penotolan pada pelat KLT diukur dan dapat diketahui mass loading isolat yang ditotolkan yaitu 10 μg, 20 μg, 30 μg sehingga dapat menggambarkan konsentrasi minimum yang dapat memberikan aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH. Pada isolat 1 mass loading 10 μg spot pemisahan Rf 0,36 warna violet memudar setelah 18jam dan spot pemisahan Rf 0,80 warna violet memudar setelah 5 jam. Pada mass loading 20 dan 30 μg, spot pemisahan dengan Rf 0,36 dapat memudarkan warna violet setelah 12jam dan spot pemisahan dengan Rf 0,80 dapat memudarkan warna violet setelah 5jam. Pada isolat 2 mass loading 10 μg spot pemisahan dengan Rf 0,34 muncul pemudaran warna violet setelah 20 jam, sedangkan pada Rf 0,80 pemudaran warna violet terjadi setelah 5 jam pengamatan. Mass loading 20 μg dan 30 μg pada isolat 2 dengan spot pemisahan Rf 0,34 dan 0,38 dapat memudarkan warna


54

violet setelah 18 jam pengamatan sedangkan, pada Rf 0,80 dan 0,81 terjadi pemudaran warna setelah 5 jam pengamatan. Tabel 6. Uji Kualitatif Aktivitas Penangkap Radikal Bebas Isolat 1 Mass Loading (μg)

Rf

Waktu

10

0,36 (tipis) 0,80 (+)

18 jam 5 jam

20

0,40 (+) 0,80 (++)

12jam 5 jam

30

0,40 (++) 0,80 (+++)

12jam 5 jam

0,13 (+) 0,21 (+) 0,31 (+) 0,48 (+++) 0,77 (++) 0,81 (++)

20 menit 20 menit 20 menit 2 menit 10 menit 10 menit

Ekstrak etanolik ( 10 μg )

Hasil pengujian aktivitas penangkap radikal bebas isolat ini dapat memberikan informasi bahwa pada mass loading terendah, yaitu 10μg saja sudah mampu memberikan aktivitas penangkap radikal bebas walaupun kerjanya lemah namun seiring dengan kenaikan jumlah mass loading maka kerja aktivitas antioksidan semakin kuat. Berbeda dengan ekstrak dengan mass loading 10 μg pemudaran pada tiap spot dapat terlihat dengan jelas mulai dari 2 menit saja. Perbandingan

aktivitas

dilakukan

menggunakan

ekstrak

etanolik

dapat

menunjukkan bahwa masih terdapat senyawa aktif penangkap radikal bebas lainnya yang tidak terisolasi. Isolat yang didapatkan terbukti dapat berperan terhadap adanya aktivitas antioksidan pada ekstrak etanolik daun pegagan.


55

Tabel 7. Uji Kualitatif Aktivitas Penangkap Radikal Bebas Isolat 2 Mass Loading ( μg )

Rf

Waktu

10

0,34 (tipis) 0,80 (+)

20 jam 5 jam

20

0,34 (+) 0,80 (++)

18 jam 5 jam

30

0,38 (++) 0,81 (+++)

18 jam 5 jam

0,13 (+) 0,21 (+) 0,31 (+) 0,48 (+++) 0,77 (++) 0,81 (++)

20 menit 20 menit 20 menit 2 menit 10 menit 10 menit

Ekstrak etanolik ( 10 μg )

2. Uji kualitatif aktivitas UV protection isolat Isolat yang sudah didapatkan diuji aktivitas UV protection menggunakan metode inhibition of bleaching of β-caroten dengan cara menghitung volume penotolan dari konsentrasi isolat 1 mg/mL sehingga didapatkan mass loading, yaitu 10 μg, 20 μg, dan 30 μg. Perbandingan aktivitas dilakukan menggunakan ekstrak etanolik dengan mass loading 10 μg. Hasil dari penelitian yang sudah didapatkan menunjukkan bahwa baik isolat 1 maupun isolat 2 tidak memiliki aktivitas UV protection karena tidak ada satupun spot pemisahan yang dapat mempertahankan warna kuning dari β-karoten sedangkan, pada spot pemisahan ekstrak etanolik terdapat spot pemisahan yang dapat mempertahankan warna βkaroten yaitu pada Rf 0,14 dan 0,76 untuk pembanding isolat 1 dan Rf 0,13 dan 0,77 untuk pembanding isolat 2.


A

56

B Rf 1

Rf 11

Rf 0

Rf 0

Gambar 12. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection (A= isolat 1 ; B= isolat 2) dari kiri ke kanan adalah ekstrak etanolik mass loading 10μg, isolat mass loading 10, 20, dan 30 μg

Hasil dari penelitian ini dapat memberikan informasi bahwa isolat 1 dan 2 tidak memiliki peran yang bertanggung jawab terhadap adanya aktivitas UV protection pada ekstrak etanolik daun pegagan karena memang yang memiliki aktivitas UV protection pada ekstrak etanolik merupakan senyawa bioaktif dengan Rf 0,14 dan 0,74, sedangkan isolat yang didapat merupakan senyawa dengan Rf 0,34-0,36.


Tabel 8. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Isolat 1 Waktu

Mass loading

Mass loading

Mass loading

10μg

20μg

30μg

Ekstrak 10μg

(menit) BG

Rf

BG

Rf

BG

Rf

BG

Rf

0’

5

-

5

-

5

-

5

-

1’

1

-

1

-

1

-

1

-

3’

1

-

1

-

1

-

1

-

6’

1

-

0

-

0

-

0

-

9’

1

-

0

-

0

-

0

-

12’

0

0,14 (1-)

0

0 -

0 -

-

0,76 (1-) 15’

0

0,14 (1-)

0

0 -

0,76 (1-)

0 -

-

57


58

Tabel 9. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Isolat 2 Waktu

Mass loading

Mass loading

Mass loading

10μg

20μg

30μg

Ekstrak 10μg

(menit) BG

Rf

BG

Rf

BG

Rf

BG

Rf

0’

5

-

5

-

5

-

5

-

1’

1

-

1

-

1

-

1

-

3’

1

-

1

-

1

-

1

-

6’

1

-

0

-

0

-

0

-

9’

1

-

0

-

0

-

0

-

12’

0

0,13 (1-)

0

0 -

0 -

-

0,77 (1-) 15’

0

0,13 (1-)

0

0 -

0 -

-

0,77(1-)

3. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat menggunakan Metode Disc Diffusion

Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode Disc Diffusion merupakan salah metode difusi dengan prinsip kerja meletakkan paperdisc yang mengandung senyawa antibakteri pada permukaan media padat yang sudah diinokulasikan bakteri uji di mana akan terlihat zona hambat berupa zona jernih sebagai parameter positif karena adanya difusi dari senyawa aktif. Secara umum, difusi merupakan perpindahan suatu senyawa dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah, hal inilah yang dimanfaatkan pada metode disc diffusion karena senyawa


59

aktif yang terdapat pada paper disc dapat berdifusi pada media padat sehingga senyawa

aktif

tersebut

dapat

menghambat

pertumbuhan

bakteri

yang

diinokulasikan pada media. Penelitian dilakukan untuk menguji aktivitas antibakteri isolat terhadap bakteri S. aureus. Isolat yang diuji dibuat 3 variasi volume penjenuhan yang berbeda dari konsentrasi 1mg/mL sehingga didapatkan massa 50 μg, 100 μg, dan 200 μg pada paper disc. Metode difusi yang dilakukan ini merupakan metode Kirby Bauwer di mana bakteri diinokulasikan pada media agar padat dengan cara digores hingga merata dengan konsentrasi tertentu, kemudian paper disc yang mengandung antibiotik diletakkan di atas media dan diinkubasi selama 18-24 sebulum pengamatan hasil (Trihendrokesowo,1986).

A

B

C Gambar 13. Uji kualitatif aktivitas antibakteri Isolat 1 terhadap bakteri S. aureus (A : 50μg, B : 100 μg, C : 200μg)


60

Tabel 10. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat 1 terhadap bakteri S. aureus Mass

Diameter

Loading zona hambat

Rata-rata Diameter zona

SD

Diameter zona

(mm)

hambat (mm)

(μg)

(mm)

hambat (mm)

50

-

-

-

-

100

-

-

-

-

200

-

-

-

-

B

A

C

Gambar 14. Uji kualitatif aktivitas antibakteri Isolat 2 terhadap bakteri S. aureus (A : 50μg, B : 100 μg, C : 200μg)


61

Tabel 11. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat 2 terhadap bakteri S. aureus Mass

Diameter

Loading zona hambat

Rata-rata Diameter zona

SD

Diameter zona

(mm)

hambat (mm)

(μg)

(mm)

hambat (mm)

50

-

-

-

-

100

-

-

-

-

5,3

0,58

5,3±0,58

5,0 200

6,0 5,0

Isolat 1 hasil yang ditunjukkan tidak memiliki aktivitas antibakteri karena tidak terlihat adanya zona hambat yang terbentuk di area sekitar paper disc. Berbeda dengan isolat 2, pada isolat 2 dengan massa 200 μg memiliki aktivitas antibakteri yang ditunjukan dengan adanya zona hambat yang terbentuk dengan diameter rata-rata sebesar 5,3 mm. Menurut Davis dan Stout (1971), kriteria kekuatan aktivitas antibakteri yang ditunjukkan dengan adanya zona jernih sebagai parameter positif dapat dibagi menjadi 4 kelompok sebagai berikut : Tabel 12. Klasifikasi kekuatan aktivitas antibakteri Diameter zona hambat

Kekuatan aktivitas antibakteri

≤ 5 mm

Lemah

5 – 10 mm

Sedang

10 – 20 mm

Kuat

≥ 20 mm

Sangat kuat


62

Berdasarkan tabel pengelompokkan di atas, kekuatan isolat 2 sebagai antibakteri memiliki kekuatan sedang yaitu 5,3 mm, walaupun jika dibandingkan dengan kekuatan daya antibakteri amoxicillin yang sangat kuat, tapi dengan seiring peningkatan konsentrasi maka daya antibakteri akan lebih besar. Hasil pengujian antibakteri ini dapat memberikan informasi bahwa isolat 2 yang didapatkan berperan terhadap adanya aktivitas antibakteri pada ekstrak etanolik daun pegagan pada spot pemisahan dengan Rf 0,29-0,34.

A

B

C

Gambar 15. Uji kualitatif aktivitas antibakteri Amoxicillin terhadap bakteri S. aureus (A : 5μg, B : 7,5 μg, C : 10μg)


63

Tabel 13. Uji kualitatif aktivitas antibakteri Amoxicillin terhadap bakteri S. aureus Mass

Diameter zona

Rata-rata

Loading

hambat pada

diameter Zona

(μg)

S.aureus (mm)

hambat (mm)

5

7,5

10

26,0 25,0 26,0 29,0 30,0 30,0 31,0 32,0 33,0

Rata-rata SD

diameter Zona hambat (mm)

25,7

0,58

25,7 ± 0,058

29,7

0,58

29,7 ± 0,058

32,0

1,0

32,0 ± 0,1

4. Uji kualitatif identifikasi senyawa aktif pada ekstrak etanolik dan isolat menggunakan reagen semprot

Adanya senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri pada ekstrak etanolik daun pegagan memerlukan adanya uji identifikasi golongan senyawa aktif supaya dapat mengetahui senyawa apa sajakah yang bertanggung jawab terhadap setiap aktivitas yang ada. Secara visualisasi kasat mata, pemisahan senyawa ekstrak etanolik daun pegagan dapat terlihat pada Rf 0,30 (berwarna hijau); 0,54 (berwarna kuning); 0,75 dan 0,79 (berwarna hijau). Pengamatan identifikasi senyawa dapat dipisahkan dengan KLT selanjutnya diamati di bawah sinar UV 254 nm dan sinar UV 366 nm untuk mengetahui adanya spot pemisahan senyawa lain yang tidak dapat dilihat oleh mata secara visual.


A

B Rf 1 C

D

F

E

G

H

I

Rf 1

Rf 1

Rf 0

Rf 0

J

64

K

Rf 0

L

Rf 1

Rf 0

Gambar 16. Identifikasi golongan senyawa menggunakkan reagen semprot (A: UV 254nm; B: UV 366nm; C: AlCl3; D:AlCl3 254nm; E:AlCl3 366nm; F:Dragendroff; G:Dragendroff 254nm; H:Dragendroff 366nm; I:FeCl3; J:FeCl3 254nm; K:FeCl3 366nm; L:Vanillin-H2SO4)

Pada pengamatan dibawah sinar UV 254 nm tidak muncul spot pemisahan lain spot pemisahan yang dapat terlihat secara visual hanya meredam saja, sedangkan pada pengamatan dibawah sinar UV 366 nm muncul spot pemisahan senyawa lain dengan Rf 0,15 (berpendar hijau); 0,22 (berpendar merah); 0,30 (berpendar merah); 0,54 (berpendar hijau); 0,75 (berpendar hijau tertutup merah); 0,79 (berpendar merah). Rf 0,79 diprediksi merupakan senyawa


65

pigmen warna daun yaitu klorofil yang dapat mengganggu senyawa aktif lainnya karena tertutupi oleh kehadiran senyawa korofil. Identifikasi golongan senyawa pada ekstrak etanolik dilakukan menggunakan reagen semprot pada pelat KLT yang sudah terbentuk spot pemisahan senyawa bioaktif. Reagen yang digunakan adalah sebagai berikut. 1. FeCl3 Reagen FeCl3 digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa golongan fenolik dengan reaksi positif berupa warna biru keunguan. Adanya perubahan warna ini disebabkan adanya reaksi yang terjadi antara Fe 3+ dengan gugus –OH yang terdapat pada gugus fenol sehingga dapat membentuk suatu ikatan kompleks warna karena terbentuk gugus kromofor. Hasil uji identifikasi dari pemisahan ekstrak etanolik menunjukkan bahwa tidak adanya kandungan senyawa fenolik karena tidak ada perubahan warna menjadi biru-keunguan. Analisis identifikasi golongan senyawa menggunkan regen semprot juga dilakukan pada isolat yang diperoleh. Hasil pengamatan menunjukkan tidak adanya perubahan warna biru pada spot pemisahan, setelah disemprot dengan regen FeCl3. Hal ini menunjukkan bahwa kedua isolat bukan merupakan golongan senyawa fenolik. 2. AlCl3 Regen AlCl3 digunakan dalam identifikasi senyawa golongan flavonoid dengan hasil positif berupa adanya pendaran warna kuning pada saat dibawah sinar UV (Merck, 1976). Pemisahan senyawa ekstrak etanolik pada pelat KLT


66

yang sudah disemprot menggunakan reagen AlCl 3 tidak menunjukkan adanya perubahan warna di bawah sinar UV, dengan demikian ekstrak etanolik daun pegagan tidak mengandung senyawa flavonoid. Hal yang sama juga ditunjukkan pada analisis indentifikasi senyawa aktif pada kedua isolat yang diperoleh. Isolat yang sudah disemprot menggunakan reagen AlCl3 tidak menunjukkan perubahan warna kuning saat dibawah sinar UV, dengan demikian kedua isolat yang didapat tidak menunjukkan senyawa golongan flavonoid. 3. Dragendroff Reagen Dragendroff digunakan sebagai pereaksi semprot dalam identifikasi golongan senyawa aktif untuk mendeteksi adanya golongan senyawa alkaloid dan senyawa yang memiliki gugus nitrogen. Hasil positif yang menandakan adanya golongan senyawa alkaloid atau senyawa bergugus nitrogen adalah terbentuknya warna orange pada spot pemisahan (Merck, 1976). Hasil pengamatan yang telah dilakukan terhadap pemisahan senyawa ekstrak etanolik yang sudah disemprot menggunakan reagen Dragendorff tidak menunjukkan adanya perubahan warna orange yang muncul, dengan demikian dalam ekstrak etanolik tidak mengandung senyawa aktif golongan alkaloid maupun senyawa yang memiliki gugus nitrogen. Analisis identifikasi senyawa golongan alkaloid menggunakan reagen semprot Dragendrorff juga dilakukan terhadap isolat yang didapat. Kedua isolat yang didapat pun menunjukkan hal yang negatif terhadap reagen


67

Dragendorff sehingga dapat dipastikan bahwa senyawa isolat bukan merupakan senyawa golongan alkaloid maupun senyawa dengan gugus nitrogen. 4. Vanillin asam sulfat Menurut Merck (1976),

Analisis identifikasi golongan senyawa

terpenoid dapat dilakukan menggunakan reagen semprot Vanilllin-asam sulfat dengan hasil positif berwarna ungu setelah beberapa saat dipanaskan menggunakan oven pada suhu 100℃. Pemisahan senyawa ekstrak etanolik menunjukkan adanya senyawa golongan terpenoid karena adanya warna ungu yang terbentuk pada Rf 0,15; 0,22; 0,30; 0,54; 0,75; 0,79. Hasil yang ditunjukkan ini dapat memberikan informasi bahwa kandungan senyawa aktif pada ekstrak etanolik daun pegagan didominasi oleh golongan senyawa terpenoid. Isolat yang diperoleh juga dianalisis identifikasi golongan senyawa menggunakan reagen vanillin-asam sulfat yang dipanaskan. Hasil dari pengamatan menunjukkan bahwa senyawa yang terisolasi merupakan senyawa terpenoid dengan hasil positif terbentuk warna ungu pada spot pemisahan dengan Rf 0,31 dan spot pemisahan pada Rf 0,80 muncul pada saat disemprot menggunakan reagan semprot Vanillin-asam sulfat setelah penambahan volume penotolan yang mengidentifikasikan bahwa kedua isolat yang didapat merupakan golongan senyawa terpenoid. 5. Sitroborat Identifikasi golongan senyawa aktif juga menggunakan reagen semprot sitroborat untuk mendeteksi adanya senyawa flavonoid. Hasil positif pada


68

reagenn ini adalah adanya perubahan warna flouresensi hijau kuning pada lempeng KLT yang divisualisasikan pada lampu UV 366nm (Alam, Massi, Kurnia, Rahim, dan Usmar, 2012). Hasil identifikasi golongan senyawa pada ekstrak etanolik menunjukkan tidak adanya perubahan warna yang terjadi sehingga dapat menunjukkan bahwa komponen senyawa aktif dalam ekstrak etanolik tidak mengandung golongan senyawa flavonoid. Hasil uji kualitatif identifikasi golongan senyawa ini dapat menunjukkan bahwa isolat yang didapat belum murni sempurna dan adanya kesamaan hasil dari kedua isolat memungkinkan bahwa kedua isolat merupakan isolat yang sama.

B

Rf 1

C

Rf 1

Rf 0

A

D

E Rf 1

Rf 1

Rf 0

Rf 0

Rf 0

F Gambar 17. Identifikasi golongan senyawa isolat 1 menggunakan reagen semprot (A: AlCl3; B: AlCl3 366nm; C: Dragendroff; D: H2SO4-MeOH 5%; E: FeCl3; F: Vanillin-H2SO4)


Rf 1

Rf 1 Rf 1

E \

69

F Rf 1

Rf 0 Rf 0

A

B

C

Rf 0

D

Rf 0

Rf 0

Gambar 18. Identifikasi golongan senyawa isolat 2 menggunakan reagen semprot (A: AlCl3; B: AlCl3 366nm; C: Dragendroff; D: H2SO4-MeOH 5%; E: FeCl3; F: Vanillin-H2SO4)


Tabel 14. Identifikasi Golongan Senyawa Isolat 1 dan isolat 2 menggunakan Reagen Semprot dan Aktivitasnya Reagen (Rf)

Isolat

Aktivitas

H2SO4MeOH 5%

+

VanillinH2SO4 +

FeCl3

AlCl3 366nm

0,32

-

-

Drage ndroff -

0,80

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Antibakteri

Golongan Senyawa

-

Terpenoid

+

UV Protection -

+

+

-

-

Terpenoid

+

+

+

-

+

Terpenoid

-

+

+

-

-

Terpenoid

DPPH

1

0,31Isolat

0,40

2 0,80

Keterangan : - (tidak ada) +(ada)

70


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, ekstrak etanolik daun pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri. 2. Isolat yang didapat dan berperan aktif terhadap aktivitas yang ada merupakan golongan senyawa terpenoid.

B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melakukan uji kuantifikasi tiap aktivitas dan karakterisasi senyawa aktif hingga elusidasi struktur untuk mengetahui senyawa aktif dengan spesifik dan memperbanyak sample bahan uji sehingga pada saat mengisolasi senyawa aktif rendemen yang didapat akan lebih besar.

71


72

DAFTAR PUSTAKA Alam, G., Massi, N., Kurnia, F., Rahim, A., dan Usmar, 2012, Skrining Komponen Kimia dan Uji Aktivitas Mukolitik Ekstrak Rimpang Bangle (Zingeber purpureum Roxb.) Terhadap Mukosa Usus Sapi Secara In Vitro, Majalah Farmasi dan Farmakologi, 16 (3), 123-127. Biradar, R.S. dan Raachetti, B.D., 2013, Extraction of Some Secondary Metabolites & Thin Layer Chromatography from Different Parts of Centella asiatica L.(URB), American Journal of Life Sciences, 1 (6), 243-247. Bylka,W., Znajdek-Awiżeń,P., Studzińska-Sroka,E., dan Brzezińska,M., 2013, Centella asiatica in Cosmetology, Postep Derm Alergol, XXX (1), 46-49. Champbell, N.A., Reece, J.B., dan Mitchell, L.G., 2003, BIOLOGY, edisi kelima, jilid kedia, Erlangga, Jakarta, pp. 106-107. Choma, I.M. dan Grzelak, E.M., 2011, Bioautography Detection in Thin-Layer Chromatography, Journal of Chromatography A, 1218, 2684-2691. Davis dan Stout, 1971, Disc Plate Methode of Microbiological Antibiotic Assay, Journal of Microbiology, 22 (4), 666 – 670. Depkes RI, 2009, Farmakope Herbal Indonesia, Edisi I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.112,114. Dewick, P.M., 2002, Medical Natural Products, 2nd edition, John Wiley & Sons, United Kingdom, pp. 149-151. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1996, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, Jilid 1, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 357. Farage,M.A., 2010, Textbook of Aging Skin, Springer, Berlin, pp.43-44. Fonseca,A.P. dan Rafael,N., Determination of Sun Protection Factor by UV-Vis Spectrophotometry, Health Care Current Reviews, 1 (1), 1-4. Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 323,328,353-354,359,366. Heinrich,U., et al., 2002, Supplementation with β-Carotene or a Similar Amount of Mixed Carotenoids Protects Humans from UV-Induced Erythema, The Journal of Nutrition, 98-101. Hermawan, A., Eliyani, H., dan Tyasningsih, W., 2007, Pengaruh Ekstrak Daun Sirih (Piper betle L.) Terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan Metode Difusi Disc, Skripsi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Surabaya, 1-9. James,J.T. dan Dubery.I.A., 2009, Pentacyclic Triterpenoids from the Medicinal Herb, Centella asiatica (L.) Urban, Molecules, 14, 3922-3941. Jawetz, Melnick, Adelberg, Brooks, Butel, dan Ornston, 2005, Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-20, EGC, Jakarta, pp. 211,213,215. Kedzia,B., Kozlowska,T.B., Furnamowa,M., Mikolajczak,P., Kedzia,E.H., dan Kozaryn,I.O., 2007, Studies on the biological properties of extracts from Centella asiatica (L.) Urban herb, Herba Polonica, 53 (1), 34-44. Marston, A., 2011, Thin-layer Chromatography with Biological Detection in Phytochemistry, Journal of chromatography A, 1218 (2011), 2676-2683.


73

Merck, E., 1976, Dyeing Reagent for Thin Layer dan Paper Chromatography, E.Merck,Darmstadt, Germany. Mitsui,T.,1997, New Cosmetics Sciences, Elsevier Science B.V., Amsterdam, pp. 3-4. Molyneux, P., 2004, The Use of the Stable Free Radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26(2) : 211-219. Osterwalder,U., Jung,K., Seifert,M., dan Herrling,T.H., 2009, Importance of UVA Sun Protection : A Comparative Analysis of Different Quality Control Methods, SOFW-Journal, 135, 2-13. Peraturan Menteri Kesehatan RI No. 445/MenKes/PermenKes/1998 Purkayastha, S., Dahiya, P., 2012, Phytochemical Analysis dan Antibacterial Efficacy of Babchi Oil (Psoralea corylifolia) Against Multi-drug Resistant Clinical Isolates, International Conference on Bioscience, pp.64-68. Pusat Informasi Kosmetik Berbahaya di Indonesia, 2013, Beberapa Dampak Kosmetik yang Berbahaya, http://www.kosmetikberbahaya.com/beberapadampak-kosmetik-berbahaya.html, diakses tanggal 11 Februari 2014. Rahman, M., 2013, Antioxidant Activity of Centella asiatica (Linn.) Urban: Impact of Extraction Solvent Polarity, Journal of Pharmacognosy dan Phytochemistry, 1 (6), 27-32. Ratnadita, A., 2012, Hampir Separuh Kasus Penyakit Kulit Karena Produk Kosmetik, http://health.detik.com/read/2012/03/05/110024/1857813/763/hampirseparuh-kasus-penyakit-kulit-karena-produk-kosmetik?l1101755, diakses tanggal : 11 Februari 2014. Sies,H. dan Stahl,W., 2004, Carotenoids dan UV Protection, Photochem. Photobiol. Sci., 3, 749-752. Stevenson, D.E. dan Hurst, R.D., 2007, Polyphenolic Phytochemicals – Just Antioxidants or Much More?, Cellular dan Molecular Life Sciences, 64, 2900-2916. Sudjadi, 1986, Metode Pemisahan, UGM Press, Yogyakarta, hal. 26, 27, 34, 36. Tambayong, J., 2000, Patofisiologi Untuk Keperawatan, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 201-202. Trihendrokesowo, 1986, Dasar-Dasar Pemeriksaan Biologi, Fakultas Kedokteran UGM, Yogyakarta, hal. 7-8. Tjay, T.H., 2007, Obat-Obat Penting, Edisi VI, Elex Media Komputindo, Jakarta, hal. 58-59, 232-234. Tranggono,R.I. dan Latifah,F., 2007, Buku Pegangan Ilmu Pengetahuan Kosmetik, Gramedia, Jakarta, pp. 81-82. United States Departement of Agriculture, Plant Profile for Centella asiatica, http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=CEAS, diakses tanggal 27 Juli 2015. World Health Organization, 1999, WHO Monographs on Selected Medicinal Plant, Volume 1, World Health Organization, Geneva, pp. 77-81.


74

Wu, S., Liang, J., dan Berthod, A., 2013, Comparing Two Models of Gradient Elution in Counter-current Chromatography, Journal of Chromatography A, 1274, 77-81. Youngson, R., 2003, Antioksidan, Arcan, Jakarta, pp.18. Yuliarti,N., 2010, Sehat, Cantik, Bugar Dengan Herbal Dan Obat Tradisional, Dani Publisher, Yogyakarta, pp.2-3. Zaidan, M.R.S., Noor, R.A., Badrul, A,R., Adlin, A., Norazah, A., dan Zakiah, I., 2005, In Vitro Screening of Five Local Medicinal Plants for Antibacterial Activity Using Disc Diffussion method, Tropical Biomedicine, 22 (2), 165170. Zala, S.P., Patel, K.P., Patel, K.S., Parmar, J.P., dan Sen, D.J., 2012, Laboratory Techniques of Purification dan Isolation, International journal of Drug Development Research, 4 (2), 41-55.


LAMPIRAN


76

Lampiran 1. Formula kosmetik tradisional

1. Makser wajah untuk menghaluskan kulit Komposisi :

Kaolin, Zea Mays (Corb) Stracth, Dextrin, Phaseolus radiatus Seed Powder, Glycerin, Honey (Mei), Butylen Glycol, Centella asiatica Extract, Pogostemon cablin (Patchouli) Oil, Allantoin, Phenoxyethanol, Chlorphenesin, Fragrance, Cl 77288


Lampiran 2. Simplisia kering herba Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.)

77


Lampiran 3. Surat keterangan pembelian dan determinasi Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.)

78

tanaman


79


80

Lampiran 4. Perhitungan susut pengeringan serbuk simplisia kering Hasil susut pengeringan serbuk simplisia daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) Waktu Replikasi I Replikasi II  Berat cawan kosong 0’ 47,235 g 47,512 g 30’ 47,233 g 47,510 g 60’ 47,234 g 47,510 g  Berat cawan kosong + serbuk simplisia 0’ 48,234 g 48,510 g 30’ 48,141 g 48,418 g 60’ 48,138 g 48,417 g 90’ 48,136 g 48,416 g Perhitungan Susut Pengeringan Serbuk Simplisia a. Replikasi I 30’ =

1,000− 0,907 𝑔

60’ =

1,000− 0,904 𝑔

90’ =

1,000− 0,902 𝑔

1,000 𝑔 1,000 𝑔 1,000 𝑔

𝑥 100% = 9,3% 𝑥 100% = 9,6% 𝑥 100% = 9,8%

b. Replikasi II 30’ =

1,000− 0,908 𝑔

60’ =

1,000− 0,907 𝑔

90’ =

1,000− 0,906 𝑔

1,000 𝑔 1,000 𝑔 1,000 𝑔

𝑥 100% = 9,2% 𝑥 100% = 9,3% 𝑥 100% = 9,4%

c. Replikasi III 30’ =

1,001− 0,909 𝑔

60’ =

1,001− 0,909 𝑔

90’ =

1,001− 0,909 𝑔

1,000 𝑔 1,000 𝑔 1,000 𝑔

𝑥 100% = 9,19% 𝑥 100% = 9,19% 𝑥 100% = 9,19%

d. Kandungan air 9,8 % + 9,4 % + 9,19 % = 9,49% 3

Replikasi III 47,912 g 47,909 g 47,909 g 48,910 g 48,818 g 48,818 g 48,818 g


Lampiran 5. Perhitungan berat serbuk simplisia untuk ekstraksi

Berat petri kosong Berat petri + serbuk Berat sisa Berat serbuk

I (gram) 61,8802 111,8971 61,8965 50,0006

II (gram) 61,2219 111,2945 61,2493 50,0452

III (gram) 61,1837 111,1873 61,2569 49,9304


V(gram) 61,2493 111,2932 61,2493 50,0439

VI (gram) VII(gram) VIII(gram) 61,8843 61,2495 61,8834 111,9084 111,2576 111,9082 61,8864 61,2529 61,8891 50,0220 50,0047 50,0191


IX(gram) 61,8726 111,8840 61,8904 49,9936

X (gram) 61,2279 111,2344 61,2474 49,9870

XI (gram) XII(gram) 61,2548 61,8858 111,2690 111,9068 61,2549 61,8903 50,0141 50,0165


XIII (g) 61,2427 111,2586 61,2556 50,0030

XIV (g) 61,2426 111,2494 61,2428 50,0066

XV (g) 61,8865 111,8905 61,8865 50,0004

XVI (g) 61,8861 111,8916 61,8864 50,0052


XVII (g) 61,2369 111,2579 61,2428 50,0151

XVIII (g) 61,2370 111,2424 61,2403 50,0021

XIX (g) 61,2399 111,2406 61,2492 49,9914

XX (g) 61,2482 68,1856 61,2496 6,9360

Total penimbangan serbuk simplisia yang diesktraksi

IV (gram) 61,8847 111,9445 61,8957 50,0488

957,0857 g

81


82

Lampiran 6. Perhitungan susut pengeringan ekstrak etanolik daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) Waktu

Replikasi I

Replikasi II

Replikasi III

 Berat cawan kosong 0’

35,109 g

29,621 g

44,758 g

30’

35,104 g

29,612 g

44,747 g

60’

35,104 g

47,613 g

44,749 g

 Berat cawan kosong + ekstrak kental 0’

36,128 g

30,633 g

45,771 g

30’

36,098 g

30,602 g

45,743 g

60’

36,091 g

30,595 g

45,736 g

90’

36,089 g

30,588 g

45,732 g

120’

36,084 g

30,586 g

45,728 g

150’

36,080 g

30,580 g

45,724 g

180’

36,079 g

30,576 g

45,721 g

210’

36,072 g

30,572 g

45,718 g

240’

36,070 g

30,570 g

45,717 g

Perhitungan Susut Pengeringan Ekstrak a. Replikasi I 30’ =

1,023− 0,993 𝑔

60’ =

1,023− 0,986 𝑔

90’ =

1,023− 0,984 𝑔

120’ =

1,023− 0,979 𝑔

150’ =

1,023− 0,975 𝑔

180’ =

1,023− 0,974 𝑔

1,023 𝑔

1,023𝑔

1,023𝑔

1,023𝑔

1,023𝑔

1,023𝑔

𝑥 100% = 2,93% 𝑥 100% = 3,62% 𝑥 100% = 3,81% 𝑥 100% = 4,30% 𝑥 100% = 4,69% 𝑥 100% = 4,79%


210’ =

1,023− 0,967 𝑔

240’ =

1,023− 0,965 𝑔

1,023𝑔

1,023𝑔

𝑥 100% = 5,47% 𝑥 100% = 5,67%

b. Replikasi II 30’ =

1,020− 0,989 𝑔

60’ =

1,020− 0,982 𝑔

90’ =

1,020− 0,975 𝑔

1,020𝑔

1,020𝑔

1,020𝑔

𝑥 100% = 3,04% 𝑥 100% = 3,73% 𝑥 100% = 4,41%

120’ =

1,020− 0,973 𝑔

150’ =

1,020− 0,967 𝑔

180’ =

1,020− 0,963 𝑔

210’ =

1,020− 0,959 𝑔

240’ =

1,020− 0,957 𝑔

1,020𝑔

1,020𝑔

1,020𝑔

1,020𝑔

1,020𝑔

𝑥 100% = 4,61% 𝑥 100% = 5,20% 𝑥 100% = 5,59% 𝑥 100% = 5,98% 𝑥 100% = 6,18%

c. Replikasi III 30’ =

1,022− 0,994 𝑔

60’ =

1,022− 0,987 𝑔

90’ =

1,022− 0,983 𝑔

1,022𝑔

1,022𝑔

1,022𝑔

𝑥 100% = 2,74% 𝑥 100% = 3,42% 𝑥 100% = 3,82%

120’ =

1,022− 0,979 𝑔

150’ =

1,022− 0,975 𝑔

180’ =

1,022− 0,972 𝑔

210’ =

1,022− 0,969 𝑔

240’ =

1,022− 0,968 𝑔

1,022𝑔

1,022𝑔

1,022𝑔

1,022𝑔

1,022𝑔

𝑥 100% = 4,21% 𝑥 100% = 4,60% 𝑥 100% = 4,89% 𝑥 100% = 5,19% 𝑥 100% = 5,28%

d. Kandungan air 5,67 % + 6,18 % + 5,28 % = 5,71% 3

83


Lampiran 7. Sertifikat hasil uji bakteri Staphylococcus aureus ATCC25923

84


Lampiran 8. Sertifikat hasil uji bakteri Eschericia coli ATCC 25922

85


Lampiran 9. Rangkaian alat lampu UV pada pengujian aktivitas UV protection

86


Lampiran 10. Alat pengukur intensitas cahaya lampu UV

87


88

Lampiran 11. Indikator warna untuk pembanding warna pada uji aktivitas UV protection


89

Lampiran 12. Optimasi intensitas cahaya lampu UV t (menit) Ketinggian = 100 cm daritanah Max = 5,97 Lx Min = 5,82 Lx 𝑥 = 5,895 Lx Intensitasrendah

Ketinggian = 50 cm daritanah Max = 15,14 Lx Min = 14,88 Lx 𝑥 = 15,01 Lx Intensitassedang

Ketinggian = 35 cm daritanah Max = 30,96 Lx Min = 30,00 Lx 𝑥 = 30,48 Lx Intensitastinggi

0 1 3 6 9 12 15 0 1 3 6 9 12 15 0 1 3 6 9 12 15

R1 7 5 3 3 2 2 2 6 3 2 2 2 1 1 6 2 1 0 0 0 0

R2 6 3 3 2 2 2 2 6 2 2 1 1 1 1 6 2 1 0 0 0 0

R3 6 3 2 2 2 2 2 6 2 2 2 1 1 1 6 1 1 0 0 0 0

WARNA R4 R5 6 6 3 2 2 3 2 2 2 2 2 1 1 1 6 6 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 6 6 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

𝑥 6,2 3,2 2,6 2,2 2 1,8 1,6 6 2,2 2 1,8 1,2 1 1 6 1,6 1 0 0 0 0

SD 0,45 1,10 0,55 0,45 0 0,45 0,55 0 0,45 0 0,45 0,45 0 0 0 0,55 0 0 0 0 0


90

Lampiran 13. Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanolik daun pegagan terhadap bakteri Eschericia coli metode bioautografi

1

2

3

4

A = kontrol media B = kontrol pertumbuhan bakteri C = kontrol positif amoxicillin D = hasil pengujian metode antibakteri (1=75μg,2=100 μg ,3=150 μg ) E = hasil pengujian metode antibakteri konsentrasi 200 μg


91

Lampiran 14. Hasil pengujian antibakteri ekstrak etanolik daun pegagan terhadap bakteri Staphyloccocus aureus metode bioautografi

A = kontrol media B = kontrol pertumbuhan bakteri S.aureus C = kontrol positif amoxicillin D = hasil pengujian ekstrak etanolik


Lampiran 15. Hasil fraksinasi yang didapat dengan cara triturasi

A = fraksi kloroform:metanol (95:5 v/v) B = fraksi n-heksana C = fraksi kloroform:metanol (9:1 v/v)

92


Lampiran 16. Hasil pemisahan fraksi dengan kromatografi lapis tipis

Keterangan : dari kiri – kanan (ekstrak etanolik, fraksi n-heksana, fraksi kloroform:metanol (95:5 v/v), fraksi kloroform:metanol (9:1 v/v)) A = tampak visual B = UV 254nm C = UV 366 nm

93


Lampiran 17. Proses dan Hasil kromatografi kolom

94


Lampiran 18. Hasil KLT isolat

95


96

Lampiran 19. Hasil pengujian antibakteri isolat 1 terhadap bakteri S. aureus Keterangan : A = kontrol media B = kontrol pertumbuhan bakteri C = kontrol positif Amoxicilin 5μg D = kontrol positif Amoxicillin 7,5 μg E = kontrol positif Amoxicillin 10 μg F = isolat 1 50 μg G = isolat 1 100 μg H = isolat 1 200 μg


97

Lampiran 20. Hasil pengujian antibakteri isolat 2 terhadap bakteri S. aureus

Keterangan : A = kontrol media B = kontrol pertumbuhan bakteri C = kontrol positif Amoxicilin 5μg D = kontrol positif Amoxicillin 7,5 μg E = kontrol positif Amoxicillin 10 μg F = isolat 2 50 μg G = isolat 2 100 μg H = isolat 2 200 μg


Lampiran 21. Hasil pengujian aktivitas UV protection isolat 1

98


Lampiran 22. Hasil pengujian aktivitas UV protection isolat 2

99


Lampiran 23. Hasil uji identifikasi golongan senyawa pada ekstrak etanolik daun pegagan

Reagen

Rf

AlCl3 Vis ual

254 nm

Aktivitas

FeCl3

Dra

366 nm

Golongan

Vanilli

254

366

254

366

gen

nm

nm

nm

nm

drof

H2SO4

sitrob

DP

UV

Antiba

orat

PH

Protection

kteri

n–

Senyawa

0,15

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

+

+

+

Terpenoid

0,22

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

Terpenoid

0,30

+

-

+

-

+

-

-

-

+

-

+

-

+

Terpenoid

0,54

+

+

+

+

-

-

-

-

+

-

+

-

+

Terpenoid

0,75

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

-

Terpenoid

0,79

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

--

-

Terpenoid

Keterangan : - (tidak ada) +(ada)

100


BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, ULTRAVIOLET PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOLIK DAUN PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban.)” ini memiliki nama lengkap Setio Agustin. Penulis lahir di Purwokerto pada tanggal 19 Agustus 1993 sebagai anak kedua dari tiga bersaudara. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK YPPPK Klampok (1998-1999), SD YPPPK Klampok (19992005), SMP Susteran Purwokerto (2005-2008), SMA Bruderan Purwokerto (2008-2011), kemudian tahun 2011 penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis aktif dalam beberapa kegiatan dan organisasi antara lain sebagai koordinator Divisi Pengembangan Pengkaderan Organisasi Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia periode 2013-2014, koordinator seksi acara Seminar Nasional “Young Generation with No More HIV Infections, Discriminations, dan AIDS Related Deaths”, asisten praktikum Kimia Dasar periode 2012-2013, dan asisten praktikum Farmakognosi-Fitokimia periode 2013-2014 dan 2014-2015.

101

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT

Recommend Documents